達烏爾黃鼠季節性肥胖與胰腺功能穩態

摘 要 儲脂類冬眠動物在入眠前的育肥階段大量積累體脂作為越冬的重要能源物質。達烏爾黃鼠（Spermophilus dauricus）在短短2 ～ 3個月的育肥期間體質量增加近1倍，然而該物種快速育肥過程是否引起糖脂代謝的紊亂以及類似于人類肥胖相關的代謝異常尚不清楚。在本研究中，我們檢測了育肥不同階段黃鼠血糖含量、糖耐受情況、血清和非脂肪類器官中甘油三酯和游離脂肪酸含量以及血清中胰島素和胰高血糖素含量。結果顯示，達烏爾黃鼠在育肥期間血糖保持穩定，心臟、肝臟及腎臟等非脂肪類器官中甘油三酯和游離脂肪酸含量無顯著性變化。血清中甘油三酯及胰島素含量無顯著性差異，但游離脂肪酸含量顯著升高，胰高血糖素含量顯著下降。這些結果說明，達烏爾黃鼠在育肥期間并沒有產生高血糖、高血脂、脂質異位堆積和胰島素抵抗等癥狀。育肥期間胰高血糖素的降低或許是維持其血糖穩定的機制之一。此外，在冬眠之前，黃鼠胰島面積以及胰島細胞數目呈現增加趨勢，提示育肥期間可能存在胰島細胞新生，這可能與育肥期間胰島功能維持有關。達烏爾黃鼠作為儲脂類的冬眠動物，具有獨特的體脂積累機制，或將為肥胖引起的代謝綜合征的治療提供借鑒。

關鍵詞：達烏爾黃鼠；儲脂類冬眠動物；肥胖；胰腺；胰島素抵抗

中圖分類號：Q955

文獻標志碼：A

文章編號：2310 - 1490（2024）- 04 - 0757 - 10

DOI：10.12375/ysdwxb.20240408

一些小型哺乳動物在面臨季節性環境脅迫時會通過冬眠這一降低體溫和代謝率的方式減少能量支出，存活越冬［1］。和兩棲、爬行動物的冬眠不同，哺乳類冬眠動物在整個冬眠季節會有多次自發的陣間覺醒，在陣間覺醒期間，動物的體溫和代謝率快速恢復到冬眠前水平，并維持大約24 h，然后進入到下一輪的冬眠中，陣間覺醒會消耗整個冬眠季節70%左右的能量［2］。為了成功存活越冬，冬眠動物需要在入眠前儲存一定量的能源物質［3］。一些動物在冬眠前的育肥階段（fattening period）通過大量進食將越冬所需的能源物質以體脂的形式儲存在體內，被稱為儲脂類冬眠動物（fat-storing hibernators）［4?5］。在夏秋的育肥期，儲脂類冬眠動物的體質量大幅度增加，在早秋季節達到峰值。隨后動物攝食自發降低，體質量開始下降，準備進入冬眠。在冬眠期間，因為體脂的消耗，體質量逐漸降低，在春季出眠時達到最低值。儲脂類冬眠動物的體質量在夏秋的育肥期和冬眠期呈現明顯的季節性波動［6?8］。

達烏爾黃鼠（Spermophilus dauricus）是一種廣泛分布于我國東北、華北和西北地區的典型儲脂類冬眠動物［9?10］。育肥期達烏爾黃鼠的體質量在短短2 ～3個月內快速增加近1倍，體脂含量增加近10倍［11］。前期的研究結果表明，達烏爾黃鼠在育肥期間體脂快速而大量地積累，但心臟、肝臟、腎臟和骨骼肌并沒有發生脂質異位堆積［12?13］。多紋黃鼠（Ictidomystridecemlineatus）和棕熊（Ursus arctos）在冬眠前也表現出抵抗動脈粥樣硬化的表型［14?15］。最新的研究表明，喜馬拉雅旱獺（Marmota himalayana）在冬眠前的育肥期體質量增加1倍而肝臟并沒有明顯的病理損傷［16］。上述結果提示，儲脂類冬眠動物演化出了獨特的體脂積累機制。

