NaCl脅迫下‘心文41號’核桃的生理響應及耐鹽基因表達

摘要：[目的]旨在研究不同NaCl脅迫條件下‘心文41號’（Juglans cordiformis ‘Xinwen No．41’）核桃幼苗的生理特性及離子轉運、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）級聯信號基因表達的響應差異。[方法]采取盆栽控鹽的方法，選擇長勢一致的‘心文41號’核桃幼苗作為試驗對象，設置100、150、200 mmol．L-13個NaCl濃度進行處理，同時以清水作為對照組（CK）。經過20 d的脅迫處理，對幼苗的表型、光合等指標進行了測定，通過非損傷微測技術（NMT）評估了根系Na+、K+、H+通量。提取葉片和根部的RNA測定MAPK級聯信號傳導和離子轉運相關基因的表達。通過冗余分析（RDA）探究了生理指標與基因表達之間的相關性，旨在揭示心形核桃幼苗對鹽脅迫調節機制的反應特征。[結果]隨著NaCl濃度增加，心形核桃幼苗的根系體積和總生物量顯著減少，葉片出現枯黃和萎蔫現象。光合生理參數（凈光合速率、蒸騰速率和氣孔導度）呈下降趨勢，胞間C02濃度逐漸增加。葉片和根系中超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性，脯氨酸（Pro），丙二醛（MDA）和過氧化氫（Hydrogen peroxide，H2O2）含量均出現不同程度的增加，根系中Na、含量顯著積累，隨鹽濃度增加其外排趨勢明顯，葉片中K、外排和H、內流以維持胞內滲透勢的穩態。耐鹽相關基因質膜Na、／H、逆向轉運體（Salt Overly Sensitive，SOS1）在葉片表達量高于根系，液泡膜Na、／H、逆向轉運體1（NHXl）呈先上調后下調的趨勢，且液泡H+-ATPase c亞基（VHA-C1）在根系中顯著上調。在100 mmol·L-1NaCl濃度脅迫下，WRKY65（WRKY transcription factor 65）、MKK9（Mitogen-activated protein kinase kinase 9）和MPK3（Mitogen-activated protein kinase 3）基因的表達呈上升趨勢，且葉片中的表達量顯著高于根系。[結論]NaCl脅迫條件下，心形核桃根系受脅迫影響大于葉片，JrSOS1、JrNHX1、JrNHX2與抗鹽能力密切相關，是作為抵御鹽脅迫的關鍵基因。

關鍵詞：心形核桃；NaCl脅迫；基因表達；非損傷微測技術；冗余分析

中圖分類號：S722;S727.32 文獻標識碼：A 文章編號：1001-1498（2024）05-0105-11

土壤鹽漬化作為重要的非生物因素，影響了全球近20%的耕地和1/3的灌溉地區。我國鹽漬土主要集中于西北的干旱和半干旱地區、華北和東部沿海地區，嚴重制約著農林業生產、經營和可持續發展。NaCl脅迫初期通過滲透調節抑制植物生長，隨后導致離子失衡和氧化壓力加劇，從而抑制植物的生長發育。

