長基因間非蛋白編碼RNA 472對阿爾茨海默病神經元鐵死亡的作用機制研究

【摘要】目的 探究長基因間非蛋白編碼RNA 472（LINC00472）對阿爾茨海默病（AD）神經元鐵死亡的作用機制，為臨床治療提供參考。方法 選取雄性昆明種小鼠30只，隨機分為空白組、模型組、模型+加藥組，各10只。空白組小鼠腹腔注射等量的生理鹽水和灌胃等量的雙蒸水，模型組小鼠灌胃人β淀粉樣蛋白1-42（Aβ1-42）5 mg/kg（雙蒸水配制）建立AD模型，模型+加藥組小鼠在模型組基礎上腹腔注射環磷酸腺苷（cAMP）篩選出的抑制LINC00472靶向藥物。比較3組小鼠迷宮測試結果，腦組織炎癥因子水平、β淀粉樣蛋白（Aβ）mRNA水平、微管相關蛋白（tau）mRNA水平、谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）mRNA水平、甲基轉移酶3（METTL3）水平、凋亡信號調節激酶1（ASK1）水平及3組小鼠的Aβ、tau、GPX4免疫組化檢測結果。結果 空白組、模型+加藥組小鼠Y形迷宮覓食時間、莫里斯水迷宮（MWM）逃逸時間均短于模型組，且空白組均短于模型+加藥組；空白組、模型+加藥組小鼠MWM有效區域停留時間均長于模型組，且空白組長于模型+加藥組（均P<0.05）。空白組、模型+加藥組小鼠白細胞介素-6（IL-6）、單核細胞趨化蛋白（MCP-1）、白細胞介素-1β（IL-1β）、Aβ mRNA、tau mRNA、METT3 mRNA、ASK1水平均低于模型組，且空白組均低于模型+加藥組；空白組、模型+加藥組小鼠GPX4 mRNA水平均高于模型組，且空白組高于模型+加藥組（均P<0.05）。模型組小鼠海馬體Aβ1-42沉積增加，模型+加藥組Aβ1-42表達水平低于模型組；模型組小鼠海馬體tau磷酸化增加，模型+加藥組海馬體tau磷酸化程度低于模型組；模型組小鼠海馬體GPX4表達減少，模型+加藥組海馬體GPX4表達高于模型組。結論 LINC00472抑制有助于減輕神經炎癥，減少Aβ沉積、tau磷酸化，并提高GPX4表達，進而通過抑制AD神經元鐵死亡改善神經功能，且AD神經元鐵死亡的作用機制與METT3/ASK1通路有關。

【關鍵詞】長基因間非蛋白編碼 RNA 472；阿爾茨海默病；鐵死亡

【中圖分類號】R322.8 【文獻標識碼】A 【文章編號】2096-2665.2024.21.0001.05

DOI：10.3969/j.issn.2096-2665.2024.21.001

阿爾茨海默病（Alzheimer's disease， AD）是常見的神經退行性疾病，其發病原因和機制目前尚不明確，與遺傳、環境、年齡增長等有關，可出現進行性加重性認知功能障礙與行為損害、記憶和學習能力受損，該病患者腦內的斑塊、小膠質細胞、纏結神經元中可觀察到鐵沉積現象[1-2]。鐵死亡是非凋亡性程序性細胞死亡，其特征為鐵依賴性的脂質氫過氧化物累積到致死水平，是AD病理生理學的主要過程[3]。除鐵死亡外，腦組織還易受到神經炎癥的影響，鐵滯留可觸發AD中的小膠質細胞活化和白細胞介素產生，加劇淀粉樣β蛋白（Aβ）沉積和微管相關蛋白（tau）磷酸化。有研究表明，鐵死亡抑制劑在卒中疾病動物模型中具有保護神經元、恢復認知功能的作用[4]。長基因間非蛋白編碼RNA 472（LINC00472）與鐵死亡密切相關，其在多種腫瘤中的表達研究較多，但關于其在AD中的表達及作用機制相關研究較少。基于此，本研究探究LINC00472對AD神經元鐵死亡的作用機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 選取雄性昆明種小鼠30只[購于上海杰思捷實驗動物有限公司，動物生產許可證號： SCXK（滬）2020-0004]， 3月齡，體質量300～400 g。適應性喂養1周后，隨機分為空白組、模型組、模型+加藥組，各10只。

