基于自噬相關的基因及CT影像特點構建腎細胞癌患者預后模型

摘要：目的 "探究自噬相關基因在腎細胞癌發展中的作用，基于自噬相關的基因及CT影像特點構建腎細胞癌患者預后模型。方法 "從TCGA數據庫下載腎透明細胞癌患者相關資料，結合自噬相關基因集，探索基于自噬相關基因的腎癌分子亞型及構建個體化自噬評分系統；通過分析TCIA數據庫中腎細胞癌患者CT資料，構建自噬相關基因風險模型及影像組學模型預測腎癌患者預后。結果 "將腎透明細胞癌分為兩種新的分子亞型，預后較差的亞型患者伴有大量免疫細胞浸潤（Plt;0.05），且臨床分級更高、分期更晚（Plt;0.05）。高自噬評分患者的腫瘤基因突變頻率明顯增加、腫瘤體積更大、更晚期、預后更差（Plt;0.05）。影像組學聯合自噬相關基因模型可較準確預測腎癌患者預后（曲線下面積0.922， 95% CI：0.852～0.993）。結論 "自噬評分高的腎癌患者預后較差，影像組學聯合自噬相關基因模型在預測腎癌患者預后中有較好前景。

關鍵詞：腎細胞癌；自噬；影像組學；預后模型

Construction of a prognostic model for renal cell carcinoma patients based on autophagy-related genes and CT imaging characteristics

LI Yaxian1， 2， WU Weizhou2， WANG Qiongren2， ZHAN Xiongyu2， ZHENG Mingxing2， TAN Wanlong1

1Department of Urology， Nanfang Hospital， Southern Medical University， Guangzhou 510515， China; 2Department of Urology， Affiliated Maoming Hospital， Southern Medical University （Maoming People's Hospital）， Maoming 525000， China

Abstract： Objective To explore the role of autophagy-related genes in the development of renal cell carcinoma and construct a prognostic model for renal cell carcinoma patients based on autophagy-related genes and CT imaging characteristics. Methods The relevant data of patients with renal clear cell carcinoma were downloaded from the TCGA database. Combined with the autophagy-related gene set， the molecular subtypes of renal carcinoma based on autophagy-related genes and the construction of an individualized autophagy scoring system were explored; by analyzing the CT data of patients with renal cell carcinoma in the TCIA database， the autophagy-related gene risk model and the imaging omics model were constructed to predict the prognosis of patients with renal cancer. Results Renal clear cell carcinoma was divided into two new molecular subtypes. Patients with poor prognosis are accompanied by a large number of immune cell infiltration （Plt;0.05）， and have higher clinical grades and more advanced stages （Plt;0.05）. Patients with high autophagy scores have significantly increased tumor gene mutation frequencies， larger tumor volumes， more advanced stages， and worse prognoses （Plt;0.05）. Radiomics combined with autophagy-related gene model can accurately predict the prognosis of patients with renal cancer （AUC： 0.922， 95% CI： 0.852-0.993）. Conclusion Renal cancer patients with high autophagy scores have a poor prognosis. Radiomics combined with autophagy-related gene model has good prospects in predicting the prognosis of patients with renal cancer.

Keywords： renal cell carcinoma; autophagy; radiomics; prognostic model

腎細胞癌（RCC）是最常見的腎惡性腫瘤，腎透明細胞癌（ccRCC）是其最主要的病理類型［1］。由于早期缺乏明顯的癥狀，大部分ccRCC患者通常是偶然被發現，約20%患者初診即為晚期［2］。闡明ccRCC發生發展機制對ccRCC防治策略以及改善疾病預后具有重要的臨床意義。

