鈣鎂鉀離子混合物對水體中幾種重金屬離子毒性的影響及作用機理

摘要：為明確水體中常見的鈣鎂鉀離子混合物對重金屬離子Cu²⁺、Zn²⁺、Cr⁶⁺、Cd²⁺和Fe³⁺毒性的影響，以明亮發光桿菌 T3（Photobacterium phosphoreum T3）為受試生物，進行急性毒性測試并通過生化指標及核心發光基因表達量變化進行機理解析。結果表明：單一重金屬離子對明亮發光桿菌T3的毒性大小為Zn²⁺gt;Cd²⁺gt;Cu²⁺gt;Fe³⁺gt;Cr⁶⁺，在添加不同濃度Ca²⁺-Mg²⁺-K⁺混合液后重金屬離子的毒性降低，當Ca²⁺、Mg²⁺和K⁺質量濃度分別為13.40、8.00 和26.20 mg/L時，聯合毒性最弱；重金屬離子質量濃度較低（lt;2.0 mg/L）時，重金屬離子與Ca²⁺-Mg²⁺-K⁺混合液之間呈拮抗作用，并出現明顯的興奮刺激效應；隨著重金屬離子質量濃度的增加，聯合作用逐漸轉為加和作用；Ca²⁺-Mg²⁺-K⁺混合液的加入使細胞內活性氧質量下降，超氧化物歧化酶活性以及還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸質量上升，使得菌體抗氧化能力增強，并刺激氧化還原反應來提升能量供應水平，從而降低金屬離子的毒性。該研究可為實際水體中混合重金屬離子的毒性評估和調控提供數據參考。

關鍵詞：重金屬離子；聯合毒性效應；興奮刺激效應；明亮發光桿菌T3

中圖分類號：X826；TQ13 文獻標志碼：A

DOI：10.7652/xjtuxb202411018 文章編號：0253-987X（2024）11-0185-11

Effect and Mechanism of Calcium-Magnesium-Potassium Ion Mixtures on Toxicity of Heavy Metal Ions in Water

ZHANG Ruixue，WANG Dan，ZHOU Yanhong，ZHANG Jiahuan，LI Shanshan，XU Hao

（School of Energy and Power Engineering，Xi’an Jiaotong University，Xi’an 710049，China）

Abstract：In order to determine the effect of common calcium-magnesium-potassium ion mixtures in water on the toxicity of heavy metal ions，such as Cu²⁺，Zn²⁺，Cr⁶⁺，Cd²⁺ and Fe³⁺，acute toxicity tests are carried out using Photobacterium phosphorium T3 as the tested organism. Mechanistic analysis is performed through biochemical indicators and changes in the expression levels of core luminescent genes. The results indicate that the toxicity of individual heavy metal ions to the bioluminescent bacterium T3 follows the order：Zn²⁺gt;Cd²⁺gt;Cu²⁺gt;Fe³⁺gt;Cr⁶⁺. The toxicity of heavy metal ions decreases after the addition of different concentrations of Ca²⁺-Mg²-K⁺ mixed solution，with the weakest combined toxicity observed when the mass concentrations of Ca²⁺，Mg²⁺，and K⁺ are 13.40，8.00，and 26.20 mg/L，respectively. Moreover，when the concentration of heavy metal ions is low （lt;2.0 mg/L），an antagonistic effect is observed between the heavy metal ions and the Ca²⁺-Mg²⁺-K⁺ mixture，accompanied by a significant stimulating effect. As the concentration of heavy metal ions increases，the combined action gradually shifts towards an additive effect. The addition of Ca²⁺-Mg²⁺-K⁺ mixed solution leads to a decrease in intracellular reactive oxygen species levels，an increase in superoxide dismutase activity and the content of reduced nicotinamide adenine dinucleotide，enhancing the bacterium’s antioxidant capacity and stimulating redox reactions to improve energy supply levels，thereby reducing the toxicity of metal ions. The study can provide data reference for the toxicity evaluation and regulation of mixed heavy metal ions in actual water bodies.

Keywords：heavy metal ions；combined toxicity；hormesis；Photobacterium phosphoreum T3

近年來，科技進步帶來的工業迅速發展使水體質量不斷惡化，中國生態環境部公布的《第二次全國污染源普查公報》中表示，2017年全國重金屬排放量182.54 t，七大流域（長江、黃河、珠江、松花江、淮河、海河、遼河）重金屬排放量154.94 t。由于重金屬無法被微生物降解，并且會通過食物鏈積蓄在人體內，因此重金屬對生態環境及人類生活都產生了較為嚴重的影響^［1-3］。根據《地表水環境質量標準》（GB 3838—2002），Cu²⁺、Zn²⁺、Cr⁶⁺、Cd²⁺、Fe³⁺作為污染影響程度較高的重金屬離子值得被關注，其質量濃度都被要求在1.0 mg/L以下^［4］。作為保證天然水體滲透壓必不可少的Ca²⁺、Mg²⁺和K⁺，受人類活動影響在水體中的濃度不斷增加，這一方面會對生物造成不利影響，另一方面也會對重金屬離子在生物體內的毒性產生影響^［5-8］。為此，選擇合適的方式去探究Ca²⁺、Mg²⁺、K⁺和重金屬離子之間的相互作用是十分重要的。