為應對NaCl脅迫，植物進化出一系列適應機制，包括離子轉運調節、滲透調節和抗氧化系統的調節。通常耐鹽品種的根中Na+濃度較低，K+高于鹽敏品種，且大量元素在葉和莖積累，證明耐鹽品種有更強的離子傳輸能力。Na+（K+）／H+逆向轉運體分別是定位在質膜和液泡膜的跨膜蛋白，其中質膜定位的Na+／H+逆向轉運體鹽過度敏感蛋白（SOSl）屬于NHX型Na+（K+）／H+交換家族；NHXs作為液泡膜中Na+/H+逆向轉運體，將過量的Na、從細胞質轉移到液泡中貯存；VHA-c作為V-ATPase亞基與NHX2異位共表達可促進K+的吸收，在棉花（Gossypium hirsutum L．）、香蕉（Musa nana L）中均發現SOS1、NHX1基因在鹽脅迫下顯著表達，有助于維持離子穩態的內部機制；向日葵（Helianthus annuus.L）中NHX2與VHA-c1基因在鹽脅迫下異位共表達可促進水稻（Oryza sativa.L）的生長。此外，通過積累Pro和可溶性蛋白（Soluble protein，sp）等物質能夠調節NaCl脅迫的滲透失衡。植物防御系統的關鍵酶APX、POD、SOD作為線粒體和葉綠體的主要產物，能減輕ROS產生導致的氧化應激。MAPK級聯途徑在植物逆境響應的調控方面發揮關鍵作用，H2O2可作為信號分子觸發級聯反應，提高了抗氧化酶的活性。MAPK接收MAPKK磷酸化傳遞的信號，進入細胞核與TFs相互作用可調控下游基因的表達，直接或間接調控WRKY轉錄因子，顯著增強了抗逆性并減輕氧化脅迫。在擬南芥（Arabidopsis thaliana.L）中發現鹽脅迫下MPK3和MKK9基因上調在鹽脅迫響應中發揮作用；煙草（Nicotiana．L）中WRKY65基因過表達增強耐鹽性。冗余分析可用來探究生理參數與基因之間的相關性，從而對植株耐鹽性的主要調控基因進行預測，在桉樹（Eucalyptusspp.）中應用了這一方法。

核桃是重要的堅果和木本糧油樹種，是我國戰略經濟林種，在山區農民扶貧中發揮著關鍵作用。但在鹽脅迫導致核桃生理病害，產量下降，經濟損失嚴重。因此，培育抗鹽堿能力強的核桃砧木品種是有效利用和改良鹽堿地資源的主要手段。心形核桃（Juglans cordiformis Max.）屬于胡桃科（Juglandaceae）胡桃屬（Juglans），于20世紀30年代引入我國，作為抗性砧木具有廣泛的應用前景。然而目前研究多集中于核桃的抗旱和抗寒機制，對耐鹽機制研究較少，且心形核桃的研究未見報道。為改善中國核桃砧木單一的現狀，本實驗選取心形核桃后代‘心文41號’（Juglans cordiformis‘Xinwen No.41’）作為試驗材料，通過盆栽控鹽的方法探究幼苗響應NaCl脅迫的生理機制，并結合耐鹽基因的表達分析，旨在為篩選核桃耐鹽砧木提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料與鹽處理

‘心文41號’核桃選自遼寧特色經濟林育種國家長期科研基地。2022年4月中旬，經過3個月層積催芽處理的種子播種在含有泥炭土：蛭石：珍珠巖混合物（v：v：v=3：1：1）的花盆中（直徑18 cm，高25 cm）。待幼苗長至45 d時，即平均株高達30 cm、平均地徑4.7 mm、平均復葉4對時，選擇長勢一致的幼苗分為4個NaCl濃度梯度0（CK）、100、150、200 mmol·L-1進行處理，每個處理3組，每組6株。鹽溶液分3次添加：6月19日、6月21日和6月25日，每次澆300 mL，總計900 mL。在每個盆的底部放置一個托盤，將流出的溶液倒回盆中以保證鹽分固定。在處理后第20 d，采集植株中上部復葉第2對功能葉，進行葉片形態指標、生理指標和熒光定量的測定，采集6條一級側根進行除相對含水量和光合參數外的指標測定，并于-80℃冰箱中保存。

1.2 形態指標的測定

總生物量（W總）的測定：采集植株的根系和葉片洗凈，于105℃殺青15 min，80℃烘干至質量恒定，分別測定地上部干質量（Stem dryweight，WS）和地下部干質量（Root dry weight，WR）及根冠比（Root/Stem，R/S）；采用排水法測定根系體積（Root volume，VR）；最長側根長（Longest lateral root length，LLR）：在平整桌面放置托盤，倒入少量水保持淺水層，將根在水中拉直，記錄最長側根的長度。

W總＝WR+WS；根冠比（R/S）=WR/WS

1.3 生理指標的測定

相對含水量（Leaf Relative water content，LRWC）使用飽和稱重法測定；使用高分辨冷場發射掃描電鏡（Regulus 8230，日本日立）參考楊國一的方法掃描葉片內表皮氣孔，用ImageJ測量氣孔長（SL） /μm、寬（SW）／μm、氣孔孔徑（SW/SL）。

