接種叢枝菌根和不同施肥對桑樹多酚及 黃酮含量的影響

摘 要：為了研究接種叢枝菌根和不同施肥對桑樹根、枝和葉的多酚及黃酮含量的影響，本試驗以大10為供試桑樹品種，接種摩西斗管囊霉和施加不同肥料，測定桑樹根、枝、葉中多酚和黃酮含量的變化情況。結果發現，各處理組根部多酚和黃酮含量均相對對照組降低，其中同時施加生物有機肥及化肥組的桑根多酚和黃酮含量與對照組差別最顯著，分別相差39.33%和63.51%；枝部多酚含量變化情況不顯著，黃酮含量除僅施加化肥組均高于對照組；葉部多酚含量變化情況不顯著，黃酮含量則均低于對照組，其中僅有施加化肥組呈顯著性差異，相對降低24.07%；桑樹根、枝和葉的黃酮含量受影響程度均顯著大于同部位的多酚含量。本試驗可以為后續植物與土壤相互作用研究提供參考。

關鍵詞：桑；多酚；黃酮；叢枝菌根；施肥

中圖分類號：S888.2" 文獻標識碼：A" 文章編號：0488-5368（2024）10-0020-06

收稿日期：2024-03-30 修回日期：2024-05-07

作者簡介：熊承軒（2004-），男，本科，主要從事活性物質高附加值產品開發工作。

Effects of Inoculation with Arbuscular Mycorrhizal Fungi and Different "Fertilizations" on Polyphenol and Flavonoid Content in Mulberry Trees

XIONG Chengxuan

（College of Life Sciences， Shanxi University， Taiyuan， Shanxi" 030031， China）

Abstract： This study investigates the effects of arbuscular mycorrhizal fungi and different fertilizers on the content of polyphenols and flavonoids in the roots， branches， and leaves of mulberry trees.Using Da 10 as the experimental variety， inoculation with %Morchella esculenta %and the application of different fertilizers were performed， and the changes in polyphenol and flavonoid content in the roots， branches， and leaves of the mulberry trees were measured.The results showed that the content of polyphenols and flavonoids in the roots of each treatment group was relatively lower than that of the control group. Among them， the group treated with both bioorganic fertilizer and chemical fertilizer had the most significant differences in the content of polyphenols and flavonoids compared to the control group， with differences of 39.33% and 63.51%， respectively. The changes in the polyphenol content in the branches were not significant. The flavonoid content was higher than the control group， except for the group treated only with chemical fertilizer. The changes in the leaf polyphenol content were not significant， while the flavonoid content was lower than the control group. Among them， only the group treated with chemical fertilizer showed significant differences， with a relative decrease of 24.07%. Overall， flavonoid content in mulberry trees is significantly more affected than that of polyphenol content. This study provides a reference for further research into the interactions between plants and soil.

Key words： Mulberry， Polyphenols; Flavonoids; Arbuscular mycorrhizal; Fertilization

引 言

桑（%Morus alba% L.）具有豐富營養組分及多種活性成分，其原料及產品已被廣泛用于飼蠶、食品和醫藥等多個領域[1]。在桑樹活性成分中，多酚通常具有一個至少連接一個羥基的苯環及其衍生物，根據官能團可分類為黃酮類、花色素類和香豆素類等化合物，具有緩解植物營養缺乏，抵抗逆境脅迫及作為信息交流物質等作用[2～3]。目前研究表明，可通過改變土壤環境[4]、改良品種[5]、施加激素[6]和不同種植模式[7]等途徑改變桑樹活性成分含量，其中聯合施用生物有機肥及氮肥、磷肥和鉀肥可以改善其栽種土壤的理化性狀及微生物的功能多樣性，從而有效提高桑葉及桑果的產量與品質[8，9]。