發光細菌作為一類能夠在生長過程中發出熒光的細菌，當其接觸到有毒物質后，菌體的正常代謝及發光系統會受到影響，從而使發光強度發生變化，因此可以用發光細菌確定污染物的毒性^［9-10］。同時，通過檢測菌體的生化指標及熒光素酶核心基因轉錄水平的變化可以進行毒理分析。對混合物進行毒性評估時，其聯合毒性并不是簡單的單一污染物的毒性加和，各物質之間的相互作用可以被分為拮抗作用、相加作用、協同作用和獨立作用^［11-13］。為明確多種污染物的聯合毒性類型，學者們提出了幾種研究模型來預測污染物的聯合毒性，主要包括濃度加和（CA）模型、獨立作用（IA）模型和兩階段（TSP）模型。CA模型和TSP模型更適合多組分混合體系的聯合作用評價，但它們會存在不能預測的“盲區”。而IA模型作為根據各組分單獨存在時在某濃度引起的效應計算得到該濃度下混合物的效應總和來確定具體的聯合毒性效應的模型，其計算相對簡便，適用性較強，故本文選擇該模型作為預測模型^［14-15］。

為探究Ca²⁺-Mg²⁺-K⁺混合物對水體中的重金屬離子Cu²⁺、Zn²⁺、Cr⁶⁺、Cd²⁺、Fe³⁺的毒性影響，本研究利用明亮發光桿菌T3（Photobacterium phosphoreum T3）作為毒性測試菌體，并利用IA模型預測聯合毒性，判斷混合物的聯合毒性效應類型。進一步通過測定總蛋白（TP）、活性氧（ROS）、超氧化物歧化酶（SOD）、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和基因轉錄水平等指標的變化來闡述重金屬離子混合污染物的潛在機理，以期為評價多種重金屬離子混合污染的潛在風險提供數據支撐。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

實驗菌種選用明亮發光桿菌T3變種（實驗室保藏菌種）^［16］，待測金屬化合物及標準液均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，純度不低于99.9%，其余化學試劑為分析純。

1.2 金屬樣品液的配制

單一重金屬溶液的配制：設置實驗濃度區間，最低質量濃度設為0.1 mg/L，Cu²⁺、Zn²⁺、Cr⁶⁺、Cd²⁺、Fe³⁺最高質量濃度分別設為20、10、100、30、20 mg/L。金屬液樣品中添加質量分數為3%的NaCl溶液以保證菌體的發光亮度。

混合金屬溶液的配制：根據單一Ca²⁺、Mg²⁺和K⁺對菌體作用的濃度-效應曲線，利用等效應固定濃度比射線法，按半抑制濃度等效應固定濃度比配制Ca²⁺、Mg²⁺、K⁺混合液（簡稱CMK）。以Mg²⁺為基準取菌體發光抑制率分別為0%、50%、100%時的濃度并計算Ca²⁺、K⁺的濃度，將其混合后作為低、中、高3種濃度混合液（簡稱為LCMK、MCMK、HCMK），此時混合液總效應為50%^［17-20］，具體濃度設置見表1。

1.3 明亮發光桿菌T3的急性毒性檢測

適宜條件下培養明亮發光桿菌T3（簡稱T3菌）并在液體培養基中傳代^［16］，作為測試菌液待用，使菌液的光密度保持為1.0左右，此時相對發光值約為1.5×10⁹。根據《水質急性毒性的測定發光細菌法（GB/T 15441—1995）》進行待測樣的15 min急性毒性測試。測試菌液與待測樣體積比為1∶2^［21］。

1.4 毒性機理相關指標的檢測

將菌體破碎并離心（4℃，5 000 r/min）后取上清作為待測液。分別用試劑盒測定樣品的總蛋白濃度、活性氧（ROS）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）含量。為更直觀地指示各生化指標的變化，采用測試樣品與空白對照的指標比（η）即相對質量或相對活性作為評價指標^［22］，計算方法如下所示

η=P/P₀（1）

式中：P為實驗組生化指標質量或活性；P₀為對照組生化指標質量或活性。當ηgt;1時，表示該生化指標含量或活性上升，反之則表示降低。

基于急性毒性檢測方法，將測試體系等比例擴大至30 mL。將菌體離心（4℃，5 000 r/min）洗滌后，用試劑盒依次進行菌體的總核糖核酸提取、反轉錄以及實時熒光定量聚合酶鏈式反應。以16 S rRNA為內參基因對目標基因的轉錄水平進行相對定量，通過

mRNA相對表達量判斷基因轉錄水平的變化，當mRNA相對表達量大于1時基因表達水平表現為上調，當mRNA相對表達量小于1時基因表達水平表現為下降^［23］。

1.5 數據處理

1.5.1 濃度-效應曲線擬合模型

采用發光抑制率來量化毒性效應。為了更好地評價測試樣品的毒性，本研究選擇擬合模型來計算半抑制濃度。通過使用軟件Graphpad Prism 9.0選擇四參數Logistic（4PL）模型對實驗數據進行非線性擬合，模型表達式為