采用硫代巴比妥酸顯色法測定MDA；用索萊寶試劑盒（BC3595）測定H2O2含量；Pro含量測定參考酸性茚三酮比色法；采用氮藍四唑比色法（NBT法）測定SOD活性；采用愈創木酚法測定POD活性；APX活性測定參考的方法，使用火焰分光光度計法測定葉片和根系中K+、Na+的含量。

使用Li-6400 XT（Ll-COR，Lincoln，NE）測量凈光合速率（Pn）、氣孔導度（Gs）、蒸騰速率（Tr）和胞間CO2濃度（Ci）。所有測量均在晴天上午進行（9：00-11：30）。

1.4 NMT測定根系中Na+、K+和H+流速

使用非損傷微測技術（NMT）檢測（BIO-OO1A3，美國揚格科技公司）根尖部位的Na+、K+和H+流速，具體檢測參考Chen的方法，將幼苗的根系用蒸餾水清洗3次，每個根固定在小培養皿中間，在含有0.1 mmol·L-1 NaCl，0.5 mmol·L-1KCl， 0.2 mmol·L-1 CaC12和0.1 mmol·L-1 MgCl2，pH 5.7的測試液中平衡30 min，將電極靠近根表，測定距根尖500 μm的分生區流速變化，并記錄5 min內離子的穩定流速。

1.5 內參基因篩選和實時逆轉錄聚合酶鏈反應分析

本研究使用的參考基因組版本為Juglans_regia．xhhuanglab_v1 .O.genome.fa，共篩選出8個基因，其中4個與離子轉運體相關的基因JrSOS1、JrNHX1、JrNHX2、JrVHA-c1，4個與MAPK級聯信號相關的基因JrWRKY48、JrWRKY65、JrMKK9、JrMPK3，探究其在根系和葉片中的表達情況。使用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（天源生物科技（北京）有限公司）提取RNA，用TaKaRa（RR037Q）試劑盒反轉錄成cDNA。使用Primer3.0 Plus軟件為單個基因設計特異引物，以JrGADPH為內參基因，計算每個基因的相對表達量。轉錄本的定量采用2-△△Cr法，每個處理4次重復，引物見表1。

1.6 數據分析

使用Graphpad Prism 8.0和Excel 2019繪制表格和數據。使用IBM SPSS Statistics 26軟件對生理指標進行顯著性分析，統計分析前對數據進行方差齊性檢驗，對不滿足的數據進行轉換以滿足方差齊性的標準，p＜0.05被認為是顯著，圖片編輯使用Adobe Photoshop2023軟件，使用Canoc05軟件進行RDA圖的繪制。

2 結果

2.1 NaCl脅迫對心形核桃幼苗形態及生長指標的觀察和測定

在100 mmol·L-1鹽處理時幼苗下部葉片表現出黃化和邊緣焦枯，當NaCl濃度為150 mmol·L-1時，其葉片黃化卷曲程度進一步加深，200 mmol·L-1時有持續的脫落現象（圖1），說明不同NaCl濃度持續誘導了幼苗脅迫損傷，且隨著濃度的增加，其癥狀更為明顯。

隨著鹽濃度增加，幼苗的R/S呈下降的趨勢，與CK相比，150 mmol·L-1和200 mmol·L-1處理與CK相比降低了1.54%和10.77%。當鹽濃度達到200 mmol·L-1時，與CK相比，其R/S、LRWC、/LR、VR、W總總分別降低了10.77%、19.72%、31 .06%、50.80%、71 .54%（表2）。

2.2 NaCl脅迫對心形核桃幼苗光合作用的影響

幼苗的氣孔整體呈現松散不規則排列，隨著脅迫濃度的增加，其表面氣孔結構的破壞更嚴重（圖2A）。對氣孔形態定量分析，與CK相比，200 mmol·L-1時氣孔長（SL）上升了20.96%，而氣孔寬（SW）顯著下降了19.15%（圖2B、C）。當NaCl濃度大于100 mmol·L-1，氣孔孔徑（SW/SL）顯著下降，200 mmol·L-1時與CK相比降低了31 .33%（圖2D）。

