DFRKN 1堿性磷酸酶功能團的定量分析

摘要：本文研究以根結線蟲天敵真菌1分離物為材料，提取純化得到DFRKN1堿性磷酸酶，并采用化學修飾的方法對酶的必需功能團進行定性分析，確定色氨酸殘基、組氨酸殘基、賴氨酸殘基為酶的活性中心的必需功能團，在此基礎上，對DFRKN1堿性磷酸酶的必需功能團進行定量研究。分別用不同濃度N溴代琥珀酰亞胺修飾酶蛋白的色氨酸殘基，溴乙酸修飾酶蛋白的組氨酸殘基的咪唑基，甲醛修飾酶蛋白的賴氨酸殘基，測定酶活性計算反應速度常數，以反應速度常數的變動來確定必需基團的數目，實驗結果表明：酶活性中心必需功能團色氨酸殘基、組氨酸殘基、賴氨酸殘基的數目均為一個。

關鍵詞：根結線蟲天敵真菌1；堿性磷酸酶；功能團；定量分析

根結線蟲是植物根系內定居性寄生物，植物根結線蟲病每年可以造成農作物經濟損失超過700億美元。根結線蟲的寄主廣泛，可以侵染的植物種類超過3000種，其中包括大部分的農作物，可造成農作物10%～20%的減產，嚴重的可以減產75%，甚至絕產。目前有報道的根結線蟲種類可達90種以上，其中南方根結線蟲、北方根結線蟲、花生根結線蟲和爪哇根結線蟲是四種常見的根結線蟲，造成的經濟損失占整個根結線蟲引起的作物損失的90%以上。隨著城市周邊大規模溫棚蔬菜生產基地的不斷擴大，連作的耕種方式、缺乏新品種引進檢疫、防病措施不到位等造成根結線蟲發生逐年增加。目前國內根結線蟲的防控主要以化學防治為主，化學殺蟲劑的使用可以使根結線蟲產生抗藥性，并且造成環境污染。因此，生物防治根結線蟲是一種可持續發展、不污染環境的有效措施。而開發高效穩定的防生菌成為根結線蟲防治的關鍵所在。張靠穩等［1］、馬愛瑛等［2］從寧夏溫室黃瓜根結線蟲上分離得到一株天敵真菌，此分離物對根結線蟲有較強的拮抗作用，該分離物能夠從根結線蟲的卵、二齡幼蟲和成蟲體表直接侵入，命名為根結線蟲天敵真菌1號分離物（DFRKN1）。

堿性磷酸酶（E.C.3.1.3.1）是一類在堿性條件下具有較高催化活性，能催化幾乎所有磷酸單酯水解生成正磷酸和對應酯、酚、糖等物質的一組特異性水解酶類，廣泛存在于動物、植物及微生物體內，在生物體內有重要作用，直接參與生物體內磷代謝過程，維持體內合適的鈣磷比例，是生物代謝過程中重要的調節酶。DFRKN1的堿性磷酸酶穩定性可以反映其代謝穩定性。本文在前期研究的基礎上，通過對DFRKN1堿性磷酸酶的功能團的定量分析，以期進一步了解堿性磷酸酶的特性，為深入研究DFRKN1侵入線蟲的機理及開發利用奠定基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

根結線蟲天敵真菌1號分離菌（DFRKN1）由北方民族大學張靠穩教授提供。

1.2主要試劑

2硫代2硝基苯甲酸（DTNB）、溴代乙酸（BrAc）、N溴代琥珀酰亞胺（NBS）、乙酰丙酮、苯甲基磺酰氟（PMSF）為Sigma公司產品；其他化學試劑均為國產分析純。

1.3試驗方法

1.3.1菌種的培養

將DFRKN1按2%接種到150mL的玉米粉液體培養基中，27℃搖床培養，100r/min，培養3～5天。

1.3.2堿性磷酸酶的分離與純化

堿性磷酸酶的分離純化參考文獻進行［3］。

1.3.3酶活力的測定

堿性磷酸酶水解底物pNPP產生硝基苯酚（pNP）和無機磷酸（HPO42），硝基苯酚在405nm處有最大的吸收峰［4］。

酶活力（單位）=△A405×1000

1.3.4酶的必需基團的定性分析

采用DTNB（2硫代2硝基甲酸）、NBS（N溴代琥珀酰亞胺）、乙酰丙酮、PMSF（苯甲基磺酰氯）、BrAc（溴乙酸）、甲醛等化學修飾劑處理酶液。修飾后測定堿性磷酸酶的酶活。

1.3.5酶活性中心必需基團的定量分析

按夏初臨等［5］采用的方法，對酶活性中心的必需基團進行定量分析。首先判斷酶的修飾反應屬于一級反應，以剩余酶活力的對數對修飾時間作圖。然后測定修飾反應的一級速度常數，以反應速度常數的變動來推斷必需基團的數目。在不同濃度的化學修飾劑下，測定酶失活的一級速度常數（k1），以對數作圖法作lgk1與lg［I］的關系，從直線的斜率求必需基團的數目。

2結果與分析

2.1必需功能團的定性分析

DTNB在一定條件下能專一地修飾巰基，實驗中當DTNB的濃度達到4mmol/L時，對酶活力基本沒有影響，說明巰基不是酶活性中心必需的官能團。

用NBS修飾堿性磷酸酶時，酶剩余活力隨NBS濃度增加而急劇下降，當NBS濃度達到0.4mmol/L時，酶活力僅剩11.40%（如圖1所示），NBS在適宜條件下，能作用于巰基和色氨酸的吲哚基，從DTNB對酶的修飾結果可以得出巰基不是必需基團之一，所以NBS對酶的修飾作用說明了色氨酸是酶的活性中心的必需基團之一。