胰島素（insulin）在機體能量平衡調節中扮演重要角色。胰島素由胰腺β 細胞合成和分泌，機體血糖含量上升時胰島素水平上升，高胰島素可以通過作用在細胞膜上的胰島素受體，調節葡萄糖轉運蛋白4（glucose transporter type 4，GLUT4）跨膜吸收葡萄糖，將葡萄糖以糖原或者脂質的形式儲存起來，起到降低血糖的作用［17］。GLUT4在肝臟細胞、骨骼肌細胞和脂肪細胞等均有表達。當機體細胞對胰島素反應不敏感時，便產生胰島素抵抗（insulin resis?tance）［18?20］。肥胖是誘導機體發生胰島素抵抗的重要機制之一，過量的脂肪組織釋放出脂肪酸和炎癥性物質，這些物質可以干擾胰島素的信號傳導，導致胰島素抵抗的發生［21?24］。胰島素抵抗會迫使胰腺分泌更多的胰島素以維持正常的血糖水平。隨著時間的推移，這種過度的胰島素分泌可能會導致胰腺疲勞，增加患2型糖尿病的風險，影響整體健康［25］。

為了深入了解儲脂類冬眠動物在育肥期間體脂積累機制，本研究以達烏爾黃鼠為模型，通過對育肥不同階段進行取材，檢測血糖、血脂和胰島素等指標，從胰腺對能量平衡的調節角度出發探究達烏爾黃鼠育肥期間維持代謝健康的獨特生理適應機制。

1 研究方法

1. 1 實驗動物

實驗動物達烏爾黃鼠于2021年6月捕于遼寧省沈陽市遼中區，飼養于沈陽師范大學動物房，非冬眠季節飼養室溫度為（25 ± 2）℃，光照為12L∶12D，飼喂維持鼠飼料（遼寧長生生物技術有限公司）、水以及新鮮蔬菜，水食自取。冬眠季節轉移至低溫（8 ±4） ℃恒黑條件下，入眠前水食自取，入眠后僅提供少量標準鼠飼料。動物自發出眠后每周使用電子天平（精確到0. 1 g）稱量體質量及攝食量。將出眠后體質量平均值作為基線，體質量上升20% ～ 30%的時期（大約在春末夏初）定義為育肥早期（earlyfattening，EF；n = 6），體質量上升50% ～ 60%的時期（仲夏季）定義為育肥中期（mid-fattening，MF；n = 6），體質量上升80% ～ 90%的時期（夏末）定義為育肥末期（late-fattening，LF；n = 7），將體質量上升到高峰后連續下降3 周（初秋）的時期定義為育肥后（postfattening，PostF；n = 7）［11］。肥滿度（K）根據K =100W / L3計算［26］，式中：W 為體質量（x），單位g；L 為體長（y），單位cm。本研究通過了沈陽師范大學動物實驗倫理委員會的審查（CLS-XingX-2023-1），實驗設計符合動物管理條例及實驗動物相關倫理原則的要求，對實驗動物的使用符合“3R”原則。

1. 2 糖耐受

實驗動物18：00禁食，水自取。次日09：00于指尖處采血，使用ONETOUCH UltraVue血糖儀檢測血糖含量。根據體質量，每100 g腹腔注射1 mL 20%葡萄糖，并在葡萄糖注射前（0 min）、注射后15、30、60、120 min檢測血糖水平，并據此繪制血糖值曲線，計算曲線與x、y 軸圍成的面積（area under the curve，AUC），將AUC進行統計分析，檢測糖耐受情況。