式中：Y為樣品引發的毒性效應；X為樣品濃度；Y_max為樣品引發的毒性效應最大值；Y_min為樣品引發的毒性效應最小值；k為擬合曲線的斜率；C為樣品引發的毒性效應為50%時的反應物濃度。

1.5.2 聯合毒性評價方法

采用IA模型評價混合物聯合毒性^［15］，具體公式為

式中：I（C_mix）為混合物總發光抑制率；n為混合物中存在的組分總數；I（C_i）為第i個組分單獨存在且濃度為C時的發光抑制率。

根據實驗數據以及式（3），計算混合物在不同濃度下的毒性效應預測值及95%置信區間，利用4PL模型對IA模型預測數據（I（C_mix））和實測數據進行擬合，根據擬合所得的兩條曲線的相對位置來評價混合物的聯合毒性^［24］（見圖1）。其中，a₁～a₂濃度區間內，實測曲線位于IA預測曲線之上，聯合毒性表現為協同作用；類似地，在a₂～a₃濃度區間內聯合毒性表現為相加作用；在a₃～a₄濃度區間內聯合毒性表現為拮抗作用。

1.5.3 顯著性差異分析方法

實驗結果以平均值±標準差來表示，并利用Graphpad Prism 9.0進行t檢驗，分析實驗組和對照組是否存在顯著性差異。當P≤0.05時表示有統計學差異，P≤0.01 表示有顯著統計學差異，P≤0.001表示有非常顯著的統計學差異，P≤0.000 1表示有極其顯著的統計學差異。

2 結果與討論

2.1 不同濃度CMK對重金屬離子的急性毒性影響

2.1.1 添加CMK后重金屬離子的毒性效應

Ca²⁺、Mg²⁺、K⁺是天然水體中占比較大的3種離子，為了明確不同濃度的CMK混合液對其他重金屬離子毒性的影響，進行15 min急性毒性測試^［6］。測試結果表明，LCMK、MCMK和HCMK對T3菌的發光抑制率均小于0，分別為-18%、-26%和-19%，說明3種濃度的CMK混合液都會對T3菌產生發光刺激作用，其刺激效應大小為MCMKgt;LCMK≈HCMK。將毒性測試數據使用4PL模型進行擬合，其對應的濃度-效應曲線如圖2所示。

5種重金屬離子添加CMK前后的半抑制濃度見表2，可以發現，重金屬離子單一毒性大小為Zn²⁺gt;Cd²⁺gt;Cu²⁺gt;Fe³⁺gt;Cr⁶⁺；5種重金屬離子即使在濃度很低時也表現出抑制T3菌發光的毒性作用，但并沒有呈現出濃度較低時刺激發光，而濃度較高時抑制發光的低促高抑的毒性興奮效應（Hormesis）現象^［11］。對于同一重金屬離子，在測試濃度范圍內，發光抑制率隨著濃度的增加而增加，直至抑制率達到100%，此時毒性作用達到最大，表現出一定的濃度依賴性，但當不同濃度的CMK添加到重金屬離子溶液后，各測試組均呈現出毒性興奮效應。

5種重金屬離子隨濃度變化而產生的毒性效應變化趨勢并不完全相同，其中Cu²⁺、Zn²⁺和Cd²⁺的毒性效應變化趨勢較為一致。添加鈣鎂鉀離子混合物后的濃度-效應曲線均低于未添加鈣鎂鉀離子混合物的曲線（圖2（a）、2（b）和2（d）），說明加入CMK后混合離子的半抑制濃度大于單一離子的半抑制濃度，對菌體的毒性降低。特別是在添加MCMK后，在重金屬離子濃度較低（0.1 mg/L）時，Cu²⁺、Zn²⁺和Cd²⁺均出現了明顯的興奮效應現象，此時的發光抑制率分別為-21.67%、-24.00%和-8.41%。添加CMK后各重金屬離子的最大發光刺激效應與CMK混合液單一作用時相近，此時單一重金屬離子的毒性較小，發光抑制率約為0%，這與Masoud等的研究結果^［25］相似。類似地，在Li等對藥物三七的研究中發現，一方面由于Ca²⁺和Cd²⁺具有相似的離子半徑和相似的化學性質，二者會競爭吸附位點，當溶液中存在Ca²⁺和Cd²⁺時，Ca²⁺可以顯著降低植物對Cd²⁺的吸收，從而降低Cd²⁺的毒性；另一方面Ca²⁺后會促進CC（鈣通道蛋白）、ATP（腺嘌呤核苷三磷酸）酶和CAXs（陽離子/H⁺反轉運蛋白）活性的增加，從而有效增加Cd²⁺的外排和解毒^［26］。