植物與土壤之間相互作用被視為最具挑戰的前沿領域。截至目前，植物地上部之間的通訊機制研究已經取得重要進展，但是關于根際對話的認識較為有限[10]。典型的根際對話（如菌根、根瘤等）是植物的根可與土壤微生物建立共生關系，促進植物生長和作物品質。其中，菌根（mycorrhiza）是指根在土壤中與真菌形成的共生結構，主要包括外生菌根和內生菌根兩種類型[11]。桑科植物根系發達，主要形成內生菌根中的叢枝菌根真菌（arbuscular mycorrhiza fungi， AMF）。杜麗建[12]發現對“特優2號”桑樹幼接種套近明球囊霉、摩西斗管囊霉和根內根孢囊霉可提高桑葉中類胡蘿卜素和黃酮類化合物的含量。目前，有關接種AMF對桑樹多酚及黃酮含量變化影響的研究較少。因此，本研究擬對大10桑樹品種進行接種AMF和不同施肥處理，探究其對桑樹根、枝、葉的多酚及黃酮含量的影響，為改進桑樹栽培技術及其產業應用提供參考借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗桑園位于陜西省周至縣馬召鎮曹家灘村（北緯34.16°，東經108.22°）。供試品種為大10，2019年11月種植，樹齡5 a。叢枝菌根供試菌種選用摩西斗管囊霉（%Funneliformis mosseae， %Fm），購自長江大學根系生物學研究所。供試桑園土壤含有機質22.36" g/kg，全氮1.1 g/kg，有效磷35.2" mg/kg，速效鉀178 mg/kg，pH值6.9。生物有機肥含有機質380 g/kg，全氮25 g/kg，P-2O-5 21 g/kg，K-2O 51 g/kg，pH值8.4，由雞糞發酵制成，購自咸陽佳源肥業有限公司。化肥包括尿素、磷肥和鉀肥，其中尿素含N量≥46.4%，購自江蘇晉煤恒盛化工股份有限公司；磷肥含P量≥70%，購自湖北豐樂生態肥業有限公司；鉀肥含K量≥60%，購自中華化肥有限公司。

1.2 試驗設計

設置包括對照組在內的7個處理組，分別為CK組（不接種Fm且不施肥）、C組（僅接種Fm）、Y組（僅施加生物有機肥）、H組（僅施加化肥）、CY組（接種Fm且施加生物有機肥）、CH組（接種Fm且施加化肥）、YH組（施加生物有機肥及化肥）。分別在2023年4月8日與7月15日進行試驗處理。每個處理組3個重復，每個重復3株。具體分組處理情況見表1和表2。

1.3 樣品采集與處理

2023年10月15日按組別采集靠近主干15～20 cm的根，主干頂端粗細與長短相近的枝以及枝上生長的葉。各組樣品干燥后，經粉碎機粉碎，過80目篩，精密稱取2 g過篩樣品，加入30 mL 70%乙醇浸提3 h，之后按60 ℃、100 W的參數超聲輔助提取45 min，過濾除去殘渣，并使用70%乙醇10倍稀釋后得樣品溶液。

1.4 指標測定

1.4.1 多酚含量的測定 參考占鵬飛等[13]的方法，采用福林酚比色法測定多酚含量。準確稱取沒食子酸標準品25 mg，用去離子水溶解并定容至50 mL，從中精確量取5 mL于50 mL容量瓶中并用去離子水定容，得沒食子酸標準溶液。分別準確量取沒食子酸標準溶液0.2 mL、0.4 mL、0.8 mL、1.2 mL、1.6 mL、2.0 mL于10 mL容量瓶中，各加入福林酚試劑0.4 mL，10.8%無水碳酸鈉溶液4.8 mL，用去離子水定容至10 mL，搖勻并放置30 min，在760 nm波長處測定吸光度值。以沒食子酸標準溶液質量濃度（mg/L）為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制沒食子酸標準曲線（圖1），得到回歸方程y = 73.329x + 0.0002（R2 = 0.9917）。

精確量取樣品溶液0.8 mL于15 mL離心管中，各加入福林酚試劑0.4 mL、10.8%無水碳酸鈉溶液4.8 mL和去離子水4.0 mL，搖勻并放置30 min，按5 000 rpm的參數離心5 min，取上清液，在760 nm波長處測定吸光度值，根據回歸方程計算樣品中多酚含量。計算公式為：多酚含量（mg/g）=測定液質量濃度×10×10×15/170.12。

