蚯蚓活動下礦物對凋落物分解及腐殖化的影響

摘要：凋落物分解是植物向土壤輸入有機碳的主要途徑，蚯蚓和礦物的存在會改變凋落物的分解及其腐殖化。為探究培養后蚯蚓和礦物對玉米秸稈的有機元素組成、溶解性有機碳含量以及腐殖化程度的變化，本研究以玉米秸稈（cs0）為原料，分別通過添加蒙脫石和赤鐵礦（原料：礦物=7：3，m：m），在蚯蚓活動下進行135d培養，標記為：玉米秸稈（CS）、玉米秸稈+蒙脫石（CSM）、玉米秸稈+赤鐵礦（CSF）、玉米秸稈+蚯蚓（CSE）、玉米秸稈+蒙脫石+蚯蚓（CSME）、玉米秸稈+赤鐵礦+蚯蚓（CSFE）。研究結果表明，分解后各處理組碳含量均有所減少。其中，與CS相比，CSM和CSF的碳含量平均減少46.01%，表明礦物加快了凋落物的分解。蚯蚓活動沒有顯著改變礦物對凋落物的分解。同時，凋落物培養后碳同位素比值（δ11C）降低，表明12C較13C相對富集保留，尤其礦物添加下更為明顯。但蚯蚓活動減弱13C的損失，在CSME中最明顯。這表明礦物和蚯蚓會影響凋落物不同組分的優先分解。從溶解性有機質（DOM）的組成和性質可知，培養后與cs相比，CSM和CSF的DOM的腐殖化指數（HIX）和生物指數（BIX）增大，表明礦物提高凋落物的腐殖化程度和生物可利用性。在蚯蚓活動下凋落物的腐殖化會進一步增強。此外，蚯蚓和礦物存在下其SUVA254、SUVA260和SUVA280增大，表明礦物／蚯蚓提高了其芳香化、疏水性和分子量，尤其是CSME最為顯著。因此，蒙脫石和蚯蚓的添加更能顯著增加DOM的腐殖化程度、疏水性和芳香性，提高土壤有機質的穩定。

關鍵詞：蚯蚓；礦物；凋落物分解；穩定碳同位素；溶解性有機質

中圖分類號：S154.5 文獻標志碼：A 文章編號：1672-2043（2024）09-2050-10 doi：10.11654/j aes.2024-0443

土壤是一個重要的碳庫，是大氣碳庫的2倍、植被碳庫的2-3倍，因此增加土壤中碳儲量在解決減緩全球氣候變暖問題中顯得尤為重要。凋落物是土壤有機質（SOM）的重要來源之一，有關凋落物分解的研究將為增加土壤碳匯提供重要幫助。目前眾多研究表明，凋落物的分解會受氣候、凋落物類型和凋落物分解者等方面的影響。例如溫度和濕度的提高會加速凋落物的分解。然而近年來越來越多的研究關注到大型動物（通過捕食、掘穴和產糞等活動）和礦物對凋落物分解的影響[礦物成分一方面通過影響微生物活性進而影響凋落物分解，另一方面與凋落物形成穩定的礦物結合態有機碳（MAOC），從而物理保護有機質不被分解，這些過程將直接或間接改變SOM的穩定性。

