稻鱔種養(yǎng)模式對土壤氨氧化微生物群落多樣性和結(jié)構(gòu)的影響

關(guān)鍵詞：稻鱔種養(yǎng)；氨氧化微牛物；高通量測序；土壤理化性質(zhì)；微生物群落

硝化作用是指將氨（NH3）通過氨氧化微生物氧化為亞硝酸鹽（N02），并進一步氧化為硝酸鹽（N03）的過程。硝化過程是全球氮循環(huán)過程的重要環(huán)節(jié)，在維持氮素平衡中起著關(guān)鍵作用。長期以來，人們一直認為氨氧化過程是由氨氧化古菌（AOA）和氨氧化細菌（AOB）驅(qū)動完成的。AOA通常被認為是土壤中最豐富的氨氧化微生物。然而，隨著完全氨氧化微生物（Comammox）的發(fā)現(xiàn)，硝化作用和氨氧化微生物的研究再次成為人們關(guān)注的熱點。此后，在各種系統(tǒng)中均發(fā)現(xiàn)了Comammox，如農(nóng)業(yè)土壤、森林土壤、淡水柄息地和污水處理廠。研究表明，AOA、AOB和Comammox的豐度、群落多樣性和結(jié)構(gòu)的變化與施肥條件、土壤類型、種植作物和土壤理化因子等有關(guān)。Wang等在弱酸性（5.8

相較于傳統(tǒng)水稻栽培模式，稻魚種養(yǎng)模式具有高效、環(huán)保、經(jīng)濟價值較高等優(yōu)點。已有研究發(fā)現(xiàn)，稻魚種養(yǎng)能有效提高土壤肥力，并能提高土壤微生物豐度和多樣性。馬微微等通過對田間管理下的稻魚互作的土壤營養(yǎng)成分進行研究，發(fā)現(xiàn)在收獲期，全氮、全磷的含量都有顯著的提高；周榆淇等發(fā)現(xiàn)，在長期淹水條件下稻魚種養(yǎng)顯著提高了土壤全氮和有機質(zhì)含量，并一定程度增加了微生物碳的含量；Zheng等發(fā)現(xiàn)，稻鱔種養(yǎng)模式提高了土壤真菌多樣性，降低了優(yōu)勢種比例。王蓉等發(fā)現(xiàn)，與常規(guī)水稻種植模式相比，稻蝦種養(yǎng)模式顯著提高了土壤氨氧化微生物（AOA和AOB）豐度，顯著降低了AOB的a多樣性。針對稻鱔種養(yǎng)模式，以往研究大多關(guān)注其對土壤養(yǎng)分含量和真菌多樣性的影響，而對氨氧化微生物影響的研究鮮有報道，氨氧化微生物對其的響應(yīng)機制尚不明確。

本研究以水稻一綠肥輪作系統(tǒng)為研究對象，探究稻鱔種養(yǎng)模式對土壤中心區(qū)域與溝渠邊緣區(qū)域的理化性質(zhì)和氨氧化微生物群落結(jié)構(gòu)與多樣性等指標的影響，揭示稻鱔種養(yǎng)對不同稻田區(qū)域氨氧化微生物群落的影響，為更好地理解稻鱔種養(yǎng)模式養(yǎng)分循環(huán)提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗地概括

試驗于上海市農(nóng)業(yè)科學院莊行綜合實驗站（30°53'N．121°23'E）的稻田種養(yǎng)長期定位試驗小區(qū)開展，該地年平均氣溫為15.8℃，年平均降水量為1178.0mm。土壤質(zhì)地為黏壤土，種植水稻品種為花優(yōu)14，試驗小區(qū)2016年初始土壤理化指標為：pH7.45，有機質(zhì)（SOM）16.43g·kg-1，總氮（TN）1.05g·kg-1，總磷（TP）1.14g·kg-1，速效氮（AN） 74.47mg·kg-1，速效磷（AP）34.31mg·kg-1。