乙酰丙酮在堿性條件下能修飾精氨酸，從實驗結果可以看出，乙酰丙酮的濃度在10～20mmol/L范圍內時酶活力隨濃度增大而降低；但當濃度達到40mmol/L以上時，酶活力基本不再變化；當濃度達到100mmol/L時，酶活力尚剩余62.30%，說明精氨酸可能與維系酶活性中心的構象有關，但并非必需功能團。

苯甲基磺酰氯（PMSF）在堿性條件下能專一性地修飾絲氨酸殘基，實驗結果表明，當PMSF濃度達到0.4mmol/L時，酶活剩余32.40%，且酶活力基本不再變化，說明絲氨酸與酶活力有關，但也并非必需功能團。

溴乙酸（BrAc）在偏酸性的條件能專一性地修飾組氨酸的咪唑基，從實驗結果（如圖2所示）可以看出，隨著BrAc濃度的增加，酶活力急劇下降，當BrAc的濃度達到80mmol/L時，酶活力僅剩3.64%，由此說明組氨酸殘基是酶活力中心的必需功能團。

甲醛在偏酸性的條件下能修飾氨基，從實驗結果（如圖3所示）可以看出，酶活力隨著甲醛濃度的增大而急劇下降，當甲醛濃度達到4%時，酶活力僅剩6.37%，說明賴氨酸側鏈的氨基也是酶活性中心的必需功能團之一。

2.2酶活性中心色氨酸殘基數的測定

采用不同濃度（0.1～0.4mmol/L）的NBS修飾酶蛋白，反應10min即可修飾完全。每隔2min取出酶液測定的酶活力，以相對酶活力的對數lg（Ag）對修飾時間作圖為直線，說明NBS對酶的修飾作用使酶失活是按一級反應進行的。根據一級反應速度常數k1與酶活力失活一半的時間T1/2的關系為：k1=0.693/T1/2，求出不同NBS濃度下的k1值，再根據公式：k1=k2［I］n，即lgk1=lgk2+nlg［I］。以lgk1對lg［NBS］作圖（見圖4），得斜率n=0.813，近似n=1，即酶活性中心必需的色氨酸殘基為一個。

2.3酶活性中心組氨酸殘基數的測定

在不同濃度（20～80mmol/L）的BrAc下，測定其對酶的失活過程，每隔5min測定一次酶活力，以剩余相對酶活力的對數lg（Ag）對修飾時間作圖為直線，說明BrAc對酶的修飾使其失活是按一級反應進行的。一級反應速度常數k1對lg［BrAc］作圖（見圖5），斜率即為n=0.837，近似n=1，則酶活性中心必需的組氨酸殘基數為1。

2.4酶活性中心賴氨酸殘基數的測定

研究不同濃度的甲醛（1%、2%、3%、4%、5%）作用下酶活力的變化，測定其對酶的修飾失活過程的酶活力，計算出相對酶活力，以剩余相對酶活力的對數lg（Ag）對修飾時間作圖為直線，說明甲醛作用于酶使其失活是按一級反應進行的。以一級反應速度常數k1對lg（甲醛濃度）作圖（見圖6），斜率即為n=0.863，近似n=1，則酶活性中心必需的賴氨酸殘基數為1。

3結論與討論

實驗主要是對來自根結線蟲天敵真菌中的堿性磷酸酶的功能團進行定量研究，首先對酶進行純化處理，得到酶純化倍數達27.17，比活力達10514，達到電泳純。再對酶的必需功能團進行定性研究，定性研究是定量研究的前提。

DFRKN1堿性磷酸酶活性中心的必需功能團有色氨酸殘基、組氨酸殘基、賴氨酸殘基，這與多數研究中的堿性磷酸酶必需功能團的研究結果相同，說明堿性磷酸酶的必需功能團有著一定的相似性，但不同來源地堿性磷酸酶的必需官能團也存在差異。

本實驗結果表明，測定色氨酸的數目時，得到的直線斜率n=0.813，近似整數為n=1，表明每個酶分子僅結合一個NBS分子活力就會幾乎完全喪失，說明每個酶分子的活性中心中僅有一個色氨酸殘基是酶活性所必需的。同樣的由實驗結果也可以得出組氨酸殘基、賴氨酸殘基的數目也都是一個。

參考文獻：

［1］張靠穩，金賽.寧夏賀蘭山農牧場日光溫室根結線蟲天敵真菌的分離和初步鑒定［J］.北方園藝，2009（7）：157159.

［2］馬愛瑛，張靠穩，楊曉燕.根結線蟲天敵真菌1（DFRKN1）菌株的鑒定［J］.貴州農業科學，2010，38（1）：6869.

［3］張靠穩，馬愛瑛，葉東平，等.DFRKN1堿性磷酸酶的提取純化和主要理化性質研究［J］，安徽農業科學，2008（26）：1118111183.

［4］陳清西，顏思旭.文昌魚ALPase底物特異性及其效應物對酶活力的影響［J］.廈門大學學報（自然科學版），1989（1）：9296.

［5］夏初臨，陳惠黎.谷胱甘肽S轉移酶活性中心的研究：羧基、氨基和胍基的化學修飾［J］.中國生物化學與分子生物學報，1991，7（3）：327332.

基金項目：北方民族大學“大學生創新創業訓練計劃”項目（S202311407005）

作者簡介：蔣華珍（2003—），女，漢族，四川廣安人，本科在讀，研究方向：生物技術。

*通訊作者：馬愛瑛（1978—），女，回族，內蒙古赤峰人，副教授，研究方向：生物化學與分子生物學。