決明子等7種中藥配方顆粒微生物限度檢查方法適用性驗證

【摘要】目的：建立決明子等7種中藥配方顆粒微生物限度檢查方法適用性。方法：參照《中華人民共和國藥典》2020年版四部“通則1105、1106、1107”進行方法適用性試驗。結果：采用平皿傾注法（稀釋法），需氧菌計數中合歡花（合歡花）、槐花（槐花）配方顆粒（1∶50，1 mL/皿），合歡皮、槐角、皂角刺、胡蘆巴配方顆粒（1∶20，1 mL/皿）；霉菌和酵母菌計數中合歡花（合歡花）配方顆粒（1∶20，1 mL/皿）、合歡皮配方顆粒（1∶50，1 mL/皿）均消除抑菌性?？刂凭鷻z查采用平皿傾注法（常規法）。結論：本方法可為決明子等7種中藥配方顆粒質量控制提供參考。

【關鍵詞】中藥配方顆粒；微生物限度；適用性驗證

【DOI編碼】10.3969/j.issn.1674-4977.2024.06.009

Microbial Limits of Seven Traditional Chinese Medicine Formula Dranules Including Cassia Seed Verification of the Applicability of Inspection Methods

LIU Qiwen， WANG Chunlin， TIAN Xia， QIN Desong， CHEN Cheng*

（Chongqing Qianjiang Institute for Food and Drug Control Qianjiang， Chongqing 409000， China）

Abstract： Objective： Applicability of establishing microbial limit testing methods for 7 traditional Chinese medicine formula granules， including cassia seed.Method： Conduct method suitability tests according to the "General Principles 1105， 1106， 1107" in Part IV of the 2020 edition of the Pharmacopoeia of the People’s Republic of China. Result： Using the plate pouring method （dilution method），the aerobic bacterial count showed that Albizia flower （Albizia flower）， Sophora flower （Sophora flower） （1∶50， 1 mL/dish）， as well as Albizia bark，Sophora fruit，Spina gleditsiae，and Fenugreek （1∶20，1 mL/dish）； In the counting of mouldi and yeast， the antibacterial properties of the formulation particles of Albizia flower （1∶20， 1 mL/dish） and the acacia skin formulation particles （1∶50， 1 mL/dish） are eliminated. The control bacteria test is conducted using the plate pouring method （conventional method）. Conclusion： This method can provide reference for quality control of seven traditional Chinese medicine formula granules， including Cassia seed.

Keywords： traditional chinese medicine formula granules； microbial limit； applicability verification

0引言

中藥配方顆粒自1993年起在我國開始試點[1]，經過20余年研究和試點生產、使用，在臨床中得到廣泛應用，是對傳統中藥的一次突破，是對中醫藥的傳承與發展的一次創新。目前，中藥配方顆粒分為兩種：一種是由單味中藥飲片經水加熱提取、分離、濃縮、干燥、制粒而成的顆粒，另一種是單味中藥經超微粉碎后制成的顆粒。中藥配方顆粒屬于中藥飲片管理范疇，其質量控制遵循中藥配方顆粒國家藥品標準、地方標準和《中華人民共和國藥典》2020年版四部“通則0104”。

目前，對中藥配方顆粒質量標準相關的報道很多，大部分集中在特征圖譜、含量測定等成分的鑒定上，但是對微生物限度的報道相對較少。而微生物限度檢驗作為控制藥品質量的重要標志之一[2]，不僅能了解藥物微生物的污染情況，對藥品的動態、實時監控提供重要依據，同時還能反映藥品生產工藝、清潔工藝情況，掌握其藥品安全質量是否符合標準。然而，現行《中華人民共和國藥典》2020年版四部對中藥配方顆粒微生物限度檢測方法的描述比較籠統，缺乏針對性，加上部分中藥存在一定的抑菌性，其抑菌活性可能會影響藥品微生物污染的真實情況[3]，導致檢測數據不夠準確，增加了質量監管風險。因此，針對不同品種的中藥配方顆粒，要進行微生物適用性試驗消除抑菌活性，但不能直接采用平皿傾注法（常規法）進行檢測微生物限度[4]。