空白組小鼠腹腔注射等量的生理鹽水和灌胃等量的雙蒸水；模型組小鼠灌胃人β淀粉樣蛋白1-42（Aβ1-42）5 mg/kg（雙蒸水配制）建立AD模型；模型+加藥組小鼠在模型組基礎上腹腔注射環磷酸腺苷（cAMP）篩選出的抑制LINC00472靶向藥物，在造模成功1周后連續灌胃給藥8周。 3組小鼠均于末次給藥后進行迷宮實驗，取腦組織，置于-80 ℃環境保存待測。研究過程遵循國際通行的動物福利和倫理準則。

1.2 研究方法 ⑴迷宮實驗。 Y形迷宮由3個臂組成，包括1個起始臂和2個目標臂（每個臂的尺寸為30 cm×6 cm×30 cm）。訓練小鼠3 d后進行測試。小鼠在正式測試前禁食12 h。第41天，在2個目標臂之一放置食物，將小鼠分別放置在起始臂末端，用攝像機記錄每只小鼠的運動軌跡和尋找食物所用的時間，并使用

ANY-maze動物行為分析軟件進行分析。

第43天使用莫里斯水迷宮（MWM）評估小鼠的空間記憶和導航能力，訓練和正式測試均使用MT-200水迷宮視頻跟蹤分析系統進行。水槽被分成4個象限，向水槽中添加二氧化鈦使水變渾濁。訓練小鼠放入水中后有60 s內到達平臺，并在平臺上停留20 s。若有60 s內未找到平臺，則手動帶小鼠到平臺上并停留20 s。共訓練

3天。第46天和第47天分別在盲測條件下進行導航測試和探索試驗，記錄小鼠找到平臺所用時間和（或）通過有效區域的時間。

⑵酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。取小鼠腦組織，裂解、研磨，低速離心后取上清液，使用ELISA檢測白細胞介素-6（IL-6）、單核細胞趨化蛋白1（MCP-1）、白細胞介素-1β（IL-1β）水平。

⑶免疫組化染色。干燥載玻片，并用二甲苯和乙醇脫蠟。用檸檬酸緩沖液在100 ℃下進行載玻片表位檢索，煮沸30 min，用3%過氧化氫孵育。切片用5%的牛血清白蛋白（BSA）阻斷，然后用Aβ、tau、谷胱甘肽過氧化物酶4（GPX4）一抗（均購自和光純藥工業有限公司）孵育過夜。最后，加入山羊抗兔二抗孵育，并用3，3'-二氨基聯苯胺（購自賽默飛世爾科技）染色。在反應結束時，用Harris蘇木精進行反染色。用95%和100%乙醇和二甲苯洗滌脫水后，用永久貼載介質覆蓋組織切片，在共聚焦顯微鏡下觀察免疫組化染色情況。

⑷RNA分離和定量反轉錄PCR（qRT-PCR）。取大鼠腦組織在1 mL 組織裂解緩沖液中裂解，于冰浴狀態下在玻璃研磨機中研磨成勻漿，然后4 ℃裂解30 min，離心20 min。成骨細胞使用1 mL 組織裂解緩沖液裂解后離心，使用TRIzol試劑提取總RNA，并使用Hifair Ⅲ第一鏈cDNA合成Super Mix轉錄成cDNA。使用Hieff qPCR SYBR Green Master Mix（購自賽默飛世爾科技）行定量實時PCR。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內參基因，根據2-ΔΔCt方法計算Aβ、tau、GPX4 mRNA表達水平。