1.2試驗設(shè)計

本試驗從2016年5月水稻季開始，每年按照同樣試驗條件實施。設(shè)置兩個處理，即常規(guī)稻田處理和稻鱔種養(yǎng)處理（常規(guī)施肥加“L”形渠溝，在其中投放黃鱔）。小區(qū)為完全隨機區(qū)組設(shè)計，每個處理3個重復(fù)，試驗小區(qū)為3mx4m，各小區(qū)之間使用土工膜隔離。稻鱔種養(yǎng)結(jié)合小區(qū)結(jié)構(gòu)見圖1。分別在處理小區(qū)的中心區(qū)域和溝渠邊緣區(qū)域取樣：常規(guī)稻田中心區(qū)域（CCS）、常規(guī)稻田溝渠邊緣區(qū)域（CMS）、稻鱔種養(yǎng)中心區(qū)域（ICS）和稻鱔種養(yǎng)溝渠邊緣區(qū)域（IMS）。每個處理施肥量保持一致，施用純氮225kg·hm-2，純磷112.5kg·hm-2，純鉀255kg·hm-2，所用肥料分別為尿素（含氮量46%）、過磷酸鈣（含P205 12%）、硫酸鉀（含K20 34%）。在稻田溝渠投放鱔魚苗，鱔魚苗質(zhì)量20-25g，體長27-31cm，投放量100kg·hm-2。稻鱔種養(yǎng)結(jié)合小區(qū)不添加餌料，黃鱔以蚯蚓、昆蟲、水生浮游動物等自然餌料為食。

1.3土壤理化性質(zhì)測定方法

于2020年4月水稻種植之前采集土壤樣本。采用S型采樣方法，每個采樣區(qū)域（CCS、CMS、ICS、IMS）采集5個土壤樣本（0-20cm），并將其合并為一個樣本。混合后的土壤樣品儲存在塑料袋中，立即帶回實驗室。清除土樣中的碎石、植物和動物殘骸。部分土樣風干后進行篩選（孔徑2mm），測定理化性質(zhì)，另一部分樣品儲存在-80℃冰箱中，待進行DNA提取和高通量測定。

土壤pH使用電位法測定（水土比為2.5：1）；土壤SOM使用重鉻酸鉀氧化法測定；土壤TN使用凱氏定氮法測定；土壤TP使用硫酸一高氯酸消化法測定；土壤AN使用NaCI直接提取法測定；土壤AP使用分光光度計法測定；土壤硝化勢（PNR）使用氨氧化快速檢測法測定。

1.4土壤樣品的DNA提取及高通量測序

使用Omega E．Z．MA．@土壤DNA試劑盒（D5625-02）按照說明提取土壤DNA。AOB -amoA、AOA-amoA、Comammox Clade-A和Comammox Clade-B的引物對分別為amoAIF/amoA2R、ArchamoAF/Arch-amoAR、comaA-244F/comaA-659R和comaB -244F_A/comaB_659R_A。PCR反應(yīng)體系為25uL，其中包括2uL稀釋5倍的DNA模板和23uL反應(yīng)液。反應(yīng)液的組成如下：SYBR Premix Ex Taq （2x）：12.5uL; ROXReference; DveⅡ（50x）：0.5uL;前向引物1uL;反向引物1uL；超純水8uL。擴增條件為：在98℃下初始變性30s，然后在98℃變性27個循環(huán)15s，在58℃／55℃/52℃／52℃（AOB/AOA/Comammox Clade-A/Comammox Clade-B）退火30s，在72℃下延伸30s/30s/45

s/45s（AOB/AOA/Comammox Clade-A/Comam-mox Clade-B），最后在72℃延伸7min。使用Nano-Drop ND-1000 UV-Vis分光光度計檢測PCR產(chǎn)物的數(shù)量和質(zhì)量。擴增成功后，將PCR產(chǎn)物送至派森諾生物（上海）進行mesiq平臺高通量測序分析。

首先根據(jù)PE reads之間的overlap關(guān)系，將成對的reads拼接為一條序列，同時對reads的質(zhì)量和merge的效果進行質(zhì)控過濾，有效序列可依據(jù)序列首位兩端的barcode和引物序列來區(qū)分樣品得到，將序列方向進行校正，得到優(yōu)化數(shù)據(jù)。通過對序列分類處理，進行Operational Taxonomic

Units（OTU）分組。在97%的相似性水平下對OTU進行生物信息統(tǒng)計分析。使用Usearch7.1軟件平臺，按照97%的相似性將非重復(fù)序列（不包括單一序列）進行OTU聚類。在聚類過程中，排除嵌合體，從而得到代表每個OTU的序列。基于OTU的分類，進行a多樣性和B多樣性的分析。使用貝葉斯算法分析97%相似性水平下的OTU代表序列，以獲取每個OTU的物種分類信息。在不同的分類水平（包括域、界、門、綱、目、科、屬和種）下統(tǒng)計樣本的群落組成。