自噬作為一種II型程序性細胞死亡方式，是真核細胞生物的細胞內分解代謝過程［3］，在腫瘤進程中既可以起到抑制或促進的雙重效果。研究發現自噬發生時腎癌細胞系表現出較高的自噬水平［4］，且自噬標志物LC3高表達時可促進多種腎癌細胞系的細胞遷移［5］。動物實驗表明抑制自噬關鍵蛋白LC3B的表達可明顯抑制裸鼠腎腫瘤的生長［5］。多因素分析提示自噬效應蛋白Beclin1的表達水平與ccRCC無復發生存率呈顯著的正相關［6］，且Benlin1基因低表達患者的預后明顯差于高表達患者［7-8］。此外也有研究通過公共數據庫基于自噬相關基因建立ccRCC預后風險模型［9-10］。以上研究均提示自噬的表達水平對腎細胞癌患者的疾病進發揮了重要作用。

既往研究表明，基于病理TNM 分期等常見的臨床資料對多種腫瘤具有一定的預后預測價值，但由于個體差異，即使相同的TNM分期的患者的腫瘤微環境也可能存在較大差異，其預后也不同。腎細胞癌異質性明顯，生物學行為復雜多變［11］。90%的腎透明細胞癌存在腫瘤內及腫瘤間異質性，其中50%表現出了免疫特征的異質性［12］，因此僅靠TNM分期不足以準確評估腎癌患者的疾病進展和預后。影像組學可通過對患者影像學的采集、勾畫、分割、特征提取和量化、建模等更無創、相對廉價且便捷的方式在宏觀上展示腫瘤整體觀［13］。而基因組學則可在分子的微觀層面闡釋腫瘤的進展及相關可能的機制。因此基因聯合影像組學有助于患者分層、提供更全面的臨床特征及預后信息以指導制定精準的治療決策［14］。

目前尚未見有關量化腎細胞癌患者個體自噬表達水平及基于自噬水平的CT影像學特點評估預后的研究。本研究通過收集、分析TCGA數據庫腎透明細胞癌患者相關數據，結合患者腫瘤分級分期、預后及TCIA數據庫中影像學資料等臨床信息，探討自噬相關基因在腎正常組織與腫瘤組織中表達情況，篩選出具有差異的自噬相關基因及影像組學特征，根據自噬相關基因特征構建新的腎癌分子亞型并分析其免疫浸潤情況，隨后構建基于個體的自噬水平的評分系統，探究自噬評分與腫瘤突變、腫瘤體積、預后的相關性。通過構建自噬相關基因和CT影像特征構建RCC預后模型，探討該模型在RCC癌患者中的應用價值，為輔助腎癌患者預后的評估及精準靶向治療提供科學實驗依據和理論基礎。

1 "資料與方法

1.1 "數據來源

在TCGA數據庫（https：//portal.gdc.cancer.gov/）中下載腎透明細胞癌患者的腫瘤組織及癌旁正常組織的轉錄組、體細胞突變組和臨床資料。自噬相關基因集來源于人類自噬數據庫（http：//www.autophagy.lu/clustering/）。在TCIA數據庫（http：//www.cancerimagingarchive.net/）中下載TCGA中腎透明細胞癌患者的CT影像學資料，測量病灶在CT中最長的長徑、短徑、高度，計算腫瘤體積。腫瘤體積計算公式：

體積=長×寬×高×[π6]。

從TIMER2.0數據庫（http：//timer.cistrome.org//）下載TCGA-KIRC隊列的免疫細胞浸潤數據。

1.2 "TCIA數據庫影像圖像處理

參考既往研究［15］方法，從TCIA數據庫下載TCGA-KRIC患者中具有腹部增強CT且成像質量良好的圖像，納入包括平掃期、皮質-髓質期、實質期、排泄期的病例，排除僅有平掃或僅有增強CT圖像的病例，結果共納入96例。由2位從業10年以上的高年資影像科醫師及泌尿外科醫師手動在皮質-髓質期圖像距離腫瘤邊緣2 mm沿著腫瘤的邊界勾畫感興趣區域，過程需避開腎周脂肪、正常腎組織。使用3D-Slicer 軟件及PyRadiomics包提取包括一階統計特征、形狀特征、灰度游程矩陣特征、灰度共生矩陣特征、灰度相關矩陣特征、灰度大小區域矩陣特征和鄰域灰度差異矩陣特征等影像組特征。通過Z-score將影像組特征數據標椎化，并將96例患者均分為訓練組及驗證組，隨后聯合自噬相關基因構建預后模型。