⑸蛋白質印跡分析。取大鼠腦組織在1 mL組織裂解

緩沖液中裂解，于冰浴狀態下在玻璃研磨機中研磨成勻漿，然后4 ℃裂解30 min，離心20 min。成骨細胞使用1 mL 組織裂解緩沖液裂解后離心，使用補充了1%苯基甲基磺酰氟的放射免疫沉淀測定（RIPA）緩沖液提取成骨細胞的蛋白質并轉移到聚偏二氟乙烯（PVDF膜）上，用脫脂奶粉（5%）在含有0.05%Tween-20（TBST）的Tris緩沖鹽溶液中封閉。然后，將PVDF膜分別與甲基轉移酶

3（METTL3）、細胞凋亡信號調節激酶1（ASK1）、β-肌動蛋白（β-actin）（購自和光純藥工業有限公司）在室溫下過夜。用TBST洗滌后，將PVDF膜與二抗IgG，在室溫下孵育2 h。將膜浸入增強型化學發光溶液。在無光條件下顯影后，觀察條帶并拍照記錄，以β-actin作為內參，使用2-ΔΔCt方法計算METT3、ASK1蛋白相對表達水平。

1.3 統計學分析 采用SPSS 21.0統計學軟件進行數據分析。計量資料以（x）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較使用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3組小鼠迷宮實驗結果比較 空白組、模型+加藥組小鼠Y形迷宮覓食時間、 MWM逃逸時間均短于模型組，且空白組短于模型+加藥組；空白組、模型+加藥組小鼠MWM有效區域停留時間均長于模型組，且空白組長于模型+加藥組，差異均有統計學意義（均P<0.05），

見表1。

2.2 3組小鼠腦組織炎癥因子水平比較 空白組、模型+加藥組小鼠IL-6、 MCP-1、 IL-1β水平均低于模型組，且空白組均低于模型+加藥組，差異均有統計學意義（P<0.05），見表2。

2.3 3組小鼠腦組織Aβ、tau、GPX4免疫組化檢測結果 模型組小鼠海馬體Aβ1-42沉積增加，模型+加藥組Aβ1-42低于模型組，見圖1；模型組小鼠海馬體tau磷酸化增加，模型+加藥組海馬體tau磷酸化低于模型組，見圖2；模型組小鼠海馬體GPX4表達減少，模型+加藥組海馬體GPX4表達高于模型組，見圖3。

2.4 3組小鼠Aβ、 tau、 GPX4 mRNA相對表達水平比較 空白組、模型+加藥組小鼠Aβ、 tau mRNA水平均低于模型組，且空白組均低于模型+加藥組；空白組、模型+加藥組小鼠GPX4 mRNA水平均高于模型組，且空白組高于模型+加藥組，差異均有統計學意義（均P<0.05），見表3。

2.5 3組小鼠METT3、 ASK1蛋白相對表達比較 空白組、模型+加藥組小鼠METT3、 ASK1蛋白表達水平均低于模型組，且空白組均低于模型+加藥組，差異均有統計學意義（P<0.05），見表4。 3組小鼠METT3、 ASK1蛋白免疫印跡情況，見圖4。

3 討論

鐵死亡是一種非凋亡性的細胞死亡形式，其在形態學、生化、遺傳學上均不同于其他形式的細胞死亡（如凋亡、壞死、自噬），鐵過載可在體內誘導鐵死亡，而鐵螯合劑可預防鐵死亡[5]。鐵死亡可見于各種神經系統疾病相關的神經元細胞死亡中，如出血性卒中、缺血性卒中、帕金森病、亨廷頓病等，并伴有脂質過氧化、線粒體功能障礙及GPX4減少[6]。

腦鐵過載與AD等神經退行性疾病的病理機制相關，然而其潛在機制尚不明確。此外，鐵死亡抑制劑已在卒中疾病動物模型中被證明可保護神經元、恢復認知功能，且敲除小鼠的 GPX4可直接導致年齡依賴性的神經退行性變化和嚴重的神經元丟失[7]。考慮AD 中過量鐵的積累會導致腦內活性氧（ROS）的產生顯著增加，因此，鐵死亡可能與 AD 的神經元丟失和認知障礙有關。