1.4.2 黃酮含量的測定

參考江念等[14]的方法，采用亞硝酸鈉-硝酸鋁法測定黃酮含量。精密稱取蘆丁標準品20 mg，用70%乙醇溶液溶解并定容至50 mL，得蘆丁標準溶液。分別準確量取蘆丁標準溶液0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL于10 mL容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉溶液0.5 mL，搖勻并放置5 min。加入5%的硝酸鋁溶液0.5 mL，搖勻并放置5 min。加入4%氫氧化鈉溶液4 mL，用去離子水定容至10 mL，搖勻并放置15 min，在510 nm波長處測定吸光度值。以蘆丁標準溶液質量濃度（mg/L）為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制蘆丁標準曲線（圖2），得到回歸方程y = 6.4829x + 0.0582（R2= 0.9973）。

準確量取樣品溶液1 mL，參照上述步驟獲得吸光度，根據回歸方程計算樣品中黃酮含量。計算公式為：黃酮含量（mg/g）=測定液質量濃度×10×10×15/610.52。

1.5 數據處理

使用Microsoft Office Excel 2021和SPSS 26分析數據，通過SPSS 26進行單因素ANOVA方差分析和顯著性水平檢驗，數據以\"平均值±標準差\"表示，通過皮爾遜法分析多酚含量與黃酮含量的相關性，%P%＜0.05認為具有統計學意義。使用Origin Pro 2021繪制圖像。

2 結果與分析

2.1 接種AMF和不同施肥處理后桑樹根、枝、葉的多酚含量

桑樹根、枝、葉的多酚含量如表3所示。桑根多酚含量僅在少數組別之間存在顯著差異。CK組含量最高，為0.267 mg/g，YH組含量最低，為0.162 mg/g。顯著性差異僅存在于YH組與CK組及CH組之間，YH組分別較CK組和CH組減低39.33%和35.97%。其余各實驗組之間無顯著差異。該系列數據表明，對桑樹同時施加生物有機肥及化肥會顯著減少桑根多酚的含量。

桑枝多酚各組之間不存在顯著差異。僅H組多酚含量低于CK組，其余各處理組均高于CK組。桑葉多酚各組之間不存在顯著差異。各處理組多酚含量均低于CK組，其中H組多酚含量相對最低。該系列數據說明，對桑樹施加化肥會顯著降低桑樹枝、葉的多酚含量，而接種AMF及其他施肥對桑樹枝、葉中多酚含量無顯著影響。

2.2 接種AMF和不同施肥處理后桑樹根、枝、葉的黃酮含量

桑樹根、枝、葉的黃酮含量如表4所示。桑根黃酮含量在多個實驗組之間存在顯著差異。CK組黃酮含量最高，為0.074 mg/g，YH組黃酮含量最低，為0.027 mg/g。C組、Y組和YH組黃酮含量均與CK組有顯著差異，分別較CK組減少28.38%、24.32%和63.51%。H組、CY組和CH組僅與YH組有顯著差異，與其他實驗組無顯著差異。該系列數據表明對桑樹接種AMF和不同施肥均可降低桑根黃酮含量，特別是同時施加生物有機肥及化肥會顯著減少桑根黃酮含量，且接種AMF及不同施肥對桑根黃酮含量的影響顯著于對桑樹根部多酚含量的影響。

桑枝黃酮含量僅在少數實驗組之間存在顯著差異。C組黃酮含量最高，為0.042 mg/g，H組黃酮含量最低，為0.028 mg/g，二者相差33.33%。CK組與各處理組均無顯著差異，C組、Y組、CY組和CH組黃酮含量分別較CK組增加27.27%、24.24%、15.15%和12.12%，且該水平只與H組有顯著差異。該系列數據表明，對桑樹施加化肥會顯著降低桑枝黃酮含量，而接種AMF及其他施肥對桑枝黃酮含量無顯著影響。

桑葉黃酮含量僅在少數實驗組之間存在顯著差異。CK組黃酮含量最高，為0.108 mg/g，H組黃酮含量最低，為0.082 mg/g。CK組只與H組存在顯著差異，與其他處理組無顯著差異，H組黃酮含量較CK組減少24.07%。C組、Y組、CY組、CH組和YH組均屬同一顯著水平，與CK組和H組無顯著差異。該系列數據表明，對桑樹施加化肥會顯著降低桑葉黃酮含量，而接種AMF和及其他施肥對桑葉黃酮含量無顯著影響。