1.3 "ccRCC患者自噬相關的基因與預后的相關性及其表達情況

為探究自噬相關的基因對患者預后的影響，結合自噬相關基因表達量及生存時間進行單因素分析，篩選出與預后相關的自噬基因。通過|log2（Fold Change） |gt;1，FDRlt;0.05閾值分析具有預后價值的自噬相關基因在患者中腫瘤組織與正常組織的表達差異。

1.4 "構建基于自噬相關基因集的ccRCC分子亞型及與臨床相關特征分析

基于上述篩選出的具有預后價值的自噬相關基因對530例腎透明細胞癌患者進行分子亞型分析。利用ConsensusClusterPlus包進行一致性聚類分析，確定最佳分類的K值。通過結合臨床信息對亞型進行特征分析，并進行亞型的生存分析。使用CIBERSORT包、limma包探究亞型的免疫景觀差異。

1.5 "量化ccRCC患者個體化自噬水平及其與基因突變、臨床特征的相關性

ccRCC具有極強的異質性［11-12］，為了更好地評價個體自噬水平，本研究構建了一套評分系統來評估單個腎癌患者的自噬基因特征，稱為自噬評分。通過1.4方法，已成功將ccRCC患者分為2個分子亞型，采用主成分分析降維方法探究2個亞型患者的自噬水平。參考基因表達分級指數評分［16］、免疫微環境評分［17］及m6A評分［18］的定義方法定義自噬評分：自噬評分= ∑（PC1i + PC2i）。其中i是自噬相關基因的表達水平，PC1i、PC2i分別表示自噬相關基因的表達水平在主成分1、2的得分。根據中位自噬評分，將患者劃分為高、低自噬評分組。探究自噬評分對預后的影響，并分析亞型間的自噬評分差異。采用maftools包分析患者體細胞基因突變水平，并分析自噬評分與臨床特征之間的相關性。

1.6 "構建基于自噬相關基因的ccRCC患者風險模型及評估預測能力

由于基因之間、影響特征之間存在共線性問題致使預后模型容易發生過擬合的現象。為減少過擬合的可能，結合患者生存時間，使用LASSO回歸降維、篩選方法計算各個自噬相關基因的風險系數及最佳影像組學特征，并根據交叉驗證Lambda.min值進一步篩選出與患者總體生存率相關的自噬相關基因。隨后根據篩選出來的風險基因計算各患者的預后風險評分，并以中位預后風險評分為界將530例患者劃分為低風險組和高風險組。預后風險評分=∑coef（RNAn）×exp（RNAn），coef（RNA）代表相應RNA的風險系數，exp（RNA）為相應RNA的表達量。探究不同風險評分的患者的預后差異并結合患者臨床信息，可視化風險評分與臨床相關性。影像組學評分（Radscore）=∑coef（影像組學特征）×影像組學特征，coef（RNA）代表相應影像組學特征的系數。通過TCIA數據庫信息比較不同風險組患者的腫瘤體積。使用multiROC包比較基于自噬相關基因預后模型、影像組學模型與其他臨床信息預測的準確性。最后，進一步將此風險模型與患者影像組學特征及臨床信息結合，構建新的列線圖來預測患者生存率。

1.7 自噬風險與免疫浸潤的相關性

通過7種算法的免疫細胞浸潤結果，分析2個風險組的35個免疫檢查點相關基因的表達差異。通過分析13種免疫功能，探討高風險組與低風險組患者之間免疫功能的差異［19］。

1.8 "統計學分析

采用軟件SPSS 22.0對數據進行統計分析，采用R studio及GraphPad Prism進行可視化繪圖。符合正態分布且方差齊的計量資料以均數±標準差的形式表示，組間比較采用t檢驗；不符合正態分布的以中位數（四分位數間距）表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗；計數資料以n（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。以Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 "結果