蚯蚓是土壤中主要的無脊椎動物，廣泛分布在全球各大陸，其能夠通過自身活動如攝食、挖穴等影響凋落物的分解，促進凋落物進入土壤有機質，形成有機無機復合體或土壤團聚體，從而影響土壤碳循環。研究觀察到，凋落物能被蚯蚓實現物理性分解，增加凋落物分解表面積，促進微生物對凋落物的利用。此外，蚯蚓活動（比如蚯蚓體外分泌黏液等）能夠改變微生物群落結構，間接影響其他土壤動物。同時蚯蚓和微生物的代謝處理，對凋落物進行生化分解過程，使凋落物轉化為生物肥料，改善了土壤。值得注意的是，蚯蚓會通過攝食、移動增大礦物與有機質形成有機-礦物復合體或團聚體的幾率進而保護有機碳。此外，不同的礦物對SOM的保護程度和保護模式不盡相同，例如2：1型蒙脫石黏土礦物比1：1型高嶺石更能保護有機碳。同時有研究報道，礦物對有機質（OM）的穩定能力有限，受其表面活性位點的面積密度限制。在此條件下，假設凋落物滲出的DOC在向下轉移的過程中會與土壤礦物結合形成有機無機復合物，導致其生物可降解性降低，甚至能夠在土壤中長期穩定存在。如Vogel等發現凋落物在蒙脫石上的礦化速度小于伊利石上凋落物的礦化速度，鐵氧化物不會對凋落物的降解造成影響。相反，Barthod等研究發現，礦物的作用反而增加了OM，這可能是礦物刺激了胞外酶活性加速了OM的降解。因此，蚯蚓活動和礦物可能會影響凋落物的分解，但目前關于凋落物分解和轉化研究中很少考慮到蚯蚓活動和礦物對凋落物的分解及其轉化的影響。

本實驗選用玉米秸稈凋落物，在礦物上采用赤鐵礦和蒙脫石，兩種礦物廣泛存在于土壤中且參與反應作用明顯。通過同比例復配，在蚯蚓存在下進行培養實驗。本研究旨在探討在蚯蚓活動下，礦物的添加對凋落物分解的影響，識別不同礦物對凋落物分解后有機碳變化和碳同位素分餾的作用。通過分析溶解性有機質（DOM）的三維熒光光譜特征，研究蚯蚓和礦物對凋落物分解后其腐殖化程度的影響。本研究以期為蚯蚓和礦物對凋落物分解和轉化提供理論和實踐依據，并探究在兩種物質添加下，是否會影響腐殖化程度，甚至提高腐殖化能力，從而為農業綠色生產提供方法參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

300目蒙脫石和300目赤鐵礦購置于銅陵啟順礦產廠；大平2號赤子愛勝蚯蚓（表棲）購買于河北省石家莊市蚯蚓養殖場；玉米秸稈取自云南昆明梁家箐村莊；發酵菌劑購買于濮陽益加益生物科技有限公司。

1.2 供試凋落物

選取的凋落物為玉米秸稈凋落物（CS），按照菌劑：葡萄糖：水=1：5： 100（m：m：m）的比例配制發酵液（添加葡萄糖激活EM菌）。玉米秸稈破碎至3-4 cm，把發酵液和發酵原料逐層噴灑均勻，控制發酵原料濕度在50% -60%，用泡沫箱子密封發酵，泡沫箱上部放置溫度計，同時采用曝氣泵向泡沫箱內通入空氣，控制氣體流速在0.5-0.75 L·min-1。發酵至高溫期以后，箱內溫度開始下降，待至室溫則認為發酵完成。發酵后玉米秸稈外觀顏色從初始淺綠色變為偏黃偏黑。溫度在密封完前期為23℃，一周后發酵至高溫期為50-60℃。凋落物發酵完后自然風干，風干后磨碎凋落物并過2 mm篩備用。保留部分發酵后產物作為初始原料（CSO）進行后期數據比較。

1.3 培養實驗

通過實驗室培養箱培養，分析蚯蚓活動下不同礦物對凋落物降解過程中有機質的變化情況。具體操作如下：稱取50 g干質量凋落物或模擬樣品（凋落物：礦物=7：3，m：m）于1L的培養瓶中，使每個培養瓶含水率維持在50%-60%。其中1/2的實驗組添加6條成熟的蚯蚓（每條質量0.2 g），另一組則不添加蚯蚓作為對照組。將實驗分為6個處理組：玉米秸稈凋落物（CS）、玉米秸稈凋落物+蒙脫石（CSM）、玉米秸稈凋落物+赤鐵礦（CSF）、玉米秸稈凋落物+蚯蚓（CSE）、玉米秸稈凋落物+蒙脫石+蚯蚓（CSME）、玉米秸稈凋落物+赤鐵礦+蚯蚓（CSFE）。即CS表示玉米凋落物，E代表添加蚯蚓處理組，M代表蒙脫石添加組，F代表赤鐵礦添加組。培養瓶放在（25±2）℃的培養箱進行暗培養，每個處理下重復3次。培養實驗共持續135 d，樣品于第135天收集并在-20℃條件下保存。在培養期間每周對蚯蚓進行觀察，在第74天時將狀態不好的蚯蚓進行更換。同時對原始礦物進行理化性質測量。赤鐵礦和蒙脫石pH分別為9.29和9.24，元素組成分別為C：0.02%和0.09%，N：0.02%和0.01%，H：0.28%和0.47%，0：0.01%和0.02%。