Cr⁶⁺的毒性效應變化趨勢與上述3種重金屬離子并不相同（圖2（c））。Cr⁶⁺與不同濃度的CMK混合液的半抑制濃度大小順序為Cr⁶⁺-MCMK≈Cr⁶⁺gt;Cr⁶⁺-HCMKgt;Cr⁶⁺-LCMK，說明加入MCMK后混合液的半抑制濃度大于單一離子的半抑制濃度，對菌體的毒性降低，這與Cu²⁺、Zn²⁺和Cd²⁺的結論一致；但加入LCMK和HCMK后混合液的半抑制濃度小于單一離子半抑制濃度，呈現為對菌體的聯合毒性加強。這可能是因為Cr⁶⁺質量與CMK之間競爭關系較小，毒性效應主要表現為獨立作用^［26-27］。在分別添加HCMK和MCMK后，Cr⁶⁺質量濃度較低時同樣出現興奮效應，最大發光刺激效應分別為-22.25%和-10.34%。測試的重金屬離子中，Fe³⁺（圖2（e））在添加CMK混合液后毒性變化最小，各待測樣的半抑制濃度大小為Fe³⁺-HCMKgt;Fe³⁺-LCMKgt;Fe³⁺-MCMKgt;Fe³⁺，即加入CMK混合液后其半抑制濃度大于單一離子，對菌體的毒性降低。隨著Fe³⁺濃度的增加，對T3菌的毒性呈先降低后增加的趨勢。值得注意的是，當Fe³⁺質量濃度小于9 mg/L時，其濃度的變化對毒性的影響較小；當濃度在9～16 mg/L時，Fe³⁺毒性隨濃度迅速增加。與He等^［27］的研究類似，在Caco-2細胞中，Fe³⁺質量濃度低于1.5 mmol/L時，細胞可以使用內在的抗氧化酶（過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化酶）抵抗Fe³⁺的氧化損傷，Fe³⁺質量濃度高于1.5 mmol/L時，Fe³⁺會降低細胞抗氧化基因的表達，同時能夠與次氮基三乙酸脂結合誘導脂質過氧化，降低細胞的膜穩定性，進一步增加氧化損傷。

2.1.2 重金屬離子與不同濃度CMK混合液的聯合毒性類型

為了進一步評價CMK的存在對重金屬離子毒性的影響以及CMK和重金屬離子之間的聯合毒性類型，利用IA模型計算添加CMK后的預期數值，并基于4PL模型對實測值和預期值進行擬合得到IA擬合曲線，如圖3所示。

由圖3（a）～（c）可見，Cu²⁺-LCMK的實測曲線與IA曲線有明顯的交叉，表明聯合作用類型隨濃度的升高發生了變化，從低濃度時的拮抗作用轉變為高濃度時的協同作用。這與圖2（a）中的結果一致，即Cu²⁺濃度小于交叉點濃度（5.06 mg/L）時LCMK的添加會降低毒性，反之會增大毒性。Cu²⁺-MCMK和Cu²⁺-HCMK在整個測試濃度區間同樣表現為拮抗作用，且這種拮抗作用的強度隨著Cu²⁺濃度的增加呈先增后減的趨勢，其中Cu²⁺-MCMK表現出的拮抗作用強度最大，這與MCMK的添加降低毒性效果最大的結論一致。目前已有研究表明，水中Ca²⁺濃度的增加可以降低Cu²⁺對水生生物的毒性效應，這與轉運蛋白之間的競爭性結合有關。Peter等^［28］的研究表明，銅會競爭性地抑制鈣結合位點，例如鈣激活鉀通道（K-Ca），當Ca²⁺質量濃度為50～100 mg/L時，暴露在Cu²⁺中的鯰魚的死亡率下降。

對于Zn²⁺與Cd²⁺來說，在添加不同質量濃度的CMK之后，同樣在整個測試濃度區間表現出明顯的拮抗作用（圖3（d）～（i））。造成該結果的原因可能是Zn²⁺在生物體內與Ca²⁺、Mg²⁺之間存在競爭關系，這一結果與Paylar等^［29］的研究一致，即水體中的Ca²⁺、Mg²⁺能夠降低暴露在Zn²⁺下大型溞的死亡率，與Zn²⁺之間為拮抗作用，而Cd²⁺會爭奪Ca²⁺通道。研究表明Cd²⁺與Ca²⁺在生物體內會有顯著的拮抗作用，其原因是Cd²⁺與Ca²⁺的半徑相似，因此會競爭Ca²⁺結合位點，從而抑制Cd²⁺被吸收^［30-31］。Zn²⁺與Cd²⁺拮抗作用強度的變化與Cu²⁺一致，即隨著重金屬離子濃度的增加而先增加后減小，這一變化趨勢與降低毒性效應的變化相符。觀察其拮抗作用的強度可以發現，Zn²⁺與Cu²⁺規律一致，添加MCMK表現出的拮抗作用的強度最大，在1.8 mg/L時對菌體的毒性降低的程度最大，為115%；而Cd²⁺添加MCMK后表現出的拮抗作用的強度最小，這與添加MCMK后對毒性的降低效果表現一致。Fe³⁺與不同濃度的CMK之間（圖3（j）～（l））同樣表現為拮抗作用，拮抗作用的強度隨著Fe³⁺濃度的增加呈逐漸增加的趨勢。與其他幾種重金屬離子相比，加入CMK混合液后帶來的毒性變化較小，并且添加MCMK后拮抗作用的強度最低，降低毒性的效果也最差。