決明子、合歡花、合歡皮、皂角刺、槐角、槐花、葫蘆巴都是方劑中最常見的中藥飲片。多篇文獻報道顯示，這些中藥飲片具有一定的抑菌活性，對病原微生物有不同程度的抑制作用[5-9]。因此，在對這7種中藥配方顆粒進行微生物限度檢查之前，必須先消除可能存在的抑菌活性。本文通過對決明子7種中藥配方顆粒分別進行需氧菌、霉菌和酵母菌計數和控制菌檢查方法的驗證，建立能有效消除抑菌活性、試驗菌回收比值和控制菌要求均符合藥典規定的微生物限度方法，為行業內中藥配方顆粒的微生物限度檢查提供參考。

1材料

1.1樣品

合歡花（合歡花）配方顆粒（批號0422002791）、合歡皮配方顆粒（批號0422001271）、決明子（鈍葉決明）配方顆粒（批號0422002301）、槐角配方顆粒（批號0422003791）、皂角刺配方顆粒（批號0422002541）、槐花（槐花）配方顆粒（批號0422003421）、胡蘆巴配方顆粒（批號0422004531）由重慶紅日康仁堂藥業有限公司生產。

1.2培養基及稀釋液

胰酪大豆胨瓊脂培養基（TSA）（批號2211112）、胰酪大豆胨液體培養基（批號220929）、麥康凱液體培養基（批號220227）、麥康凱瓊脂培養基（批號2210172）、沙氏葡萄糖瓊脂培養基（SDA）（批號220304）、pH=7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（批號221018）均購自北京三藥科技開發公司。氯化鈉（廠家：西亞，批號20221011）。

1.3菌株

金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、銅綠假單胞菌[CMCC（B）10104]、大腸埃希菌[CMCC（B）44102]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]均由北京三藥科技開發公司生產。

1.4儀器

電子天平（梅特勒-托利多ML503-T）、生物安全柜（青島海爾特種電器有限公司HR40-IIB2）、超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術有限公司SW-CJ-2FD）、恒溫恒濕培養箱（常州市科邁實驗儀器有限公司HSX-250）、霉菌培養箱（上海博訊實業有限公司BMJ-250）、立式高壓蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械廠LDZM-80KCS-Ⅲ）。

2方法

2.1菌液制備

按照菌種說明書將“1.3”的陽性菌株用0.9%無菌氯化鈉溶液稀釋成菌懸液，其菌落形成單位均不大于100 cfu/ mL[10-13]。

2.2供試液制備

取樣品10 g，以pH=7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液作為稀釋液，依次稀釋制成1∶10、1∶20、1∶50供試液。

2.3平皿傾注法（常規法）

采用常規平皿法篩查供試品有無抑制微生物生長的作用和抑制的微生物種類。分別取銅綠假單胞菌液、金黃色葡萄球菌液、枯草芽孢桿菌液、白色念珠菌液、黑曲霉菌液0.1 mL加到9.9 mL的1∶10供試液中，混勻，作為試驗組；取稀釋液0.1 mL加到9.9 mL的1∶10供試液中，混勻，作為供試品對照組；取上述菌液0.1 mL，加到9.9 mL稀釋液中，混勻，作為菌液對照組。每組分別移取1 mL待測液置于2個無菌平皿（直徑90 mm）中，然后分別傾注TSA瓊脂培養基或SDA瓊脂培養基[14]，混勻凝固后培養，計算平均菌落數。

2.4平皿傾注法（稀釋法）

取“2.3”的菌液0.1 mL分別加到9.9 mL的1∶20和1∶50供試液中，混勻，作為試驗組；取稀釋液0.1 mL分別加到9.9 mL的1∶20和1∶50供試液中，混勻，作為供試品對照組；菌液對照組同“2.3”的操作一致。每組分別移取1 mL待測液置于2個無菌平皿（直徑90 mm）中，然后分別傾注TSA瓊脂培養基或SDA瓊脂培養基，混勻凝固后培養，計算平均菌落數[15]。

2.5回收比計算

試驗組回收比=（試驗組平均菌落數-供試品對照組平均菌落數）/菌液對照組平均菌落數。

3結果

3.1微生物計數檢查

3.1.1平皿傾注法（常規法）

通過表1平均回收比顯示，決明子（鈍葉決明）配方顆粒的平均回收比均在0.5～2.0，符合《中華人民共和國藥典》2020年版四部要求，表明平皿傾注法（常規法）適用決明子（鈍葉決明）配方顆粒的微生物計數。而其他6種配方顆粒的平均回收比均出現小于0.5的情況。在需氧菌中，這6種配方顆粒樣品均對其中一種或多種菌株有一定的抑制作用，平皿傾注法（常規法）檢查不適用；在霉菌和酵母菌中，合歡花（合歡花）、合歡皮配方顆粒對白色念珠有較強抑制作用，平皿傾注法（常規法）檢查不適用。