1.4 樣品采集分析

樣品的元素組分分析，是將冷干后樣品研磨過300目篩，使用元素分析儀專用的錫舟，稱取2.0 mg樣品，采用元素分析儀（Vario EL II Elementar，德國）測定。樣品的同位素分析，將冷干后樣品研磨過300目篩，稱取0.15 mg樣品，采用同位素比質質譜儀（IR-MS）（ElementarlsoPrimel00）測定。

水溶性有機碳（DOC）測定，參照Kumada方法，取2 g過100目篩樣品于50 mL離心管中，加入15 mL去離子水，在搖床振蕩1h后離心10 min，上清液倒人50 mL離心管，以10 mL去離子水洗滌沉淀兩次，洗滌后沉淀保留，上清液合并后用0.45 μm濾膜過濾，此為DOC，用總有機碳分析儀（Elementar，德國）測定其中的碳含量。

1.5 紫外-可見光譜特征分析

用超純水（UP）作為空白，將上述所得DOC濾液在200-600 nm范圍內，以每間1nm進行光譜掃描。本研究選擇特征紫外光吸收系數為SUVA254、SUVA260和SUVA280分別以A254、A260和A280吸光度與DOC濃度的比值表示，分別表征溶解性有機質（DOM）分子的芳香性、疏水性和分子量，計算公式見式（1）。

SUVAλ=A（λ）×100/DOC（1）

式中：A（λ）為在波長λnm處吸光度，DOC以mg·L-1為單位的濃度。

特征紫外光吸收比選擇E2/E3和E4/E5，分別為波長250 nm和365 nm處吸光度之比、波長300 nm和400 nm處吸光度之比。E2/E3用于表征DOM分子大小，E2/E3值與相對分子質量成反比。E4/E5用于表征DOM分子腐殖化程度，E4/E5值與腐殖化程度成反比，E4/E5＜3.5時，以胡敏酸為主，E4/E5＞3.5時，以富里酸為主。

1.6 三維熒光光譜（EEM）特征分析

將上述獲得濾液進行三維熒光光譜（EEM）掃描。激發光譜（Ex）波長范圍為200-500 nm，采集間隔5nm；發射光譜（Em）波長范圍為250-550 nm，采樣間隔2 nm。三維熒光光譜一般將熒光物質所在的熒光光譜分成5個區域，分別為：區域Ⅰ（λEx＜250 nm，λEm＜320 nm），為類酪氨酸物質；區域Ⅱ（λEx＜250nm，320 nm＜λEm＜380 nm），為類色氨酸物質；區域Ⅲ（λEx＜250 nm，λEm＞380 nm），為類富里酸物質；區域Ⅳ（λEx＞250 nm，λEm＜380 nm），為可溶性的微生物副產物；區域Ⅴ（λEx＞250 nm，λEm＞380 nm），為類胡敏酸物質。激發波長370 nm時，在470、520 nm兩處熒光發射強度的比值即熒光指數（FIX）；激發波長為254 nm時，發射波長在435-480 nm范圍與300-345nm范圍的積分值的比值即腐殖化指數（HIX）；激發波長為310 nm時，在380 nm和430 nm兩處的熒光發射強度的比值即生物指數（BIX）。

1.7 數據處理

測得的數據利用efc軟件和Origin 2021軟件進行分析、制圖。并運用SPSS 20對不同數據進行單因素分析，所有數據均以P＜0.05視為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 凋落物分解前后有機碳含量變化