2.1 "篩選具有預后價值的自噬相關基因

單因素Cox回歸結果表明共88個自噬相關基因與預后有關（Plt;0.01），其中33個是危險性基因，55個是保護性基因（圖1A）。49個自噬相關基因在腫瘤組織內表達上調，30個自噬相關基因表達下調（Plt;0.05，圖1B）。

2.2 "構建基于自噬相關基因集的ccRCC分子亞型及與臨床相關特征分析

一致性聚類分析結果顯示最佳分類K=2時，530例ccRCC患者可分為2種分子亞型A和B（圖2A～C），自噬亞型A患者的總體生存率明顯優于B組 （P=0.001，圖2D），自噬亞型B組具有較晚期的臨床分級、分期（高級別及T、N分期的患者比例更多）等特點（圖2E）。

2.3 "不同腎癌分子亞型患者的免疫全景觀

活化的CD4 T細胞、Tfh細胞等在自噬亞型B患者中的比例高于自噬亞型A，而嗜酸性粒細胞等自噬亞型A患者中更常見（Plt;0.05，圖3A）。漿細胞、輔助T細胞、Tregs細胞等在自噬亞型B患者中更常見（Plt;0.05，圖3B）。

2.4 "量化ccRCC患者個體化自噬水平及其與基因突變、臨床特征的相關性

主成分分析結果表明，主成分1、2可以解釋92%的全部方差（圖4A），因此選擇主成分1和2作為特征成分。根據主成分1、2可以較好地區分自噬亞型A、B 2組患者（圖4B）。高自噬評分組患者的預后更差（Plt;0.001，圖4C），自噬亞型B組患者的自噬評分更高（Plt;0.001，圖4D）。高自噬評分組患者的腫瘤相關基因MUC16、ARID1A、CSMD3、FLG、PBRM1、SPEN、ANK3等突變頻率高于低自噬評分組（Plt;0.05，圖4E～F），自噬可能與基因突變頻率有關。高自噬評分組患者腫瘤體積明顯大于低自噬評分組[190.96（124.18， 245.49）cm3 vs 43.13 （12.73， 75.06） cm3， Plt;0.001，圖4G]，晚期患者占比更多（Plt;0.05，圖4H）。

2.5 "基于自噬相關基因的腎透明細胞癌患者風險模型及影像組學模型的構建與評估

采用LASSO回歸分析篩選出9個自噬相關基因、5個影像學相關特征用于建立腎透明細胞癌患者的風險模型。根據自噬中位風險評分確立亞組，包括低風險組和高風險組，結果顯示高風險組的患者預后較低風險組更差（Plt;0.001，圖5A）。結合臨床資料，高風險組患者多為高等級的TNM分期及G分級的患者（Plt;0.001，圖5B），同時也是自噬亞型B組患者的主要構成，且高風險組患者預后往往較差。結合TCIA數據庫分析患者CT資料，結果表明高風險組患者的腫瘤體積較低風險組患者更大[122.88 cm3 （81.93 cm3， 210.87 cm3） vs 21.86 cm3 （52.54 cm3， 90.16 cm3），Plt;0.001，圖5C]。ROC曲線分析顯示，對530例ccRCC患者中1年總生存率進行預測，自噬相關基因風險模型AUC為0.752，其預測能力優于年齡（0.662）、性別（0.501）、分級（0.715）等臨床因素，稍差于病理分期（0.785）（圖5D）。而在98例具有CT影像學資料的患者中，進一步聯合影像組學模型預測患者1年總生存率，結果顯示影像組學聯合自噬相關基因模型AUC可高達0.922，明顯高于影像組學模型（0.793）及自噬相關基因模型（0.702）（圖5E）。利用患者自噬風險評分、影像組學得分、年齡、性別、TNM分期、G分級作為預測因素構建預后列線圖（圖5F）。

