提升頭孢菌素C 發酵效率的復合碳源補料工藝開發及代謝機制

摘要：開發了一種以葡萄糖和豆油為底物碳源的復合補料策略，能夠顯著提升頭孢菌素C（CPC）的合成效率，使其產量提升了14.8%，并觀測到碳源變化在宏觀呼吸代謝、中間代謝物、細胞內通量分配和還原力NADPH 利用方面產生了全局影響， 其中二氧化碳釋放速率（CER）的變化表明在葡萄糖和豆油復合補料策略下細胞中心代謝網絡的通量發生了明顯改變，碳流向CPC 的通量得到增強，同時促進了蛋氨酸和絲氨酸的胞外吸收。胞內有機酸α-酮戊二酸、丙酮酸、蘋果酸的濃度明顯提升，有利于谷氨酸、纈氨酸和半胱氨酸等核心氨基酸的合成，從而有利于CPC 生產。主成分分析（PCA）的載荷測定結果表明大多數氨基酸和CPC 合成呈正相關，谷氨酸的胞內含量與CPC 合成的關聯性最強，而α-氨基己二酸和賴氨酸積累反而不利于CPC 合成。細胞還原力方面，豆油和葡萄糖組合工藝有助于NADPH 更多地用于CPC 合成，使得CPC 快速合成時對NADPH 的大量需求得到了滿足。這些結果表明改變底物能夠對細胞內部的代謝產生全方位的影響，復合補料策略在優化CPC 合成中具有巨大潛力。

關鍵詞：頭孢菌素C；碳源；呼吸代謝；代謝通量分析；主成分分析

中圖分類號：Q815 文獻標志碼：A

頭孢菌素類藥物占據抗感染類藥物50% 以上的市場份額，國內市場規模已達400 多億元，因此其前體頭孢菌素C（CPC）的生產研究備受關注。CPC 是由頂頭孢霉菌（Acremonium chrysogenum）發酵生產的次級代謝產物，與一般次級代謝物的合成調控類似，CPC 的發酵水平同樣受到碳代謝調控、氮代謝調控、磷代謝調控等影響[1]，其中碳源效應受到持續關注[2]。通常來講，能夠快速利用的碳源會嚴重抑制次級代謝產物的合成，因此發酵培養基定制策略往往是前期采用快速利用的碳源如葡萄糖、麥芽糖等促進菌體生長，待快速碳源耗竭后，中后期采用慢速利用的碳源如油脂、淀粉等用于刺激次級代謝產物的合成[2]，這個策略在很多次級代謝產品的生產中得到了應用，比如諾卡氏菌（Nocardia lactamdurans）只有在葡萄糖消耗到極低濃度后，依托霉素才啟動合成，而大豆油則促進了依托霉素的生物合成[3]；白色鏈霉菌在豆油作為底物時，產生的抗生素濃度明顯更高[4]；蓖麻油是更適合紅色糖多孢菌產紅霉素的碳源[5]；甘油或植物油能夠刺激克拉維酸的合成[6]；頭霉素C 能以豆油作為唯一碳源進行發酵生產[7]，這些結果表明油脂用于次級代謝產物合成具備普遍性的優勢。

在頂頭孢霉菌中，CPC 合成途徑中的擴環酶基因cefEF 和環化酶基因pcbC 的上游序列存在碳分解代謝調控蛋白Cre1 的結合位點，cefEF 和pcbC 的轉錄水平在葡萄糖培養基中受到阻遏，表達水平顯著下降[2]，而豆油不會阻遏CPC 合成途徑中的基因表達，因此豆油被認為是CPC 合成期間的最佳碳源，并且豆油能夠激活交替呼吸途徑，加快NADH 的周轉速率，提高CPC 合成過程的能量供應，從而更有利于CPC 的高產。然而近期Li 等[8] 通過研究豆油在不同發酵階段的代謝分析，首次發現了CPC 合成期間僅僅采用豆油會導致NADPH 和ATP 利用的不經濟性，可能影響CPC 的發酵水平進一步提升，表明該策略存在優化空間。

本文以頂頭孢霉菌為研究對象，首次成功開發了更適用于CPC 發酵合成過程的葡萄糖和豆油復合底物補料新策略，顯著提升了CPC 的合成速率，與僅采用豆油補料相比，CPC 發酵水平提升了14.8%。底物對次級代謝物合成的調控是個古老但未充分理解的課題[9]，本文從宏觀代謝研究、代謝物水平、代謝流、還原力和能量水平進行了系統解析，這也對其他次級代謝產物發酵過程中的碳代謝調控具有重要的啟示意義。