2.1.1 各處理分解前后元素組成的變化

通過比較不同處理下凋落物分解前后元素組成分析可知（表1），凋落物分解后，所有處理組的有機碳（OC）、氫（H）含量均有減少。其中，相對CSO，CS的OC、H含量分別降低了16.39%和22.01%，礦物添加后（按凋落物：礦物質量比7：3混合原始樣品進行了折算），其含量損失降低了30%以上，尤其是赤鐵礦添加下OC、H含量降低量可達38.96%和46.83%。然而，研究發現氮（N）、硫（S）含量在凋落物分解后呈現增加的趨勢。CS的N、S含量相較于CSO均超過了40%，但礦物添加會抑制N、S的增加。此外，蚯蚓活動下凋落物的分解并未觀察到明顯的變化，其元素含量與未添加蚯蚓較為相近。

2.1.2 各處理分解前后穩定碳同位素分餾的變化

由圖2可以看出，凋落物分解后，所有處理組的813C值均減小。礦物的添加促使CS減少2%以上，而且蒙脫石較赤鐵礦對凋落物OM的分餾更為顯著。此外，研究觀察到，蚯蚓活動會增加δ13C值。特別是蒙脫石組，δ13C值從- 19.06‰到- 15.44‰，增加最為明顯。

2.2 凋落物分解前后DOM的變化

2.2.1 各處理分解前后DOC的變化

如圖2所示，經過135 d的分解，不同處理組的凋落物DOC含量總體呈下降趨勢。其中，與CS相比，蒙脫石添加下DOC含量降低24.37%，而赤鐵礦添加下DOC含量增加17.63%。此外，盡管蚯蚓對總有機碳含量影響較小，但蚯蚓活動下相較于無蚯蚓組，DOC含量分別降低了17.78%、30.68%和14.16%。

2.2.2 各處理分解前后三維熒光光譜特征

為了進一步探究不同處理組的DOC組成變化，由圖3可以看出，分解過程中，與CSO相比，培養后腐植酸類物質和富里酸類物質的含量整體均呈上升趨勢，特別是添加蚯蚓后區域Ⅲ和區域Ⅴ熒光峰增加強烈。因此，從本研究可以看出，蚯蚓的作用改變了DOM的組成和結構，從而導致熒光峰的位置和熒光強度的變化。FI值可用來表示DOM來源，各處理組的FI均大于1.4（圖4），表明DOM以微生物來源為主。

HIX值用來表征腐殖化程度。在HIX指數上，各處理組較CSO相比整體呈上升趨勢（圖4），這一結果表明分解過程中可能是非腐殖質類物質發生降解，而腐殖質類物質的相對含量則不斷增加、整體腐殖化和芳構化程度加強。其中與CS相比，CSM提高10.35%，而CSF卻降低19.28%。盡管蚯蚓對凋落物元素組成影響較小，但可以看出，在蚯蚓活動下腐殖化程度更強。值得注意的是CSFE相較于CSE，沒有表現出CSF的HIX值比CS低的趨勢。

BIX用來表征DOM生物可利用性。添加蚯蚓后BIX有所提高（圖4），說明在提升DOM生物可利用性方面，蚯蚓效果最好。因此，在蚯蚓活動和微生物共同作用下，蛋白質、脂肪和碳水化合物等有機物被分解，類胡敏酸類和類富里酸類物質成為DOM的主體部分，剩余有機質趨于穩定，腐熟度增加。

2.3 凋落物分解前后DOM紫外-可見光吸收光譜特征參數

有機質的碳碳雙鍵與SUVA254的值有關，通常有機質的芳香程度越高、腐殖化程度越高，分子質量越大時，SUVA254值越高。通過圖5可知，在135 d的分解后，與CSO相比，各處理的SUVA254均有增加，表明在分解過程中，芳香程度增加。與CS相比，CSM的芳香性最大。而蚯蚓活動下，芳香化程度增加更加明顯。該現象與前面提到的腐殖化程度是相一致的。

此外，SUVA260和SUVA280分別表征DOM分子的疏水性和分子量，該值越大，疏水性和分子量越大。通過圖5可知，與CSO相比，各處理組SUVA260和SU-VA280都有所提高。而在SUVA280中，與CS相比，CSM提高20.63%，CSF卻降低了10.93%。