2.6 "不同自噬風險對患者的免疫浸潤的影響

不同風險組的免疫細胞亞群比例結果表明，高風險組患者中性粒細胞減少，其免疫細胞類型以單核細胞等為主，其免疫微環境評分更高，而低風險組患者免疫細胞主要為初始B細胞等，其基質評分更高（圖6A）。高低風險組患者的預后差異與免疫功能差異密切相關。在高風險組中，85%的免疫檢查點呈高表達狀態（Plt;0.05，圖6B）。進一步免疫功能分析結果表明，除了大部分免疫檢查點在高風險組中高表達，APC的抑制、T細胞抑制及I、II 型干擾素反應等現象在高風險組中更常見（Plt;0.05，圖6C）。

3 "討論

RCC是泌尿外科常見腫瘤，即使是同一病理類型的患者，其預后及治療效果都可能存在差異，僅依據TNM分期等臨床特征已無法充分預測患者預后。已有研究基于某些分子特征以求重新對腎癌患者進行分型進而為臨床治療提供指導 ［20， 21］。本研究基于自噬相關基因特征將ccRCC患者進行分型，結果顯示2個分子分型患者的預后有顯著差異。進一步構建自噬評分系統量化ccRCC患者的自噬水平，結果顯示個體自噬評分越高的患者預后越差，且相關癌癥基因的突變率越高，自噬分子分型預后較差的患者的自噬評分也更高，表明該分子亞型及個體化自噬評分系統可較好地區分不同預后的ccRCC患者。本研究首次通過影像組學結合自噬相關基因分析不同ccRCC影像學特征及預后，結果發現高自噬評分組、高自噬風險組的ccRCC患者腫瘤體積明顯更大；而影像組學聯合基因模型具有優秀的預測性能。

有學者通過分析TCGA、ONCOMINE數據庫的ccRCC數據集發現BIRC5、 CAPS等是具有獨立預后價值的自噬相關基因，并構建了基于它們的風險預后模型［10］。但由于RCC具有較強的異質性［11， 12］，目前在ccRCC中鮮見基于某類基因個體化評分的研究報道，更未見評估ccRCC患者個體自噬水平的研究。有學者使用m6A評分量化個體胃癌患者m6A修飾模式，并證實低m6A評分患者對PD-1/L1免疫治療反應及預后更好［18］。因此，本研究通過主成分分析方法成功構建自噬評分系統，并揭示高自噬評分是ccRCC預后不良的重要因素。本自噬評分系統不僅可以衡量單個ccRCC患者自噬水平，更能評估ccRCC患者腫瘤突變負荷、臨床特征及預后等情況。研究結果還提示自噬分子分型預后較差組與高自噬自噬評分組患者基本吻合，且這些患者的APOL1、BIRC5、BID、CAMKK2、HGS等基因表達明顯升高。有研究證實HIF-2α/LINC02609/APOL1 軸可調節APOL1的表達從而影響ccRCC 腫瘤細胞的脂質儲存，促進內質網穩態及腫瘤生長［22］。另有研究表明過表達BIRC5可以增加腎癌細胞的活力及細胞遷移、侵襲能力［23］。BID則通過調控PD-1、LAG3和CTLA4等免疫調節分子表達水平，介導免疫浸潤的不同特征進而影響ccRCC的發展［24］。CAMKK2可在TRPM3 作用下激活自噬標志物LC3B并促進ccRCC的生長［25］。本研究進一步分析證實APOL1、BIRC5、BID、CAMKK2、HGS等基因在高自噬風險組中表達升高，這與既往研究［9］結果符合，提示這些基因在ccRCC進展中發揮了關鍵作用，但具體作用機制仍需進一步分子及動物實驗驗證。