如圖3（m）～（o）所示，Cr⁶⁺與LCMK的聯合毒性作用表現為協同作用，且協同作用的強度隨著Cr⁶⁺濃度的增加先增加后減小，說明混合液的毒性隨之先增后減；添加HCMK后的實測曲線與IA曲線基本重疊，說明Cr⁶⁺與CMK表現為簡單的加和作用，與圖2（c）中的結論一致。這種差異究其原因可能是引起毒性作用的途徑不同，通常Cr⁶⁺經由磷酸鹽通道進入細胞內，與CMK競爭關系較弱，在LCMK下，Cr⁶⁺主要集中在細胞膜附近并改變細胞膜的通透性并對菌體造成損傷；而隨著CMK濃度的增加，在加入MCMK后由于Mg²⁺能夠降低磷酸鹽含量并促進Cr⁶⁺進入細胞內，此時Cr⁶⁺與細胞內還原劑反應生成Cr³⁺，因此混合液對菌體的毒性比單一金屬離子的毒性低。添加MCMK后在整個濃度區間為拮抗作用，并且拮抗作用的強度也隨著Cr⁶⁺濃度的增加而先減后增，與其他濃度的CMK相比達到了最大的拮抗作用的強度^［32-34］。

以上結果表明：添加CMK后混合液的毒性與單一重金屬離子存在時相比毒性降低，其原因可能與轉運蛋白之間的競爭性結合有關。同時CMK與低濃度的重金屬離子共存時會產生興奮效應現象，刺激T3菌發光；重金屬離子濃度較高時，混合液引起的發光抑制率基本為100%，毒性較大且IA擬合曲線與實測曲線的重合程度較高，表明此時CMK與測試重金屬離子之間的相互作用較弱，更傾向于簡單的加和作用。值得注意的是，MCMK對重金屬離子毒性的影響最大，因此為了進一步探究CMK混合液與重金屬離子的聯合毒性效應機理，選擇添加MCMK進行后續的機理研究。

2.2 MCMK影響重金屬離子毒性的機理研究

2.2.1 添加MCMK后重金屬離子對生化指標的影響

基于前面的實驗結果，取重金屬離子為0.1 mg/L（低濃度），以及混合液毒性效應為50%半抑制濃度和100%全抑制濃度處重金屬離子的濃度點測定添加CMK前后菌體內ROS、SOD和NADH等生化指標的變化，并通過總蛋白含量進行均一化。

添加MCMK前后各重金屬離子對T3菌生化指標的影響如圖4所示，圖中*表示P≤0.05，**表示P≤0.01，***表示P≤0.001，****表示P≤0.000 1。加入重金屬離子后，T3菌體內ROS的相對質量隨著重金屬離子濃度的增加呈先增后減的趨勢，其中Fe³⁺濃度變化導致的ROS相對質量變化微弱，η最高僅為1.27。當5種重金屬離子質量濃度為0.1 mg/L時，添加MCMK后菌體內ROS的相對質量與未加CMK相比均下降，表明此濃度下MCMK的添加有利于降低菌體內的ROS相對質量。ROS作為自然代謝過程中產生的分子，同樣也是毒物的效應分子，當菌體周圍存在污染有害物質時，ROS會迅速增加，當抗氧化能力與其不平衡時會誘發氧化應激，并對菌體造成各種損傷^［35-36］，意味著ROS的相對質量與毒性可能具有相關性，此時ROS相對質量的下降可能是圖2在低濃度下出現興奮效應現象的原因之一。在半抑制濃度處的濃度點，除Fe³⁺外添加MCMK后菌體內的ROS相對質量降低，并且降低程度比低濃度下更為顯著。濃度為全抑制濃度時與未添加CMK的菌體相比添加CMK后ROS相對質量明顯上升，此時重金屬離子與MCMK的相互作用類型為簡單加和作用，毒性增加，而Cr⁶⁺在此時引起的ROS相對質量從1.84降為1.69（圖4（m）），與前面的毒性變化一致。