隨著NaCl脅迫加劇，幼苗的Pn，Tr，Gs均呈下降的趨勢，在150 mmol·L-1鹽處理下與CK相比分別下降了50.89%、44.26%、50.00%（圖2E～G），而C；持續升高，200 mmol·L-1時較CK增加70.0%，差異顯著（圖2H）。與CK相比，鹽濃度顯著抑制了SPAD值，經100、150、200 mmol·L-1鹽處理的SPAD值分別下降了23.35%、46.88%、62.62%（圖21）。

2.3 NaCl脅迫對心形核桃幼苗滲透調節物、脂質過氧化產物及抗氧化酶的影響

葉片Pro含量在100 mmol·L-1鹽處理時達到峰值，與CK相比增加了76.17%；根中Pro含量在200 mmol·L-1時與CK相比增加了129.92%．差異顯著（圖3A）。200 mmol·L-1鹽處理時葉片中MDA含量達到最大值，與CK相比增加了37.27%；100 mmol·L-1處理時根中MDA含量達到最大值，與CK相比增加了51 .43%（圖3B）；葉片中的H202含量在鹽濃度200 mmol·L-1時與CK相比增加了72.02%；在根中則隨鹽濃度增加顯著上升，100、150、200 mmol·L-1時增加了65.56%、93.8g%、138.86%（圖3C）。葉片中SOD活性在150 mmol·L-1時到達最大值，與CK相比增加了62.44%；而根中SOD活性在100、150、200 mmol·L-1鹽處理時較CK相比增加了23.05%、35.80%、39.51%（圖3D）；POD活性和APX活性在根中積累量均低于葉片（圖3E、F）。

2.4 NaCl脅迫對心形核桃幼苗根系Na+、K+、H+流速的影響

NaCl脅迫時Na、流向表現為外排，在100mmol·L-1鹽處理時Na、凈流量介于35.61～624.33nmol·m-2·s-1，隨鹽濃度增加，其凈流量呈上升趨勢（圖4A）。在200 mmol·L-1 NaCl脅迫時Na+平均凈流量達到1 007.98 nmol·m-2·s-1，較CK顯著增加了3 140.05%（圖4B）。K+流向表現為外排趨勢，隨鹽濃度增加，K+凈流量的上升趨勢低于Na+。在200 mmol·L-1時其凈流量達到最大，介于577.3～989.5 nmol·m-2·s-1（圖4C）；100、150、200 mmol·L-1鹽處理時K+平均凈流量較CK相比分別增加了228.62%、457.25%、685.87%（圖4D）。

隨著鹽濃度增加，H+內流趨勢更加明顯。200 mmol·L-1時凈流量達到最大，介于-9.62～-7.19 nmol·m-2·s-1（圖4E），150、200 mmol·L-1時與CK相比分別增加了925.58%、1 532.25%（圖4F）。

2.5 NaCl脅迫對心形核桃幼苗根系和葉片中Na+，K+含量及分布的影響

隨著鹽濃度增加，Na+含量在根系中顯著增加，100、150、200 mmol·L-1時與CK相比分別增加了163.7g%、243.74%、475.70%；在葉片中呈先升高后下降的趨勢，150 mmol·L-1時達到峰值，較CK增加了345.80%（圖5A）。葉片中的K、含量顯著高于根系，葉片中K+含量在150 mmol·L-1時達到最大值，與CK相比增加了43.67%。而根系的K+含量變化幅度較小，100、150、200 mmol·L-1處理時與CK相比分別降低了4.46%，1.50%．3.00%（圖5B）。此外，NaCl脅迫下根系和葉片中K+/Na、比值顯著降低，葉片中100、150、200 mmol·L-1鹽處理時相較CK下降了55.89%、64.85%、53.41%，根系較CK分別降低了63.89%、75.08%、83.10%（圖5C）。綜上所述，根系中Na+積累量高于葉片，而K．和K+/Na+低于葉片。