CT是確定腎臟腫塊特征和分期的首選方法，其在腎癌的診斷、分期中起著關鍵作用。研究表明，基于CT影像大數據的分析模型在術前評估腎癌的性質、分型以及預后方面均發揮了精準的判斷和預測作用。有學者通過提取腎透明細胞癌3D多相增強CT影像組學特征并采用影像組學特征穩定性選擇法提出了將臨床特征與CT圖像相結合為預測腎透明細胞癌分級的最佳方法的觀點，其模型簡單有效，同時降低了輻射暴露，為腎透明細胞癌的臨床決策提供了有效的實用工具［26］。一項回顧性研究通過提取腎癌患者術前腎臟MRI不同序列的圖像特征，精準區分了腎透明細胞癌、乳頭狀腎細胞癌及嫌色性腎細胞癌，通過分析不同MRI序列的ROC曲線得到顯著差異的AUC，精準區分了3種亞型的腎細胞癌，并為預測不同亞型腎細胞癌的預后風險提供了可靠依據［27］。可見多種影像組學對腎癌的精確診斷具有高度敏感性，在腎癌的術前評估、術后預測中起到舉足輕重的作用，并且因其無創、成本低、可及性強等優點，在未來的臨床工作中將會更一步普及。本研究通過結合TCIA數據庫中腎癌患者的CT影像學資料證實自噬評分高的患者的腫瘤體積更大。進一步聯合自噬相關基因的風險回歸模型及影像組學模型分析，結果篩選出9個自噬相關基因、5個影像學相關特征是ccRCC患者預后不佳的獨立危險因素。該模型預測ccRCC患者預后能力明顯強于單純使用影像學資料、一般臨床資料及自噬相關基因模型。此外，影像組學證實了高自噬風險患者的腫瘤體積相對更大，提示自噬相關基因在腎癌進展中起到了促進的作用。

本研究結果還顯示自噬高、低風險組患者存在顯著的免疫分布差異，尤其是中性粒細胞和單核細胞的差異分布，這與既往研究［9， 10］結果一致，它們可能作為關鍵的免疫細胞類型對預后產生了影響。中性粒細胞是外周血中最常見的細胞類型，目前認為它的抗腫瘤免疫應答是通過自身大量募集和激活而發揮作用。中性粒細胞可分為包括低密度、正常密度、高密度中性粒細胞3個亞群。在腫瘤微環境中，低密度中性粒細胞主要起到抑制T淋巴細胞作用。而髓源性抑制細胞作為低密度中性粒細胞前體，具有較強的免疫抑制及促進腫瘤的效應［28］。研究表明，中性粒細胞的大量浸潤是腎癌原發灶及其肺轉移灶發生進展的重要原因［24］。晚期ccRCC經常引起全身炎癥，腫瘤細胞通過分泌細胞因子或趨化因子來重塑免疫微環境［29］， 而ccRCC相關炎癥可改變中性粒細胞表型，致使細胞趨化因子1、2、5、8等4種趨化因子表達增高，且這些趨化因子的表達上調被認為是ccRCC患者的預后不良的原因之一［30］。單核細胞是血液中最大的血細胞與白細胞，占白細胞的3%～8%，是機體防御系統的重要組成部分，可吞噬異物產生抗體，具有識別和殺傷腫瘤細胞的能力。中性粒細胞和單核細胞在自噬高風險組患者中的高表達可能是導致患者預后較差的另一重要因素。本研究獨立發現高自噬風險組患者中大部分免疫檢查點均過度表達，且免疫功能分析提示大部分免疫功能處于抑制狀態，更容易阻斷腫瘤免疫中的提呈抗原過程，發生免疫逃逸現象。臨床上，對于高自噬風險或晚期RCC患者可針對這些免疫檢查點開發新的免疫檢查點抑制劑以達到更好的精準治療。

綜上，本研究構建了ccRCC自噬評分系統，并聯合影像組學建立相關風險預后模型，該模型在預測腎癌患者預后及治療中有較好前景；發現并證實了ccRCC中高表達的自噬相關基因可促進腫瘤進展。但本研究未能深入揭示潛在分子機制，只是在理論上提出自噬相關基因與腎癌的發展之間可能存在聯系，未來可進一步探究9個高風險基因在ccRCC發病中的具體機制，為腎癌的防治提供新的依據。

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（編輯：林 "萍）