Aβ、tau、GPX4是鐵死亡及鐵過載的重要反映指標。Aβ前體蛋白（APP）是一種1型跨膜糖蛋白，是Aβ生成的關鍵前體，可先被α-分泌酶或β-分泌酶切割，然后再被γ-分泌酶切割。在健康狀態下，α-分泌酶首先切割APP，即處于非淀粉樣變性途徑。然而，APP首先被β-分泌酶切割，可產生具有神經毒性的40～42個氨基酸的淀粉樣蛋白（淀粉樣變性途徑）。而弗林蛋白酶在介導α-分泌酶或

β-分泌酶的蛋白酶解活化率方面起關鍵作用，其濃度與

α-分泌酶活性呈正相關，與β-分泌酶活性呈負相關。胞內鐵濃度過高可通過減少弗林蛋白酶，增強β分泌酶活性，從而增加淀粉樣變性途徑的Aβ生成。此外，APP mRNA是5'-非翻譯區（5'-UTR）編碼鐵反應元件（IRE），該元件與胞內鐵含量密切相關。當胞內鐵濃度升高時，5'-UTR mRNA中的IRE上調APP的翻譯，從而增加APP蛋白的數量，并促進Aβ的生成。鐵還能直接與Aβ的His6、His13、His14氨基酸殘基結合，從而增強Aβ的神經毒性[8]。

在APP/PS1小鼠AD模型中，亞微米分辨率的X線顯微鏡技術顯示，淀粉樣斑塊形態與鐵直接相關[9]。鐵可通過誘導激酶影響蛋白磷酸酶 2A活性，促進tau過度磷酸化，還可通過tau蛋白中的鐵結合基序引起過度磷酸化的 au聚集[10]。GPX4通過將膜脂質氫過氧化物還原為脂質醇來抑制脂質過氧化，被認為是鐵死亡的中樞調節器。GPX4的敲除可誘導脊髓運動神經元的鐵死亡，從而導致成年小鼠迅速癱瘓和死亡。有研究表明，鐵死亡通過敲除前腦神經元GPX4，引發海馬神經變性中的主要細胞死亡，這與認知障礙的發生發展直接相關。此外，鐵沉積和肽-血紅素復合物的形成與Aβ和tau相互作用，可產生涉及鐵死亡途徑的ROS[11]。

本研究結果顯示，空白組、模型+加藥組小鼠Y形迷宮覓食時間、MWM逃逸時間均短于模型組，且空白組短

于模型+加藥組；空白組、模型+加藥組小鼠MWM有效區域停留時間均長于模型組，且空白組長于模型+加藥組，提示小鼠神經功能改善。且免疫組化及PCR實驗證實，在AD小鼠中Aβ、tau表達增加，GPX4表達減少，LINC00472抑制則逆轉其變化，表明LINC00472抑制有助于通過減少AD小鼠神經細胞鐵死亡改善其神經功能。

ASK1是各種依賴于ros的細胞死亡過程中的關鍵調節因子，不僅參與氧化鋁納米顆粒誘導的海馬神經元鐵凋亡的調控，還能通過ASK1-p38 mapk通路，在冷應激誘導的鐵凋亡中發揮重要作用[12]。有研究表明，ASK1參與多種ros依賴性細胞死亡過程，作為多個信號級聯的樞紐[13]。本研究結果顯示，空白組、模型+加藥組METT3、ASK1蛋白表達低于模型組，空白組低于模型+加藥組，推測LINC00472抑制可能是通過METT3/ASK1通路介導進而抑制AD小鼠神經細胞鐵死亡。

綜上所述，LINC00472抑制有助于抑制神經炎癥，減少Aβ沉積、tau磷酸化，并提高GPX4表達，通過抑制鐵死亡改善神經功能，且對阿爾茨海默病神經元鐵死亡的作用機制與METT3/ASK1通路有關。

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1基金項目：2022年度黑龍江省省屬本科高校基本科研業務費科學技術研究項目（編號：2022-KYYWF-0815）

作者簡介：林萍，碩士研究生，副主任醫師，研究方向：神經內科疾病的診療。