2.6 NaCl脅迫下心形核桃幼苗生理指標的相關性

結果發現，葉片SW/SL與Gs、Tr呈顯著正相關；SPAD與POD呈顯著負相關；Pn與SOD、POD、APX活性、MDA呈負相關；K+/Na+與Na+含量、POD活性、Ci呈負相關（圖6A）。根中生理指標的相關性得出，LLR、VR與Pro、MDA、H2O2含量呈顯著負相關；Na+平均速率與K+平均速率呈顯著正相關，H+平均速率與POD活性呈顯著負相關（圖6B）。

2.7 NaCl脅迫對心形核桃幼苗離子轉運及MAPK級聯信號相關基因表達模式

結果發現，JrSOS1基因在葉片中表達量隨鹽濃度增加呈先升后降的趨勢，100 mmol·L-1處理時達到峰值，與CK相比增加了39.17%；根系中150mmol·L-1時表達量最高，較CK增加了170.76%（圖7A）。Jr～HX1基因在根系中100 mmol·L-1鹽處理時差異顯著，與CK相比增加了499.30%（圖7B）。JrNHX2基因在100 mmol·L-1時葉片和根系中表達量均顯著增加，與CK相比分別增加了470.40%，70.19%（圖7C）。JrVHA-c1在報系中受到顯著誘導，100、150、200 mmol·L-1時較CK增加了465.83%，442.86%，131.87%（圖7D）。

根系中JrWRKY48基因在150 mmol·L-1時達到顯著水平，與CK相比增加了59.06%：葉片中表達量隨鹽濃度增加呈上升趨勢，200 mmol·L-1處理時較CK增加了101.13%（圖7E）。JrWRKY65基因在葉片中100 mmol·L-1時受到顯著誘導，與CK相比增加了78.24%；根中在150 mmol·L-1時表達量最高，較CK增加了174.42%（圖7F）；葉片中JrMKK9基因在150 mmol·L-1處理時達到峰值，與CK相比增加了317.60%（圖7G）；JrMPK3基因在200 mmol·L-1時表達量最大，較CK增加1478.32%（圖7H）。

2.8 MAPK信號級聯及離子轉運調控基因與生理指標的冗余分析

利用冗余分析（RDA）探究基因與生理指標的關系，發現葉片中K+/Na+和JrVHA-c1基因顯著正相關，基因JrSOS1與SW/SL、Pn、Tr顯著正相關（圖8A）;繇中JrSOS1、JrMKK9和JrWRKY48基因是影響Na+和K+平均流速的主要基因（圖8B），且與H+平均流速、VR、R/S高度負相關。此外，JrVHA-c1和JrMPK3基因分別通過調控葉片的Gs和抗氧化系統來提高耐鹽性（圖8A），而JrWRKY65和JrMKK9基因調控根系的MDA和H2O2含量提高耐鹽性，以上基因分別在葉片和根中的RDA1軸有最長的投影長度。

3 討論

植物受到鹽脅迫時會造成植物失水，生物量可以直接反映植物受鹽脅迫的損傷程度，可作為鹽脅迫特征的可靠指標。本研究發現，隨著NaCl濃度增加，W總、LLR、 VR均顯著降低，表明鹽脅迫造成植株根系吸收水分受阻，抑制了根系的生長發育。高鹽脅迫顯著降低了東部黑核桃（JuglansNigraL.）、接骨木（Sambucus canadensisL.的LRWC，而在本實驗中，100 mmol·L-1處理下核桃幼苗的LRWC呈上升趨勢，隨后下降，植株葉片能承受一定的鹽濃度，增強吸收和儲存水分，然而可溶性鹽分的持續增加減少了對水分和營養物質的吸收，阻礙了植物與水分間的平衡關系。Pn的下降受氣孔和非氣孔因素的影響，低鹽脅迫下的氣孔特性作為Pn值下降的主導因素。本研究中，SW、SW/SL、Gs隨NaCl濃度增加顯著下降，而Ci顯著上升，表明鹽環境下氣孔的關閉減緩了水分的散失，但這一作用影響了CO2吸收和同化的效率，減慢了光合進程從而抑制植株的生長；相關性分析表明，Pn與Tr和Gs呈顯著正相關，可見鹽脅迫下氣孔因素是影響Pn下降的主要原因，在開心果砧木（Pistacia vera L．）中也證實了這一點。