SOD作為生物體內抗氧化金屬酶是ROS的清除劑之一，在機體氧化與抗氧化平衡中起到了重要作用^［32］。在未添加CMK時，T3菌體內的SOD活性隨著5種重金屬離子濃度的增加先增后降，其變化趨勢與ROS質量變化類似。5種重金屬離子在0.1 mg/L時的η約為1，表明此時重金屬離子的添加引起的變化微弱。添加MCMK后菌體的SOD活性都出現了明顯的上升，并且在半抑制濃度處的SOD活性顯著高于0.1 mg/L時的SOD活性。SOD活性的上升，有利于降低細胞內的ROS質量，并減少由氧化應激反應所造成的細胞損傷，這與ROS的質量變化相關聯。T3菌接觸濃度為全抑制濃度處的待測液后，SOD活性同樣大幅度的增加，但ROS質量反而上升，這種差異可能是因為ROS相對質量并非受SOD單獨影響。特別地，全抑制濃度下Cr⁶⁺的SOD活性漲幅弱于其他重金屬離子（圖4（n）），這可能是由于Cr⁶⁺在胞內會被各類還原劑還原為Cr³⁺，其中也包含了SOD^［32］。從上述結果可以推測，SOD活性的上升可能是重金屬離子毒性被弱化的原因之一。

NADH作為氧化還原反應的重要底物之一，同時也是超氧化物和其他ROS形成的關鍵底物，能夠在NADH 氧化酶或線粒體的電子傳遞鏈中充當電子供體，而ROS能夠打開線粒體通透性轉換孔，允許NADH自由通過細胞質，因此ROS和NADH之間的相互作用對維持和破壞細胞內氧化還原穩態具有重要意義^［37］。在加入單一重金屬離子后，NADH相對質量變化同樣呈先增加后下降的趨勢，這與ROS相對質量和SOD活性在加入單一重金屬離子后的變化相似。添加MCMK后，胞內的NADH相對質量上升，變化幅度與SOD活性的變化幅度相近，表明CMK的添加能夠促進NADH的生成，猜測這也是重金屬離子毒性能夠被弱化的原因之一。

通過對T3菌生化指標的分析，誘導ROS產生引起氧化應激反應是重金屬離子對T3菌的毒性作用的原因之一。添加MCMK后，菌體內的NADH相對質量增加，SOD活性也大幅上升，這可能使得菌體的抗氧化能力增強，降低ROS的相對質量，降低重金屬離子造成氧化損傷，最終呈現出毒性削弱的現象。

2.2.2 添加MCMK后重金屬離子對發光核心基因轉錄水平的影響

為了進一步探究CMK造成的毒性弱化現象之間可能的聯系，對添加MCMK后金屬離子對T3菌體內發光關鍵基因luxB的轉錄水平進行了測試，以信使核糖核酸（mRNA）的相對表達量來表示luxB的轉錄水平，結果如圖5所示。

對于單一重金屬離子存在時，Cu²⁺、Cd²⁺和Fe³⁺對T3體內luxB的轉錄水平影響相似。隨著重金屬離子濃度的增加，luxB轉錄水平呈先降低后增加的趨勢，半抑制濃度處luxB的轉錄水平明顯下調。單一Zn²⁺處理后，luxB轉錄水平隨著重金屬離子濃度的增加不斷降低，并且質量濃度為4 mg/L和10 mg/L時其轉錄水平下降。添加MCMK后，luxB的轉錄水平在低濃度重金屬條件下明顯降低，只有在全抑制濃度下菌體的luxB轉錄水平升高。而Cr⁶⁺則與之相反，在半抑制濃度（20.0 mg/L）處的轉錄水平呈最大值，并且在添加MCMK后，0.1 mg/L時的轉錄水平有所升高，與其他重金屬離子的變化并不相同。將結果與菌體的發光響應相比較（圖2），luxB轉錄水平與發光響應隨重金屬離子濃度的變化呈現的規律性并不對應，這表明重金屬離子并不會通過改變核心發光基因luxB的表達水平來引起毒性。

3 結 論

本研究基于明亮發光桿菌T3進行急性毒性測試，結合T3菌體內生化指標（ROS、SOD、NADH）及發光核心基因轉錄水平的變化，探究Ca²⁺-Mg²⁺-K⁺混合液對Cu²⁺、Zn²⁺、Cr⁶⁺、Cd²⁺、Fe³⁺的毒性影響和聯合毒性作用機理，主要結論如下。

（1）單一重金屬離子對明亮發光桿菌T3的毒性大小為Zn²⁺gt;Cd²⁺gt;Cu²⁺gt;Fe³⁺gt;Cr⁶⁺，重金屬離子單獨作用時沒有興奮效應現象，而在添加不同質量濃度CMK后則會出現明顯的興奮效應現象，其中添加MCMK后的興奮效應現象最為顯著。

（2）當重金屬離子濃度較低（0.1 mg/L）時，其與CMK混合液呈現出拮抗作用，也就是CMK會降低單一重金屬離子對菌體的損傷，毒性下降。拮抗作用的強度隨著重金屬離子濃度的增加而降低，在高濃度下更傾向于簡單的加和作用。