1. 3 胰島素及胰高血糖素含量

糖耐受試驗次日，實驗動物根據體質量，每100 g腹腔注射1 mL 2. 5% 阿弗汀麻醉，斷頸取血，全血4 ℃靜置30 min 后使用冷凍離心機（Centrisart D-16C， Sartorius）離心（750g × 30 min，4 ℃），分離血清并分裝保存于冰箱（-80 ℃）備用。血清中胰島素及胰高血糖素含量使用ELISA試劑盒檢測，其中，胰島素使用Rat INS Elisa Kit（CAT# ml002840），檢測范圍1. 5 ～ 48. 0 mU/L，最低檢測濃度 lt; 0. 1 mU/L，批內差小于10%，批間差小于15%；胰高血糖素使用RatGC Elisa Kit（CAT# ml600102，酶聯生物），檢測范圍7. 5 ～ 240. 0 mU/L，最低檢測濃度 lt; 1. 0 mU/L，批內差小于10%，批間差小于15%，操作按照說明書進行。使用酶標儀（PT-3502G，北京普天新橋）測量標準品和樣品位于450 nm 吸光值，并計算激素濃度。

1. 4 脂質含量

快速取心臟、肝臟和腎臟，液氮速凍后于冰箱中-80 ℃保存備用。脂質含量檢測前，使用萬分稱（Sartorius BSA224S，Max 220 g，d = 0. 1 mg）準確稱量心臟、肝臟和腎臟質量。根據質量加入9倍體積的0. 01 mol/L PBS緩沖液，再使用勻漿機（IKA T10 ba?sic ULTRA-TURRAX）研磨均勻，使用冷凍離心機（H1650R，湖南湘儀）離心（750g × 10 min，4 ℃），分裝上清液。使用脂質含量檢測試劑盒檢測血清、心臟、肝臟和腎臟勻漿液中甘油三酯（A110-2-1，南京建成）及游離脂肪酸（A042-1-1，南京建成）含量。使用紫外分光光度計（U-T5C，上海屹譜）測量甘油三酯位于波長500 nm處吸光值和游離脂肪酸位于波長440 nm處吸光值。血清中甘油三酯或游離脂肪酸濃度 =（ Aexp - Ablank）（/ Astd - Ablank） × Cstd， 心臟、肝臟及腎臟甘油三酯/游離脂肪酸質量摩爾濃度 =（ Aexp -Ablank）（/ Astd - Ablank） ×（ Cstd/Cpr），其中Aexp為實驗組測得的吸光值，Ablank 為空白組測得的吸光值，Astd 為標準品組甘油三酯（2. 26 mmol/L）或游離脂肪酸（1 mmol/L）的吸光值，Cstd為甘油三酯（2. 26 mmol/L）或游離脂肪酸（1 mmol/L）的標準品濃度，Cpr為組織樣本蛋白質量濃度（由BCA法測得，單位g/L）。

1. 5 BCA 法測蛋白質量濃度

使用BCA試劑盒（CAT#BCA02，北京鼎國昌盛）和酶標儀（PT-3502G，北京普天新橋）測量心臟、肝臟和腎臟勻漿液在562 nm波長處吸光值，繪制標準曲線后計算求得蛋白質量濃度。

1. 6 胰島面積和細胞統計

手動剝離完整胰腺，4%多聚甲醛固定，常規方法制作石蠟切片，HE 染色，石蠟切片機為LeicaRM2015，切片厚度為4 μm。染色后使用VS200玻片掃描系統拍照，并使用OlyVIA軟件進行圖片處理及胰島面積和胰島內細胞數目統計，胰島內細胞數目統計依據胰島內細胞核（cell nucleus，CN）數目。EF、MF和PostF組各6只黃鼠，LF組7只黃鼠，每只黃鼠統計2 ～ 20個胰島面積。

1. 7 統計分析

使用SPSS 23. 0軟件進行數據分析，在統計分析前使用Kolmogorov-Smirnov test 檢測數據的正態分布，使用Brown-Forsythe test檢測方差齊性。體質量、體質量增加值、肥滿度、血糖含量、血糖耐受、脂質含量、胰島素含量、胰高血糖素含量及胰島面積的組間差異采用單因素方差分析（one-way ANOVA）進行，使用Tukey test進行多重比較檢驗。分析結果使用GraphPad Prism 9. 5. 1軟件繪圖，數據以平均值 ± 標準誤（mean ± SEM）表示，P lt; 0. 05為差異顯著，P lt;0. 01為差異極顯著。