鹽脅迫會導致ROS的大量積累，阻礙電子傳遞導致氧化應激，伴隨膜脂過氧化產物MDA的產生。本研究中，隨NaCl濃度的增加，幼苗根系中積累的MDA含量高于葉片，根系作為直接接觸鹽分的部位，產生過量的ROS使根系細胞膜的通透性增大，而葉片ROS的清除更為及時，在裸果木（Gymnocarpos przewalskii Maxim.）中也表現出類似的趨勢。鹽脅迫下植物體內抗氧化酶活性的高低可反映植物抵御逆境的能力，SOD作為清除ROS的第一道防線，POD和APX共同作為清除ROS的第二道防線將H2O2維持在較低水平。本研究中，隨NaCl濃度的增加葉片中SOD、POD、APX活性均高于根系，葉片進行光合作用等過程雖產生大量ROS，但仍具有較強的抗氧化性能，而根系長期接觸土壤鹽分造成細胞氧化損傷嚴重，這與真紅樹種（True mangrove）的研究結果一致。

植物會啟動多種防御反應如將Na+從根中排出，以及Na+區隔化于液泡中等多個策略。本研究中，根系積累的Na+含量顯著高于葉片，表明幼苗的根系對Na+有一定的屏障作用，可以減少對地上部分的損害，保證葉片進行正常的生理活動和養分吸收，這與胡楊（Populus euphratica Oliv.）的研究結果一致。K+在維持陰陽離子的平衡之間起關鍵作用。本研究發現，葉片中K+含量隨NaCl濃度增加呈先上升后下降的趨勢，而根系中K+外排速率增加，低鹽濃度幼苗根系仍具有較強的轉運K+的能力；而隨著NaCl濃度的增加，幼苗轉運K．能力減慢，這與白柳（Salix a/ba L．）中的研究結果一致。SOS1能將過量的Na+排出細胞，NHXs能將過量的Na+逆濃度梯度運至液泡中，以維持細胞內的離子穩態。本研究發現，鹽脅迫下葉片中JrSOS1基因的表達量顯著增加且高于根系，表明JrSOS1基因將葉片細胞質膜中過量的Na+區隔化，減輕離子毒害。JrNHX1和JrNHX2基因在根系中顯著上調，表明NHXs基因主要在根系中發揮作用，將過量的Na+泵入到液泡中，誘發了外向型K+通道，引起K+外排，這與JIANG XY等人的研究結果一致。NaCI脅迫下JrWRKY65基因在葉片中高度表達，同時與葉片Pro含量和JrSOS1基因高度相關，這表明JrWRKY65基因可能通過滲透調節以及維持Na+、H+穩態提高葉片的耐鹽性，在酸棗中WRKY65基因也發揮相似的功能。

4 結論

本研究以‘心文41號’核桃作為試驗材料，對NaCl脅迫條件下不同組織部位的生理變化及耐鹽基因的表達進行分析。結果表明，鹽脅迫抑制了氣孔開度以及光合生理參數，從而減慢了光合進程，同時顯著抑制了根系的生長。這一過程加劇了氧化應激，使細胞膜透性增大，產生過量的MDA和H2O2等過氧化產物。而葉片相較根系具有較強的抗氧化性能以維持ROS的清除過程。結合鹽脅迫后不同組織部位中調控離子轉運體及MAPK級聯信號相關基因的表達情況，發現根系主要通過介導液泡NHXs基因上調促進Na+的外排和H+的內流，而葉片主要通過介導質膜SOS1基因促進Na+外排，同時保證K+的吸收來提高幼苗的耐鹽性。這一結果為心形核桃NaCl脅迫調控機制解析和耐NaCl核桃砧木的篩選提供參考。

（責任編輯：張研）

基金項目：國家重點研發計劃課題（2022YFD2200402）國家級