各處理的吸收值／吸收比變化如圖5所示。相對于CSO，各處理組的E2/E3均有上升的趨勢，其中CSM上升最明顯，表明蒙脫石的添加使凋落物的DOM有機質分子量與腐殖化程度增大。這與前兩個參數SUVA254、SUVA280的結果吻合。各處理E4/E5平均值變化范圍為3.6-3.74，均大于3.5，說明DOM以富里酸為主。

3 討論

3.1 蚯蚓和礦物對凋落物OC的影響

礦物的存在會促進OC、H含量的分解。這是因為礦物為微生物提供了更大比表面積和生物源有機物，微生物更好存活，進而容納更豐富的微生物群落促進有機質分解。根據Kleber等的研究指出，礦物可以吸附生物源有機物，形成特殊的微聚體占有更多的資源和生態位，因此容納更多種類的微生物群落。相反N、S含量的增加，一方面是因為礦物顆粒風化和凋落物礦化提高了土壤中N、S等元素的含量，而其他元素如OC、H的損失，導致其相對富集。另一方面是因為微生物生長促進了其分泌物或殘體的累積。根據文獻報道，微生物源有機質具有較高的含N、S化合物（如氨基酸或蛋白等物質）。顯然，僅添加礦物下的處理組相對CS而言，OC、H的降低量明顯低于N、S的增加量。因此，N、S含量的增加可能更依賴于微生物的大量生長導致含N、S化合物等分泌物生成。在蚯蚓活動下分解與礦物相近，這可能是因為玉米凋落物具有豐富的低OC/N 比值的易降解組分，其大量組分易被微生物利用并促進其生長，因此在充足的碳源條件下，蚯蚓活動雖增加更多易降解組分作為碳，但微生物仍以凋落物碳源為主。研究報道，不同類型的碳源會對土壤微生物群落組成和功能產生影響，發現凋落物作為碳源更能被微生物優先利用。總的來看，礦物在135 d培養下改變了樣品的元素組成，而蚯蚓活動并不會明顯改變。

穩定碳同位素這一結果表明，CS在分解過程中13C被優先利用分解，導致i2C的富集。有研究表明易降解組分如蔗糖、淀粉等，且相較難降解組分富含13C。因此，該結果表明微生物優先降解富含13C易降解組分。此外，礦物添加后δ13C值進一步減小，結合元素分析數據可知，礦物添加后OC含量顯著降低，因此，礦物可能加速了易降解組分的分解。這可能是因為在分解中，蒙脫石中的微生物大量生長，在利用易降解組分時，富含13C的蔗糖等被消耗，導致12C相對增加。同時有文獻報道，與非鐵結合有機碳相比，鐵結合有機碳的脂肪族含量更少，羧基含量更高，13C含量更豐富。而在蚯蚓活動下δ13C值有所改變。有研究報道這是由于蚯蚓需攝取凋落物中的氨基酸為自身提供能量，使氨基酸基團中含碳鍵的輕碳同位素優先消解，導致13C組分的富集。另一方面蚯蚓的添加影響土壤微生物活動和優勢種群。經研究證明，蚯蚓活動下子囊菌和擔子菌的相對豐度降低，而子囊菌和擔子菌較12C更偏向利用13C。說明蚯蚓活動會降低蒙脫石組OM的碳同位素分餾，但改變赤鐵礦組分餾相對較少，這是因為蒙脫土是一種具有高離子交換和吸附能力的黏土礦物，吸附潛在的有害物質（如鹽）對微生物的生長產生直接影響，例如增加了富含13C的原核生物。

3.2 蚯蚓和礦物對凋落物DOM結構組成的影響

有研究報道，蒙脫石能促進凋落物的分解，這與本研究的結果一致。一個重要的原因是蒙脫石添加下促進微生物活性，加速利用易降解組分，導致DOC含量的顯著減小。赤鐵礦添加下DOC含量更高，一方面是因為赤鐵礦催化加速CS大分子有機化合物的分解，產生更多DOC。另一方面也可能是赤鐵礦抑制了微生物對有機物的利用。同時蚯蚓活動下與未添加蚯蚓相比，DOC含量減少。這主要是蚯蚓通過攝食、消化、產糞等作用促進了微生物對DOC的利用或轉化為更穩定的組分如團聚體或礦物結合態組分。

