半制備整體柱液相色譜法測定食品中泛酸的含量

摘 要：目的：建立半制備整體柱液相色譜法測定食品中泛酸含量的分析方法。方法：樣品中泛酸用熱水提取，以磷酸二氫鉀溶液和乙腈為流動相，流速2 mL·min-1，進樣量500 μL，柱溫30 ℃，檢測波長

200 nm，經Merck半制備整體柱凈化，在泛酸出峰處收集溶液，收集液經反相C18柱定量分析。結果：泛酸濃度在0.001～0.032 μg·L-1具有良好的線性關系，相關系數為0.999 9，方法檢出限為0.025 mg/100 g，定量限為0.08 mg/100 g，泛酸在食品中測定結果的相對標準偏差為2.4%～3.6%，加標回收率均大于90%。結論：針對含有蛋白、肽、淀粉等復雜基質的食品，本半制備整體柱液相色譜法的檢測一致性較好，分離度、精密度、準確性等均符合要求。有效解決復雜基質、雜質干擾下目標峰難分離、檢測結果不穩定、平行差的問題。

關鍵詞：高效液相色譜；泛酸；半制備整體柱

Determination of Pantothenic Acid in Food by Semi-Preparative"Monolithic Column Liquid Chromatography

CHEN Hanfeng， YANG Jing， LI Junwei， HOU Shaoping， LIU Chunli

（Access （Guangzhou） Testing Technology Service Co.， Ltd.， Guangzhou 510730， China）

Abstract： Objective： To establish.an analytical method for the determination of pantothenic acid content in food using semi-preparative monolithic column liquid chromatography. Method： Pantothenic acid in the sample is extracted with hot water， using a solution of potassium dihydrogen phosphate and acetonitrile as the mobile phase，"with a flow rate of 2 mL·min-1， an injection volume of 500 μL， a column temperature of 30 ℃， and a detection wavelength"of 200 nm. The solution is purified on a Merck semi-preparative monolithic column， and the solution is collected at the elution peak of pantothenic acid. The collected liquid is then quantitatively analyzed on a reverse-phase C18 column. Result： Pantothenic acid exhibits good linearity within the concentration range of 0.001～0.032 μg·L-1，"with a correlation coefficient of 0.999 9. The limits of detection is 0.025 mg/100 g， and limits of quantification is"0.08 mg/100 g. The relative standard deviation of the pantothenic acid determination results in food is between 2.4% and 3.6%. The recovery rates of spiked samples are greater than 90%. Conclusion： For foods containing complex matrices such as proteins， peptides， and starch， this semi-preparative monolithic column liquid chromatography method demonstrates good consistency in detection， with separation， precision， and accuracy all meeting the necessary standards. It effectively addresses issues such as difficult peak separation， unstable detection results and poor parallelism under complex matrices and impurity interference.

Keywords： high performance liquid chromatography; pantothenic acid; semi-preparative monolithic column

泛酸又稱為維生素B5，是一種水溶性維生素，呈淺黃色，因廣泛存在于動植物中而得名“泛酸”。其主要功效包括幫助能量代謝、維護神經系統健康、促進傷口愈合、維護免疫系統健康和促進頭發和皮膚健康。人體不能自行合成泛酸，必須從食物中獲取。如果缺乏泛酸，可能會引發疲勞、頭痛、失眠、焦慮、消化不良和皮膚病等癥狀[1-5]。

常用的泛酸含量檢測方法主要有微生物法，液相色譜法和熒光光度法，近年來液相色譜-串聯質譜法和酶聯免疫吸附測定法也逐漸被推廣使用[6-11]。最新頒布實施的《食品安全國家標準 食品中泛酸的測定》（GB 5009.210—2023）第一法已從2016版的微生物法改為液相色譜法，但在實施過程中發現，當檢測含有蛋白、肽、淀粉等復雜基質的樣品時，存在雜質色譜峰干擾、測試結果平行性差、色譜柱損耗率高等問題[7-11]。而第二法液相色譜串聯質譜法存在儀器設備昂貴、運營維護成本高、對檢測人員技術要求高等問題。第三法微生物法是測定泛酸的經典方法，成本低、經濟實用，但操作復雜且費時，標準化程度低、環境條件要求較高、受培養基質量影響大[6]。

本研究擬以Merck公司Chromolith半制備整體柱凈化樣品溶液中未能完全去除的蛋白、肽、淀粉等雜質[12]，根據標準工作溶液中泛酸出峰的開始和結束時間設定餾分的收集時間，混合均勻的收集液再經常規的C18色譜柱分離定量。Chromolith半制備柱采用獨特設計的整體化硅膠，其結構包含網狀的孔徑大小為2 μm的大孔，以及空隙大小為