2.3 桑樹根、枝、葉的多酚含量與黃酮含量的相關性分析

桑樹根、枝、葉中多酚及黃酮含量的相關系數如表5所示。桑根多酚與桑枝多酚，桑根多酚與桑葉多酚，桑枝多酚與桑葉多酚之間均具有極顯著正相關性。桑根黃酮與桑根多酚之間具有顯著正相關性，桑葉黃酮與桑枝多酚之間具有顯著負相關性，而桑樹根、枝、葉的黃酮含量之間無顯著相關性，說明接種AMF和不同施肥對桑樹根、枝、葉的黃酮含量的差異性影響顯著于對多酚含量的影響，而對桑樹多酚含量與黃酮含量之間的關聯性僅在根部有顯著正相關性。

3 討論與結論

3.1 不同施肥對桑樹根、枝、葉中多酚和黃酮含量的影響

參考相關文獻[15，16]，當植物感應根際N、P含量降低時，其根系會分泌黃酮類化合物。這可能解釋本次試驗在已有土壤肥力上，繼續施加生物有機肥及尿素、磷肥、鉀肥，會隨著CK組、H組、Y組、YH組中N、P含量的增加，反向降低桑樹根部多酚和黃酮的含量，尤其對于降低黃酮含量具有顯著影響。相關研究[17，18]指出，過量施肥特別是過量施用化肥會造成植物減少合成次生代謝產物，而適量施加生物有機肥則能顯著促進植物總黃酮的積累。這可能解釋本次試驗中僅施加化肥組相對其他處理組會顯著降低桑樹枝、葉中多酚及黃酮的含量。

3.2 接種AMF和不同施肥對桑樹根、枝、葉中多酚和黃酮含量的影響

根系是植物直接與土壤接觸和交換營養的主要器官，根系的生命活動基于長期進化，能夠適應并改變其所接觸的土壤環境[11]。在植物根系與土壤環境的交互作用中，特別是微生物侵染植物及植物自身防護的相互作用中，植物占據主導地位，可通過次生代謝分泌多酚化合物，有效抵御土壤中的真菌、細菌等土壤微生物[19]。土壤微生物是土壤的重要環境因子，會對植物的營養吸收和次生代謝產生正向或負向的影響[20，21]。有研究表明，AMF共生可能是植物適應低P環境而演化出的獲取P營養的一種策略[22]。AMF能在植物根部皮層形成與植物交換營養的叢枝結構，其細胞膜上有P和N轉運蛋白，其他微量營養元素也能被AMF富集并傳遞給植物[23，24]。在本次試驗中，CK組、CH組、CY組和C組桑根多酚及桑根黃酮含量依次減少，這種變化趨勢可能與土壤中營養含量有關，當土壤養分含量較低時，AMF會與桑樹形成寄生或競爭關系，此時桑樹因攝取養分不足而無法合成多酚等活性成分[25]；當土壤養分含量充分時，AMF可與桑樹形成互惠共生關系，桑樹可從土壤中攝取更多的養分而減少合成多酚及黃酮[19]。CY組、C組、CH組的桑樹枝、葉中多酚和黃酮的含量均高于CK組，但是各實驗組之間并無顯著差異，相關具體機理尚不明確，有待進一步探究。

參考文獻：

[1] 姜玥，劉洋洋，田海濤，等.桑屬植物中異戊烯基黃酮類化合物及其藥理活性研究進展[J].中草藥，2022，53（21）：6 948-6 958.

[2] 徐國前，張振文，郭安鵲，等.植物多酚抗逆生態作用研究進展[J].西北植物學報，2011，31（2）：423-430.

[3] 賀水花，楊玲.新疆特色植物藥桑多酚的研究進展[J].食品研究與開發，2021，42（20）：167-172.

[4] 鄧真華，杜賢明，王軍文，等.果桑專用有機活性肥對粵椹大10產量和品質的影響[J].廣西蠶業，2021，58（4）：25-28.