DOM由一系列分子組成，通過三維熒光光譜進一步分析，礦物的添加增強了熒光強度。在本研究中，蒙脫石對CS的改變最為明顯。這是因為蒙脫石通過為微生物提供生存場所，影響微生物群落棲息的微環境來影響微生物的代謝。此外蒙脫石還具有催化作用，讓有機前體吸附在蒙脫石表面，從而使微生物進入有利于反應發生的方向，促進了DOC的減少。這兩種作用加快了總有機碳的分解，促進了腐殖質組分的積累。而赤鐵礦一方面由于較為穩定，球粒狀結構導致其吸附效果較差。另一方面過量的赤鐵礦會降低微生物群落的豐富度以及多樣性（例如硝化細菌），導致腐殖化低。有研究報道，蚯蚓活動會提高腐殖化程度，這與本研究結果一致。這可能是蚯蚓添加后，一方面蚯蚓腸道的微生物促進了對某些芳香族化合物的降解和轉化。另一方面蚯蚓活動使得蚯蚓黏液能富集在礦物和凋落物表面，而由于黏液的加入，細菌群落結構發生了強烈的改變，具體表現為變形菌門的豐度增加較多，而該菌種是腐殖化的主要降解菌。特別是蚯蚓活動下，BIX值最高。有研究表明，蚯蚓促進了DOM的微生物群落多樣性以及微生物代謝能力，進而微生物攝取碳源的方式多元化。

紫外可見吸收光譜可以反映DOM分子結構的復雜程度和腐殖化程度。本研究中，僅存在礦物時，蒙脫石的SUVA254最大，這可能是當凋落物與蒙脫石混合后，蒙脫石可能吸附并富集了一部分有機物，導致濾液中SUVA254值的增加。另一方面，前文提到，蒙脫石更有利于微生物生長（如放射菌門），在分解有機物時釋放芳香物質。通過SUVA260可知，CSM和CSF顯著高于CS組，表明礦物的添加能提高有機質的疏水性，這主要是因為礦物添加促進了易降解極性高的小分子有機化合物的分解。蚯蚓活動會進一步提高其疏水性，這與Zhang等的研究指出添加蚯蚓會提高疏水性一致。在SUVA280中，CSM高而CSF低，這是因為在分解過程中，赤鐵礦中的鐵元素參與氧化還原反應，導致有機質中的大分子結構斷裂。在蚯蚓活動下，蚯蚓增大了各處理的分子量，是由于蚯蚓會優先利用小分子營養物質，并且蚯蚓通過攝食、消化、產糞等作用也產生了更多復雜和密集的芳香結構存在。

4 結論

（1）凋落物在分解過程中，礦物的添加下會促進有機碳比例的減少，而氮、硫比例增加，蚯蚓活動下的元素組成與礦物的趨勢無顯著差異，表明礦物會促進有機質的分解，蚯蚓活動并不會明顯改變。

（2）礦物的加入改變了凋落物的穩定碳同位素的分餾情況，即12C相對富集，蚯蚓活動反而減少了13C的貧化，特別是蚯蚓和蒙脫石組顯著改變穩定碳同位素分餾。

（3）蒙脫石和蚯蚓添加下對提升凋落物的生物可利用性、提高溶解性有機質芳香化和腐殖化程度、增加富里酸含量方面均具有顯著促進作用。總的來說，適當的礦物添加與蚯蚓活動下均能提高有機質的利用，而本研究表明蒙脫石與蚯蚓共同處理下，效果最好。

（責任編輯：葉飛）

基金項目：國家自然科學基金地區項目（42267028 ，42167030）；云南省重大科技項目（202202AG050019）環境健康與農產品安全（農業農村部產地環境污染防控重點實驗室學術支持）