3.1.2平皿傾注法（稀釋法）

根據表1結果將不適宜平皿傾注法（常規法）的配方顆粒，分別按照2.4項下方法操作，加入金黃色葡萄球菌液、銅綠假單胞菌液、枯草芽孢桿菌液、白色念珠菌陽性菌液的平皿傾注TSA瓊脂，加入黑曲霉菌液的平皿傾注SDA瓊脂，結果見表2。

3.1.3需氧菌計數、霉菌和酵母菌計數方法確定

根據“3.1.1”“3.1.2”的結果，得出微生物計數檢查方法：需氧菌計數中，決明子（鈍葉決明）配方顆粒常規（1∶10），合歡皮、槐角、皂角刺和胡蘆巴配方顆粒稀釋（1∶20），合歡花（合歡花）、槐花（槐花）配方顆粒稀釋（1∶50）；霉菌和酵母菌計數中，合歡花（合歡花）配方顆粒稀釋（1∶20），合歡皮配方顆粒稀釋（1∶50），其他5種配方顆粒常規（1∶10）。

3.1.4正式試驗

根據“3.1.3”的方法，每種樣品取1批次，進行2次獨立試驗，計算平均回收比，試驗結果見表3。

按照“3.1.3”的方法進行需氧菌計數、霉菌和酵母計數實驗，合歡花（合歡花）、合歡皮、決明子（鈍葉決明）、槐角、皂角刺、槐花（槐花）、胡蘆巴配方顆粒各菌株平均回收比均在0.5～ 2.0范圍內，符合標準，表明該試驗方法可行。

3.2控制菌檢查

3.2.1常規法

取2.2項下1∶10供試液10 mL，加到100 mL TSB中混勻，作為供試品組；取1∶10供試液10 mL和大腸埃希菌液0.1 mL，加到100 mL TSB中混勻，作為試驗組；取稀釋液10 mL，加到100 mL TSB中，作為陰性組；按照《中華人民共和國藥典》2020版四部通則方法檢查。

3.2.2稀釋法

取“2.2”制備的1∶20供試液代替1∶10供試液，按照“3.2.1”配制供試品組、試驗組、陰性組，同法檢查。

3.2.3結果

在常規法、稀釋法中試驗組均檢出陽性菌，樣品組和陰性組均無菌落生長，符合《中華人民共和國藥典》2020年版四部“1106規定”，表明這7個配方顆粒對大腸埃希氏菌無抑制作用，均適用常規法進行控制菌（大腸埃希菌）檢查。

4討論

近年來對中藥飲片微生物污染情況[16-18]的研究與探討日益增多，體現了微生物限度的重要性。無論是在生產工藝和質量監管上，還是客觀反映人、機、料、法、環等諸多因素上，微生物限度都是評價藥品安全性的重要指標，是輔助監管部門綜合評判風險的關鍵因素之一。因此，對中藥配方顆粒建立合理有效的微生物檢測方法尤其重要。

微生物限度檢查方法適用性采用平皿傾注法（常規法），通過試驗發現常規法不能滿足規定要求。部分中藥配方顆粒對某些微生物有一定抑制作用，平均回收比不在0.5～2.0范圍內，需要消除抑菌性。本文采用稀釋法使樣品的抑菌活性減弱，保障定量試驗結果準確性。在需氧菌計數檢查中，合歡花（合歡花）、槐花（槐花）配方顆粒采用平皿傾注法（稀釋法）（1∶50，1 mL/皿），合歡皮、槐角、皂角刺、胡蘆巴配方顆粒采用平皿傾注法（稀釋法）（1∶20，1 mL/皿）均可消除抑菌性。在霉菌和酵母菌計數檢查中，合歡花（合歡花）配方顆粒采用平皿傾注法（稀釋法）（1∶20，1 mL/皿）、合歡皮配方顆粒采用平皿傾注法（稀釋法）（1∶50，1 mL/皿）能消除抑菌性。在控制菌檢查中，大腸埃希菌采用平皿傾注法（常規法）符合標準規定。

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【作者簡介】

劉琪雯，女，1990年出生，工程師，學士，研究方向為藥品和化妝品質量檢測。

通信作者：陳琤，女，1980年出生，副主任藥師，學士，研究方向為藥品和化妝品質量檢測與管理，462436881@qq.com，19102372755。

（編輯：侯睿琪）