（3）一方面，CMK與重金屬離子之間可能存在競爭性結合轉運蛋白的情況，從而降低重金屬離子在菌體內的濃度；另一方面，添加CMK會促進菌體內的ROS質量下降，SOD活性以及NADH質量上升，此時胞內的抗氧化功能增強，并刺激氧化還原反應的進行來提升能量供應水平，從而削弱重金屬離子在菌體中的實際毒性水平。

水體中的CMK混合液在一定濃度下可能減弱重金屬離子對菌體的實際毒性，這為水體中混合污染物的毒性研究及水環境健康評價提供了數據支撐和依據。

參考文獻：

［1］AYODHYA D. Recent progress on detection of bivalent，trivalent，and hexavalent toxic heavy metal ions in water using metallic nanoparticles：a review ［J］. Results in Chemistry，2023，5：100874.

［2］HAMA AZIZ K H，KAREEM R. Recent advances in water remediation from toxic heavy metals using biochar as a green and efficient adsorbent：a review ［J］. Case Studies in Chemical and Environmental Engineering，2023，8：100495.

［3］MISHRA S，SINGH A K，SINGH J K. Ferrous sulfide and carboxyl-functionalized ferroferric oxide incorporated PVDF-based nanocomposite membranes for simultaneous removal of highly toxic heavy-metal ions from industrial ground water ［J］. Journal of Membrane Science，2020，593：117422.

［4］國家環境保護總局，國家質量監督檢驗檢疫總局. 地表水環境質量標準：GB 3838—2002［S］. 北京：中國環境科學出版社，2002.

［5］YU Zhenyang，ZHANG Jing，HOU Meifang. Time-dependent disturbances of chloride salts on overall redox reaction and luminescence in Vibrio fischeri ［J］. Chemosphere，2018，199：122-129.

［6］黃麗，朱治林，唐新齋，等. 2004—2016年中國生態系統研究網絡（CERN）臺站水中八大離子數據集 ［J］. 中國科學數據，2020，5（2）：106-118.

HUANG Li，ZHU Zhilin，TANG Xinzhai，et al. A dataset of eight ions in the water at stations of Chinese Ecosystem Research Network （CERN） during 2004-2016 ［J］. China Scientific Data，2020，5（2）：106-118.

［7］BLOETSCHER F，POLSKY C，BOLTER K，et al. Assessing potential impacts of sea level rise on public health and vulnerable populations in southeast Florida and providing a framework to improve outcomes ［J］. Sustainability，2016，8（4）：315.

［8］VASSALLO F，LA CORTE D，CANCILLA N，et al. A pilot-plant for the selective recovery of magnesium and calcium from waste brines ［J］. Desalination，2021，517：115231.

［9］LI Rongbing，REN Jiangtao，CHEN Jinxing，et al. Rapid and versatile colorimetric sensor based on luminescent bacterium for water comprehensive toxicity detection ［J］. Sensors and Actuators：B Chemical，2023，390：133958.

［10］朱文杰，鄭天凌，李偉民. 發光細菌與環境毒性檢測 ［M］. 北京：中國輕工業出版社，2009.

［11］AGATHOKLEOUS E，KITAO M，CALABRESE E J. Hormesis：a compelling platform for sophisticated plant science ［J］. Trends in Plant Science，2019，24（4）：318-327.

［12］AGATHOKLEOUS E，KITAO M，CALABRESE E J. Hormesis：highly generalizable and beyond laboratory ［J］. Trends in Plant Science，2020，25（11）：1076-1086.

［13］WANG Zhuang，ZHANG Fan，WANG Degao. Predicting joint toxicity of chemicals by incorporating a weighted descriptor into a mixture model：cases for binary antibiotics and binary nanoparticles ［J］. Ecotoxicology and Environmental Safety，2022，236：113472.

［14］ANGULO-BEJARANO P I，PUENTE-RIVERA J，CRUZ-ORTEGA R. Metal and metalloid toxicity in plants：an overview on molecular aspects ［J］. Plants，2021，10（4）：635.

［15］ALTENBURGER R，WALTER H，GROTE M. What contributes to the combined effect of a complex mixture？ ［J］. Environmental Science amp; Technology，2004，38（23）：6353-6362.

［16］王丹，周彥宏，白林明，等. 明亮發光桿菌培養的響應面優化及其對常見金屬離子的毒性評價研究 ［J］. 環境科學學報，2022，42（5）：454-464.

WANG Dan，ZHOU Yanhong，BAI Linming，et al. Optimization of culture conditions of Photobacterium phosphoreum using response surface methodology and toxicity evaluation on metal ions ［J］. Acta Scientiae Circumstantiae，2022，42（5）：454-464.