2 結果

2. 1 體質量及肥滿度變化

達烏爾黃鼠體質量在育肥期間顯著增加，在育肥結束后體質量自發降低（F（3，22） = 11. 030，P lt;0. 01；圖1A、B），EF、MF和LF期黃鼠體質量與自身出眠后的基線值相比分別增加了25. 03%、58. 93%和80. 15%（F（3，22） = 62. 340，P lt; 0. 01；圖1C）。黃鼠肥滿度在育肥期間顯著增加，在育肥結束后自發降低，與體質量呈現相似的變化趨勢（F（3，22） = 12. 537，P lt; 0. 01；圖1D）。黃鼠的體質量和肥滿度均呈現明顯的周期變化。

2. 2 血糖濃度變化及糖耐受情況

EF、MF、LF和PostF期，達烏爾黃鼠血糖濃度分別為（6. 33 ± 0. 46）、（7. 25 ± 0. 70）、（7. 14 ± 0. 85）、（8. 37 ± 0. 57） mmol/L，各組間無顯著差異（F（3，22） =1. 575，P = 0. 224；圖2E）。在育肥不同階段注射20% 葡萄糖后，糖耐受情況沒有顯著差異（F（3，22） =0. 626，P = 0. 606；圖2A-D、F）。

2. 3 組織蛋白質量濃度

使用標準品濃度和吸光值繪制標準曲線后，計算出心臟、肝臟及腎臟中的蛋白質量濃度，每種組織單位質量的蛋白質量濃度在不同組間相對穩定（表1）。

2. 4 脂質濃度變化

育肥不同階段達烏爾黃鼠血清（F（3，22） = 1. 619，P = 0. 214；圖3A）、肝臟（F（3，22） = 0. 609，P = 0. 616；圖3C）和腎臟（F（3，22） = 1. 595，P = 0. 219；圖3D）中甘油三酯濃度無顯著變化，育肥結束后心臟中甘油三酯濃度具有下降趨勢（F（3，22） = 3. 44，P = 0. 034；圖3B）。血清中游離脂肪酸濃度存在組間差異，EF組血清中游離脂肪酸濃度為（0. 18 ± 0. 05） mmol/L，顯著低于PostF 組的（0. 37 ± 0. 05） mmol/L（F（3，22） =3. 159，P = 0. 046；圖4A），而心臟（F（3，22） = 2. 064，P = 0. 134；圖4B）、肝臟（F（3，22） = 0. 794，P = 0. 51；圖4C）和腎臟（F（3，22） = 0. 379，P = 0. 769；圖4D）中游離脂肪酸濃度在育肥不同階段無統計學差異。

2. 5 胰島素及胰高血糖素含量變化

育肥不同階段達烏爾黃鼠血清中胰島素含量無顯著變化（F（3，22） = 0. 720，P = 0. 551；圖5A）。EF期胰高血糖素含量為（238. 76 ± 16. 39） mU/L，隨后逐漸下降，PostF 期為（183. 65 ± 4. 89） mU/L（F（3，22） =7. 360，P = 0. 001；圖5B）。

2. 6 胰腺組織學變化

HE染色結果表明，達烏爾黃鼠EF、MF和LF期胰島面積分別為（13 244. 22 ± 955. 70）、（17 019. 62 ±1 415. 67）、（15 639. 45 ± 1 295. 82） μm2，育肥結束后，達烏爾黃鼠胰島橫截面積增加至（18 451. 25 ±1 320. 53） μm2（F（3，269） = 3. 291，P = 0. 021；圖6，圖7A）。通過對胰島內細胞數目進行統計，發現PostF組黃鼠胰島內細胞數目相較于EF、MF和LF組呈增加趨勢（F（3，21） = 2. 896，P = 0. 059；圖6，圖7B）。