1.5數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 26.0進行Tukey HSD檢驗單因素方差分析（ANOVA），確定各處理理化性質(zhì)之間的差異顯著性。采用Mothur（版本v．1.30.1）基于OTU計算AOAamoA、AOB amoA、Comammox

Clade -A和ComammoxClade-B的豐富度和多樣性指數(shù)；使用Origin 2020的Correlation Plot插件進行Pearson相關(guān)性分析；使用QIIME2計算BraV-Curtis距離矩陣，使用Origin 2020的Redundancy AnaIVsis插件進行多樣性分析；使用R構(gòu)建相關(guān)性矩陣（lrlgt;0.6和Plt;0.001），使用Gephi軟件繪制氨氧化微生物的共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)圖。

2結(jié)果與分析

2.1稻鱔種養(yǎng)對土壤理化性質(zhì)的影響

各處理土壤理化性質(zhì)如表1所示。各處理水稻土壤pH的范圍在7.68-7.97之間，呈弱堿性，IMS和ICS的pH顯著低于CCS和CMS（Plt;0.05），說明黃鱔的活動可降低試驗小區(qū)土壤pH。CCS與CMS之間的SOM和TN含量存在顯著差異，而ICS與IMS之間無顯著差異，說明黃鱔可以平衡土壤區(qū)域間的養(yǎng)分含量，使土壤養(yǎng)分更加均勻。稻鱔種養(yǎng)模式的AN、TP和AP含量相較于常規(guī)稻田處理無顯著差異。稻鱔種養(yǎng)模式相比常規(guī)稻田處理顯著提高了土壤PNR，加速了土壤氮循環(huán)速率。

2.2稻鱔種養(yǎng)對土壤氨氧化微生物a多樣性的影響

稻鱔種養(yǎng)對土壤氨氧化微生物a多樣性的影響如圖2所示，氨氧化微生物豐富度使用Chaol和Ob-served_species指數(shù)表示，多樣性使用Shannon和Simpson指數(shù)表示。與常規(guī)稻田處理相比，稻鱔種養(yǎng)模式顯著增加了AOA、Comammox Clade-A和Comam-mox Clade-B的豐富度（Plt;0.05），顯著降低了AOB的豐富度（Plt;0.05），ICS和IMS之間的氨氧化微生物豐富度無顯著差異。與常規(guī)稻田處理相比，IMS顯著提升了AOA的多樣性（Plt;0.05），顯著降低了AOB的多樣性（Plt;0.05）。各處理間Comammox Clade-A和Comammox Clade-B的群落多樣性無顯著性差異。

土壤理化性質(zhì)與氨氧化微生物Chaol和Shannon指數(shù)的相關(guān)性分析如圖3所示。pH與AOA、Comam-mox Clade-A的Chaol指數(shù)呈顯著負相關(guān)（Plt;0.05），SOM與AOB的Chaol和Shannon指數(shù)呈顯著負相關(guān)（Plt;0.05），與Comammox Clade-A和ComammoxClade-B的Chaol指數(shù)則呈顯著正相關(guān)（Plt;0.05）。AN與AOB的Chaol指數(shù)呈顯著負相關(guān)（Plt;0.05）。PNR與AOA的Chaol和Shannon指數(shù)、ComammoxClade-A和Comammox Clade-B的Chaol指數(shù)呈顯著正相關(guān)（Plt;0.05），與AOB的Chaol和Shannon指數(shù)呈顯著負相關(guān)（Plt;0.05）。

2.3稻鱔種養(yǎng)對土壤氨氧化微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

土壤氨氧化微生物的主成分分析和各處理之間群落差異P值分別如圖4和表2所示。AOA、AOB、Comammox Clade-A和Comammox Clade-B的PC01的解釋量分別為65.2%、36.5%、50.2%和35.9%，PC01和PC02的總解釋量分別為87.6%、68.6%、71.5%和56.4%。CMS和CCS的氨氧化微生物群落結(jié)構(gòu)相似，無顯著區(qū)分，但IMS和ICS除Comammox Clade-A群落結(jié)構(gòu)相似外，AOA、AOB和Comammox Clade-B的群落結(jié)構(gòu)均有顯著差異（Plt;0.05）。同時，與常規(guī)稻田處理相比，稻鱔種養(yǎng)結(jié)合處理的AOA、AOB、Comam-mox Clade-A和Comammox Clade-B的群落結(jié)構(gòu)均有差異（Plt;0.05）。