［17］BARAL U，DING Lin，CHAMLAGAIN D. Detrital zircon ages and provenance of Neogene foreland basin sediments of the Karnali River section，Western Nepal Himalaya ［J］. Journal of Asian Earth Sciences，2017，138：98-109.

［18］JIANG Liguang，YAO Zhijun，LIU Zhaofei，et al. Hydrochemistry and its controlling factors of rivers in the source region of the Yangtze River on the Tibetan Plateau ［J］. Journal of Geochemical Exploration，2015，155：76-83.

［19］LI Zongjie，LI Zongxing，SONG Lingling，et al. Environment significance and hydrochemical characteristics of supra-permafrost water in the source region of the Yangtze River ［J］. Science of the Total Environment，2018，644：1141-1151.

［20］ZHANG Yahui，LIU Shushen，SONG Xiaoqing，et al. Prediction for the mixture toxicity of six organophosphorus pesticides to the Luminescent bacterium Q67 ［J］. Ecotoxicology and Environmental Safety，2008，71（3）：880-888.

［21］國家環境保護局，國家技術監督局. 水質急性毒性的測定 發光細菌法：GB/T 15441—1995［S］. 北京：中國標準出版社，1995.

［22］LIVAK K J，SCHMITTGEN T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2^-ΔΔC_t method ［J］. Methods，2001，25（4）：402-408.

［23］YU Zhenyang，ZHANG Jing，CHEN Xiaoxue，et al. Inhibitions on the behavior and growth of the nematode progeny after prenatal exposure to sulfonamides at micromolar concentrations ［J］. Journal of Hazardous Materials，2013（250/251）：198-203.

［24］LI Yanwen，WU Xiaolian，MO Cehui，et al. Investigation of sulfonamide，tetracycline，and quinolone antibiotics in vegetable farmland soil in the Pearl River Delta area，southern China ［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2011，59（13）：7268-7276.

［25］ARDESTANI M M，VERWEIJ R A，VAN GESTEL C A M. The influence of calcium and pH on the uptake and toxicity of copper in Folsomia candida exposed to simplified soil solutions ［J］. Journal of Hazardous Materials，2013，261：405-413.

［26］LI Zuran，MEI Xinyue，LI Tao，et al. Effects of calcium application on activities of membrane transporters in Panax notoginseng under cadmium stress ［J］. Chemosphere，2021，262：127905.

［27］HE Wanling，FENG Ying，LI Xiaoli，et al. Availability and toxicity of Fe（Ⅱ） and Fe（Ⅲ） in Caco-2 cells ［J］. Journal of Zhejiang University：Science B，2008，9（9）：707-712.

［28］KHOUNNAVONGSA N，IWAI C B. Influence of water hardness on ecotoxicology of copper on aquatic biota：implication for the revision of water quality standardization in Lao PDR ［J］. International Journal of Environmental and Rural Development，2016，7（2）：12-17.

［29］PAYLAR B，ASNAKE S，SJBERG V，et al. Influence of water hardness on zinc toxicity in Daphnia magna ［J］. Journal of Applied Toxicology，2022，42（9）：1510-1523.

［30］LIAO Gengze，WANG Peijun，ZHU Jiawei，et al. Joint toxicity of lead and cadmium on the behavior of zebrafish larvae：an antagonism ［J］. Aquatic Toxicology，2021，238：105912.

［31］桂雨婷. 鈣添加對草魚鎘富集的拮抗作用機制研究 ［D］. 長沙：湖南農業大學，2019.

［32］MONGA A，FULKE A B，DASGUPTA D. Recent developments in essentiality of trivalent chromium and toxicity of hexavalent chromium：implications on human health and remediation strategies ［J］. Journal of Hazardous Materials Advances，2022，7：100113.

［33］PUSHKAR B，SEVAK P，PARAB S，et al. Chromium pollution and its bioremediation mechanisms in bacteria：a review ［J］. Journal of Environmental Management，2021，287：112279.

［34］TER BRAAKE A D，TINNEMANS P T，SHANAHAN C M，et al. Magnesium prevents vascular calcification in vitro by inhibition of hydroxyapatite crystal formation ［J］. Scientific Reports，2018，8（1）：2069.

［35］JI Xiaomeng，GUO Jiajia，MA Yeyun，et al. Quercetin alleviates the toxicity of difenoconazole to the respiratory system of carp by reducing ROS accumulation and maintaining mitochondrial dynamic balance ［J］. Toxicology and Applied Pharmacology，2024，484：116860.

［36］SUN Rongli，LIU Manman，XIONG Fei，et al. Polystyrene micro-and nanoplastics induce gastric toxicity through ROS mediated oxidative stress and P62/Keap1/Nrf2 pathway ［J］. Science of the Total Environment，2024，912：169228.

［37］JIAO Yuting，JIANG Hong，WU Wentao，et al. Dual-channel nanoelectrochemical sensor for monitoring intracellular ROS and NADH kinetic variations of their concentrations ［J］. Biosensors and Bioelectronics，2023，222：114928.

（編輯 亢列梅）