[5] 宋志姣，甘春雁，李德煥，等.保山地區12個桑樹品種（系）的綜合評價[J].經濟林研究，2022，40（1）：169-177.

[6] 王然，徐章逸，李佳玥，等.桑樹桑黃抗氧化菌株篩選及植物激素對胞內黃酮的影響[J].食用菌學報，2020，27（3）：61-67.

[7] Jiaying L ，Yawei W ，Haitao D ， %et al.%Effects of Intercropping between Morus alba and Nitrogen Fixing Species on Soil Microbial Community Structure and Diversity[J].Forests，2022，13（9）：1 345.

[8] 趙珮，黃傳書，唐小平，等.不同施肥方案對果葉兼用桑樹生長及桑果品質的影響[J].蠶學通訊，2020，40（4）：1-6.

[9] 董朝霞，于翠，莫榮利，等.不同施肥和樹形處理對設施果桑果實品質及土壤微生物功能多樣性的影響[J].北方蠶業，2021，42（4）：8-14.

[10] Hongmiao W ，Changxun F ，Antonino M ， %et al.%Editorial： Rhizosphere conversation among the plant-plant microbiome-soil under consecutive monoculture regimes[J].Frontiers in Microbiology，2022，13，1061427.

[11] 周云龍，劉全儒.植物生物學（第4版）[M].北京：高等教育出版社，2016：67-69.

[12] 杜麗建. 接種3種叢枝菌根真菌對桑樹‘特優2號’生長發育的影響[D].南充：西華師范大學，2023.

[13] 占鵬飛，趙輝，霍進喜，等.桑葉多酚的提取方法優化及應用研究[J].蠶桑通報，2023，54（1）：10-17.

[14] 江念，萬佐璽，陳根洪，等.正交試驗法優化3種烏蘞莓屬植物中黃酮和多糖的水提醇沉工藝[J].中成藥，2016，38（10）：2 281-2 284.

[15] Cesco S ，Mimmo T ，Tonon G ， %et al.%Plant-borne flavonoids released into the rhizosphere： impact on soil bio-activities related to plant nutrition. A review[J].Biology and fertility of soils：2012，48（2）：123-149.

[16] Kumar A G ，Kumar S ，Bhardwaj R ， %et al.%Recent advancements in multifaceted roles of flavonoids in plant-rhizomicrobiome interactions[J].Frontiers in Plant Science，2024，14，1297706.

[17] 馮玉喜，白彥霞，丁耀錄，等.不同類型肥料對當歸產量和品質的影響[J].甘肅農業大學學報，2023，58（6）：66-74.

[18] 郭蘭萍，王鐵霖，楊婉珍，等.生態農業--中藥農業的必由之路[J].中國中藥雜志，2017，42（2）：231-238.

[19] B.B.布坎南，W.格魯伊森姆，R.L.瓊斯.植物生物化學與分子生物學（第二版）[M].瞿禮嘉，等譯.北京：科學出版社，2021：1 124-1 129.

[20] 方榮祥.植物與生物相互作用總論[M].北京：科學出版社，2023：460-464，471-475.

[21] Chenghong X ，Chunyun X ，Jinqiang Z ， %et al.%Soil Microbial Communities Affect the Growth and Secondary Metabolite Accumulation in Bletilla striata （Thunb.） Rchb. f.[J].Frontiers in Microbiology，2022，13，916418.

[22] Jincai S ，Boyu Z ，Shuang Z， %et al.%A phosphate starvation response-centered network regulates mycorrhizal symbiosis.[J].Cell，2021，184（22）：5527-5540.e18.

[23] Caxl R F，Emma W G ，Yugandhar B， %et al.%Carbon availability triggers fungal nitrogen uptake and transport in arbuscular mycorrhizal symbiosis[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2012，109（7）：2 666-2 671.

[24] 薛英龍，李春越，王蓯蓉，等.叢枝菌根真菌促進植物攝取土壤磷的作用機制[J].水土保持學報，2019，33（6）：10-20.

[25] Jiang Y ，Wang W ，Xie Q ， %et al.%Plants transfer lipids to sustain colonization by mutualistic mycorrhizal and parasitic fungi[J].Science，2017，356（6343）：1 172-1 175.