在稻鱔種養(yǎng)模式下，土壤各氨氧化微生物共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)和拓撲結(jié)構(gòu)如圖5和表3所示。結(jié)果顯示，相比于常規(guī)水稻種植模式，稻鱔種養(yǎng)模式提高了氨氧化微生物群落穩(wěn)定性，其中AOB尤為明顯。稻鱔種養(yǎng)模式的氨氧化微生物網(wǎng)絡(luò)節(jié)點數(shù)高于常規(guī)水稻模式（表3）。稻鱔種養(yǎng)模式的AOB、Comammox Clade-A和Comammox Clade-B的網(wǎng)絡(luò)邊數(shù)高于常規(guī)水稻模式，但AOA的邊數(shù)低于常規(guī)水稻模式。稻鱔種養(yǎng)模式提高了AOA、Comammox Clade-A和Comammox Clade-B的網(wǎng)絡(luò)模塊化度，但降低了AOB的模塊化度。

3討論

稻鱔種養(yǎng)可改善土壤理化環(huán)境，減少化肥投入，增加產(chǎn)量和經(jīng)濟效益。一般情況下，由于黃鱔活動范圍有限，在稻田土壤邊緣區(qū)域活動較強，對稻田整體影響不均勻，有可能導致土壤養(yǎng)分在區(qū)域間產(chǎn)生差異。因此，本文旨在研究稻鱔種養(yǎng)模式下，黃鱔的生理活動對溝渠邊緣和中心區(qū)域的土壤理化性質(zhì)和氨氧化微生物群落的影響，為闡明稻鱔種養(yǎng)模式的養(yǎng)分供給特征提供科學支撐。

本研究結(jié)果表明，在土壤呈弱堿性（pH為7.68-7.97）的情況下，相較于常規(guī)稻田，稻鱔種養(yǎng)模式土壤中pH顯著下降，土壤有機質(zhì)和全氮分布更加均勻，土壤硝化勢顯著增加，土壤全磷、速效氮和速效磷的含量無顯著變化，這與袁泉等的研究結(jié)果相似，結(jié)果表明在稻鱔模式下，黃鱔的生理活動會加速土壤養(yǎng)分的釋放，并且黃鱔的體液和排泄物等物質(zhì)可改善土壤理化環(huán)境。值得注意的是，稻鱔種養(yǎng)模式的中心區(qū)域和邊緣區(qū)域在土壤理化性質(zhì)方面沒有顯著差異。

以往的研究發(fā)現(xiàn)，Comammox在土壤中的數(shù)量比AOA和AOB更多，在酸性和堿性土壤中都占據(jù)優(yōu)勢。但在本研究中，AOA的豐富度顯著高于其他氨氧化微生物。因為本試驗長期處在淹水狀態(tài)，土壤含氧量較低，而AOA更適應(yīng)在低氧環(huán)境中生存。在本研究中，相較于常規(guī)稻田處理，稻鱔種養(yǎng)模式提高了AOA、Comammox Clade-A和Comammox Clade-B的豐富度，降低了AOB的豐富度，需要注意的是，這種影響在中心區(qū)域和邊緣區(qū)域之間沒有顯著差異。稻鱔種養(yǎng)模式的中心區(qū)域相比于常規(guī)稻田處理提高了AOA的群落多樣性，降低了AOB的群落多樣性。雖然水稻土壤長期處于淹水狀態(tài)，但黃鱔的活動會增加土壤的通氣性，而氨氧化微生物屬于好氧菌，所以其活動一定程度上促進了氨氧化微生物的生長。基因組分析發(fā)現(xiàn)，AOB存在著一段Rh型銨轉(zhuǎn)運蛋白（Rh-type ammonium transporter）基因，相比于AOA中發(fā)現(xiàn)的MEP型銨轉(zhuǎn)運蛋白（MEP-type ammonia transport-ers），Rh型銨轉(zhuǎn)運蛋白對銨的親和力較低。而在本研究中，稻鱔種養(yǎng)模式并沒有顯著提高土壤速效氮含量，故一定程度上影響了AOB的豐富度和多樣性。