120 ?小孔。當流動相流經色譜柱時，樣品液中的較大分子如蛋白質、肽類及淀粉等雜質會迅速通過2 μm的大孔，而目標物質——小分子泛酸則在更大活性表面積的120 ?小孔中進行高效液相分離。同時，整體柱大孔結構具有極強抗污染能力，可在持續大體積進樣的情況下保持較高的柱效；在高流速下柱反壓小，相同流速下壓力僅為普通色譜柱的1/4，在餾分收集過程中可以使用更高的流速進行快速分離與凈化，有助于減少溶劑消耗和縮短凈化時間。經過凈化后的樣品溶液只有較少的雜質成分，根據GB 5009.210-2023第一法的色譜條件，泛酸峰與相鄰雜質之間能夠實現良好的分離效果。凈化后的樣品液不會對后續用于分離定量分析的色譜柱造成柱頭污染，從而顯著延長分析用色譜柱的使用壽命。綜上所述，Chromolith半制備整體柱提供了一種高效、快速且經濟的樣品凈化方案，有助于提高泛酸測定的準確性和效率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

食品樣品A混合營養餐，樣品B代餐奶昔均購于商場；泛酸鈣標準品；淀粉酶；磷酸二氫鉀、乙腈、三氟乙酸、磷酸（色譜純）；鹽酸、氫氧化鈉、硫酸鋅（分析純）；一級水。

1.2 儀器與設備

2695高效液相色譜儀帶紫外檢測器和大體積定量環（Waters公司）、WFCIII餾分收集器（Waters公司）、半制備整體柱（Chromolith SemiPrep RP-18e色譜柱，Merck公司）、分析用色譜柱（Eclipse XDB-C18色譜柱，Agilent公司）、3K15高速冷凍離心機（Sigma公司）、ST 3100 pH計（Thermo公司）、AR224CN電子天平（Mettler公司）和SW22恒溫振蕩水浴箱（Julaba公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準品配制

參考《食品安全國家標準 食品中泛酸的測定》（GB 5009.210—2023）第一法3.4配制標準溶液。

1.3.2 樣品處理

參考GB 5009.210—2023第一法5.2.2處理復雜基質樣品，過濾上清液至2 mL樣品瓶中，放入帶有餾分收集器的液相色譜儀進行泛酸的餾分收集。將泛酸標準工作溶液的收集液、待測試樣的收集液分別混合均勻，轉移至2 mL液相用樣品瓶中進行上機分析，測量峰面積并定量計算。

1.3.3 色譜條件

（1）餾分收集半制備色譜條件。色譜柱：Merck公司Chromolith SemiPrep RP-18e（10 mm×100 mm）；流速：2.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進樣量：500.0 μL；檢測波長：200 nm；流動相：0.1%三氟乙酸水溶液和乙腈按95∶5（V/V）混合；根據最大濃度的標準工作液中泛酸的出峰時間設定收集時間。出峰情況見圖1。

（2）分析用色譜條件。色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進樣量：50.0 μL；檢測波長：200 nm；流動相：磷酸二氫鉀水溶液和乙腈按97∶3（V/V）混合。出峰情況見圖2。

2 結果與分析

2.1 專屬性實驗

制備樣品B空白基質樣品，按照1.3.2處理樣品，1.3.3色譜條件上機測定，泛酸標準工作液的出峰時間為7.26 min（圖2），對比空白基質樣品在此處無干擾峰（圖3）。

2.2 線性范圍

根據GB 5009.210—2016的標準工作溶液配制方法，配制濃度在0.001～0.032 μg·L-1的6個濃度點的工作溶液，上機測試，以標準工作液濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線（圖4）。曲線的線性回歸方程為Y=6.54×103X+112，相關系數R2=0.999 9。

2.3 檢出限和定量限

配制低濃度的試樣溶液，餾分收集后進樣得到色譜峰，計算出待測組分的信噪比。當信噪比（S/N）為3時，泛酸檢出限為 0.025 μg·mL-1；樣品稱樣量 5 g，定容 50 mL時，該方法的泛酸檢出限為0.025 mg/100 g。當信噪比（S/N）為 10時，泛酸定量限為0.08 μg·mL-1；樣品稱樣量5 g，定容50 mL時，該方法的泛酸定量限為0.08 mg/100 g。

2.4 精密度

按照樣品處理方法和色譜條件，平行測定6份樣品，分別計算樣品中泛酸的含量及相對標準偏差（Relative Standard Deviation，RSD）。如表1所示，結果顯示2種樣品測定結果的RSD在2.4%～3.6%，滿足《合格評定 化學分析方法確認和驗證指南》（GB/T 27417—2017）中RSD小于7.5%的要求，該方法精密度良好[13]。

2.5 準確度

稱取2.5 g樣品，選擇3個濃度水平進行加標實驗，按照樣品處理方法和色譜條件進行試驗，計算回收率及相對標準偏差，結果如表2所示。泛酸平均加標回收率在90.1%～109.7%，滿足GB/T 27417—2017中回收率在90%～110%的要求，該方法準確度高。

3 結論

本文建立了餾分收集液相色譜測定食品中泛酸的方法，當稱樣量為5 g定容于50 mL水時，方法的檢出限為0.025 mg/100 g，定量限為0.08 mg/100 g；方法的線性相關系數為0.999 9，相對標準偏差為2.4%～3.6%（n=6），加標回收率均大于90%（n=9），精密度和準確度均滿足GB/T 27417—2017中的要求。相對于GB 5009.210—2023第一法液相色譜法，本法有效排除了蛋白、肽、淀粉等基質雜質對泛酸定量檢測中目標峰的干擾，方法重現性好、回收率高，可作為復雜基質食品中泛酸含量檢測的優選方法。

參考文獻

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