3 討論

在冬眠前的育肥階段，達烏爾黃鼠的體質量和肥滿度顯著上升，前期的研究結果表明，黃鼠體質量的增加主要由體脂積累導致［11］。本研究發現，盡管育肥期黃鼠體質量增加近1倍，其血清、心臟、腎臟以及肝臟中的甘油三酯水平仍然維持恒定水平。該結果與之前在骨骼肌等非脂肪類器官中的研究結果［12?13］相一致，提示在育肥期間黃鼠的非脂肪類器官可以很好地維持代謝健康，并沒有產生脂質異位堆積。育肥結束后，血清中游離脂肪酸含量有所上升，而心臟中游離脂肪酸含量呈現出下降趨勢，這可能和冬眠前機體的代謝底物由糖轉變為脂質［27?30］。白色脂肪組織在積累脂質的過程中，脂肪細胞直徑變大導致細胞缺氧、凋亡并將炎癥因子和脂質釋放到血液中是導致脂質異位堆積的重要原因［31］。脂肪細胞的胰島素敏感性在調節脂肪細胞的脂質儲存能力［32］以及機體整體的胰島素敏感性［31，33?34］中扮演重要角色。在實驗大小鼠肥胖模型中，動物在體脂積累的過程中會建立起胰島素抵抗的表型，表現為血糖含量和血清中胰島素水平顯著升高，糖耐受性降低［35?37］。胰島素可以促進脂肪存儲，在胰島素抵抗狀態下，這一過程可能加速，導致更多的脂肪被儲存在體內［38］。黃腹旱獺（Marmota flaviventris）在冬眠前通過建立可逆的胰島素抵抗來促進體脂積累，表現為秋季育肥階段的旱獺血糖水平和胰島素水平均高于春季、夏季和冬季；秋季旱獺在接受糖注射后胰島素水平顯著高于其他3個季節，表現出機體對胰島素不敏感；然而在育肥結束后冬眠開始時，這種高胰島素和胰島素不敏感的現象就消失了，即在育肥建立起短暫的胰島素抵抗是一個可逆的過程，這個過程主要就是為了促進育肥期間脂肪的積累［39］。本研究結果顯示，在冬眠前的育肥期達烏爾黃鼠血糖含量無顯著性變化，即便在育肥結束后即將進入冬眠階段，黃鼠的血糖依舊維持在相對穩定的水平。血液中胰島素水平在育肥不同階段也維持穩定，胰高血糖素含量在育肥期間有所降低。胰高血糖素通過促進肝臟糖異生等途徑增加血糖含量，具有升高血糖的作用［40］。因此，達烏爾黃鼠育肥期胰高血糖素的降低可能是維持其血糖穩定的生理機制之一。此外，育肥期間達烏爾黃鼠胰島面積和胰島細胞數量呈現出一定的增加趨勢，提示可能存在胰島細胞的增殖。這可能是在育肥期間胰腺內分泌功能得到強化的機制，其中具體增殖的胰島細胞類型和內在的調節機制還需要進一步研究。

體脂是儲脂類冬眠動物越冬的重要能源物質，體脂積累量會顯著影響冬眠的存活率和冬眠表達［5，41?42］。達烏爾黃鼠作為典型的儲脂類冬眠動物具有獨特而高效的體脂積累機制。在育肥期間，黃鼠的血糖、血脂和胰島素功能維持在正常水平，且沒有發生脂質異位堆積。有學者通過對4種冬眠動物和14種非冬眠動物基因組進行比較，發現儲脂類冬眠動物一系列短的非編碼DNA發生了獨立演化，而這些非編碼DNA出現在人類肥胖相關的基因附近，推測儲脂類冬眠動物可能獨立演化出了適應肥胖的機制［43］。肥胖以及肥胖導致的代謝疾病已經成為目前世界范圍內較為嚴重的流行性疾?。?4?45］。儲脂類冬眠動物演化出了獨特的脂肪積累機制，可以將脂質高質量地儲存在脂肪組織中，而不給機體造成病理性傷害，是獨特健康的肥胖模型，其內在機制值得更深入地探討和研究。

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基金項目：國家自然科學基金面上項目（32071518）；國家自然科學基金青年科學基金項目（32301306，32200930）