土壤理化性質(zhì)和生物相互作用是塑造各種生態(tài)系統(tǒng)中微生物群落的主要因素。土壤理化性質(zhì)對氨氧化微生物的群落豐度和多樣性的變化有著直接或間接的影響。土壤pH是氨氧化微生物群落的重要驅(qū)動因素，影響土壤養(yǎng)分的含量和有效性以及微生物的生長和活性。本研究中土壤pH的范圍在7.68-7.97，與AOA和Comammox Clade-A的Chaol指數(shù)呈顯著負相關(guān)。這與氨氧化微生物對pH的響應(yīng)機制有關(guān)，AOA和Comammox依靠對鉀的吸收，產(chǎn)生反向膜電位，從而在酸性土壤中維持體內(nèi)pH平衡，表現(xiàn)出對pH的耐受性。土壤速效氮含量也是影響氨氧化微生物豐度的重要環(huán)境因子，一般認為，NH4-N是氨氧化微生物代謝的直接底物。Kits等的研究表明，Comammox的氨半飽和常數(shù) -63nmol，AOA的K-0.13umol， AOB的Km（NH3） -0.14-1.90mmol。AOB的K更大，表明其對氨氮的耐受性較高，因此通常AOB的豐度與NH4-N含量呈正相關(guān)，這與以往的研究結(jié)論一致。本研究未測定土壤NH4-N含量，但由于稻田長期淹水，導致土壤中的NH4-N在土壤速效氮含量中占比較高，所以速效氮含量可以在一定程度上反映出土壤NH4-N含量，因此在相關(guān)性分析中，速效氮與AOB的Chaol指數(shù)呈顯著正相關(guān)，與AOA和Comammox的Chaol指數(shù)呈負相關(guān)。土壤的硝化作用是將土壤中的氮素轉(zhuǎn)化為硝酸鹽的過程，其中土壤硝化勢是衡量這個過程的重要指標。而氨氧化微生物群落的多樣性是影響土壤硝化勢的重要因素。在本研究中，AOA和Comammox的群落多樣性與土壤硝化勢呈顯著正相關(guān)，而AOB的群落多樣性與土壤硝化勢呈顯著負相關(guān)。這表明AOA和Co-mammox能夠促進土壤的硝化速率，而AOB則可能抑制了土壤的硝化速率。這是由于與AOB相比，AOA和Comammox更適宜在缺氧的環(huán)境中生存，從而對土壤硝化勢有促進作用。

氨氧化微生物的B多樣性和共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)是研究氨氧化微生物群落結(jié)構(gòu)重要的工具和方法，能夠揭示氨氧化微生物群落的組成差異和相互作用模式。本研究中，與常規(guī)稻田處理相比，稻鱔種養(yǎng)模式顯著改變了氨氧化微生物群落結(jié)構(gòu)，并且在稻田中心區(qū)域和溝渠邊緣區(qū)域均加強了氨氧化微生物網(wǎng)絡(luò)的模塊化度。模塊化度是微生物網(wǎng)絡(luò)分析中常用的一種度量指標。通常情況下，模塊化度越高，說明微生物網(wǎng)絡(luò)內(nèi)部關(guān)聯(lián)越緊密，發(fā)育程度越完善。稻鱔種養(yǎng)模式增加了氨氧化微生物群落的信息和能量交流，使其擁有更緊密的內(nèi)部連接，這可能是因為黃鱔的活動加速了土壤中養(yǎng)分的釋放和通氣狀況，從而直接或間接改變了氨氧化微生物群落和網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。

本研究為理解稻鱔種養(yǎng)結(jié)合對土壤氨氧化微生物群落的影響提供了理論依據(jù)，未來需要進一步研究不同農(nóng)業(yè)管理措施對土壤氨氧化微生物群落的影響機制及不同氨氧化微生物之間的關(guān)系，為優(yōu)化農(nóng)業(yè)管理提供科學依據(jù)。

4結(jié)論

（1）與常規(guī)稻田處理相比，稻鱔種養(yǎng)模式顯著降低了土壤pH，減小了中心區(qū)域和邊緣區(qū)域之間的有機質(zhì)與總氮含量差異，使土壤養(yǎng)分分布更加均勻，并增加了土壤硝化勢，促進了土壤氮循環(huán)。

（2）與常規(guī)稻田處理相比，稻鱔種養(yǎng)模式顯著提高了AOA、Comammox Clade-A和Comammox Clade-B的豐富度，顯著降低了AOB的豐富度；同時，顯著提高了邊緣區(qū)域AOA的群落多樣性，但降低了邊緣區(qū)域AOB的群落多樣性；

（3）土壤pH、有機質(zhì)和速效氮是影響土壤氨氧化微生物群落的關(guān)鍵環(huán)境因子；AOA和Comammox群落促進了土壤硝化勢，而AOB抑制了土壤硝化勢。

（4）共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)分析顯示稻鱔種養(yǎng)模式顯著改變了氨氧化微生物群落結(jié)構(gòu)，加強了氨氧化微生物群落之間的信息交流，擁有更緊密的內(nèi)部連接。