不同來源SSR引物對刺梨種群遺傳差異性分析

摘要：[目的]研究刺梨EST-SSR與近緣物種薩蔓莎月季的EST-SSR對刺梨種群遺傳分析產(chǎn)生的差異，為刺梨遺傳多樣和遺傳結構研究提供不同來源SSR標記位點。[方法]采用6對薩蔓莎月季EST-SSR引物和6對刺梨EST-SSR引物對261個野生刺梨樣本進行基因分型，利用GenAlex軟件估算群體遺傳多樣性參數(shù)、遺傳分化系數(shù)和基因流，并進行AMOVA分子方差分析，采用SPSS Statistics軟件進行方差分析和相關性分析，NTSYS軟件計算遺傳相似度并按照UPGMA方法進行聚類。[結果]12對SSR引物共擴增出95條帶，其中薩蔓莎月季SSR引物擴增出53條帶，刺梨SSR引物擴增出42條帶。基于薩蔓莎月季SSR引物估算出的平均有效等位基因數(shù)目、期望雜合度、多態(tài)性信息含量和香濃信息指數(shù)分別為2.206、0.477、0.459和0.862，比刺梨SSR引物估算出的相應指標分別低了1.242、0.205、0.215和0.451。遺傳分化結果顯示，基于月季SSR和刺梨SSR估算的遺傳分化系數(shù)Fst分別為0.128和0.062，均表明群體屬于低等遺傳分化水平。基于兩種SSR標記的群體AMOVA分析結果基本相同，遺傳變異主要來源于群體內。遺傳距離相關性結果顯示，兩種來源的SSR得到的結果無顯著相關性，而聚類結果相似。[結論]薩蔓莎月季SSR與刺梨SSR在進行遺傳多樣性和遺傳距離分析時存在一定的差異，但差異并不顯著；遺傳分化和AMOVA分析得到的結果極為相似，表明近緣物種薩蔓莎月季的SSR在刺梨中通用性比較好，為后續(xù)刺梨種質資源收集、品種鑒定和指紋圖譜構建提供了標記位點，為薔薇科植物遺傳多樣性分析提供了新的思路。

關鍵詞：刺梨；薩蔓莎月季；EST-SSR；遺傳多樣性；相關性分析

中圖分類號：S792.11 文獻標識碼：A 文章編號：1001-1498（2024）06-0171-09

刺梨（Rosa roxburghii Tratt）又名繅絲花、送春歸、刺莓果、佛朗果、木梨子等，系薔薇科（Rosaceae）薔薇屬（Rosa）小葉組多年生落葉灌木的果樹，我國特有野生植物，主要分布在貴州、湖南、江西、云南、湖北、重慶、陜西、四川，常生于海拔500-2 500 m的向陽山坡、溝谷、路旁以及灌木叢中。刺梨果實酸甜可口，富含大量維生索C、維生素P和超氧化物歧化酶，被譽為水果中的“維C之王”，此外，刺梨中還含有多種氨基酸、礦物質和生物活性物質如黃酮類化合物，在食品加工、醫(yī)藥、保健品、化妝品行業(yè)中都具有廣泛的應用前景。目前刺梨資源收集保存基礎薄弱，遺傳改良研究更是停滯不前。為有效開展野生刺梨資源的收集、保存和評價，充分掌握刺梨資源種質親緣關系，進一步挖掘優(yōu)良特異基因資源，加速刺梨良種選育進程，亟需開展刺梨種群遺傳結構和遺傳多樣性的研究。

分子標記是最準確的遺傳標記方法，SSR標記相比于其它標記具有多態(tài)性豐富、共顯性遺傳、分布廣泛和易檢測等優(yōu)點，已廣泛應用于檀物遺傳多樣性分析、QTL定位和遺傳圖譜構建研究。SSR除了可以從本物種的轉錄組、基因組序列中獲得，在沒有本物種序列的情況下，也可通過近緣物種轉移法獲得。來源不同的SSR具有一定的遺傳差異性屬正常現(xiàn)象。EST-SSR具有很強的保守性，與植物的表型性狀以及生理生化特征有密切聯(lián)系，在物種之間具有可轉移性，目前刺梨可用分子標記較少，且基因組尚未公布，導致刺梨的分子育種進程得到了限制。本研究基于近緣物種薩蔓莎月季（Rosa chinansis Jacq.）開發(fā)的SSR標記與刺梨EST-SSR、混合兩種SSR標記進行遺傳差異性分析，驗證近緣物種SSR標記是否可靠，以期為刺梨遺傳多樣性分析提供新的分子標記可能性，對深入了解和保護刺梨遺傳資源以及加速刺梨育種進程具有重要意義，同時也為今后薔薇科的育種工作合理選用不同來源的SSR分子標記提供更多的可能性。

1材料與方法

1.1試驗材料

2022年9-11月于貴州省黔南州刺梨種質資源庫采集所需刺梨葉片，樣本來源8個省份，樣本量取決于群體大小，且每個省份不少于5株，見表1，于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2DNA提取

利用液氮研磨刺梨葉片，采用CTAB法提取基因組DNA。用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整度和雜質情況，使用Nanodrop One超微量分光光度計測定DNA的濃度和純度，并將DNA的濃度統(tǒng)一稀釋至3～5 ng·uL-1，放置-20℃冰箱以備擴增使用。

1.3SSR引物設計和合成

刺梨EST-SSR引物來自于公開發(fā)表的10對引物序列。30對近緣物種SSR引物自行設計：在NCBI網(wǎng)站上下載薩蔓莎月季轉錄組序列。利用MISA軟件識別轉錄組中的SSR位點，設置標準參數(shù)為：重復基元為1～6 bp，其中單核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸最少重復次數(shù)分別為10、6、3、3、3、3。Primer3軟件批量設計引物。設計標準為：Tm（退火溫度）在50～65℃之間，上、下游引物的Tm相差≤5℃；引物長度范圍為18-28 bp；PCR產(chǎn)物大小在80～300 bp；GC含量在40％～60％之間。所有引物委托生工生物工程股份有限公司合成。

1.4PCR擴增及產(chǎn)物檢測

TP-M13-SSR引物包括3條引物：在正向引物的5’端加M13尾巴（TGTAAAACGACGGCCAGT）；普通的反向引物；帶有ROX（red）、HEX（green）和FAM（blue）3種M13熒光標記引物。PCR擴增體系和程序參照魯敏等人的方法。

利用得到的多態(tài)性SSR引物對261份刺梨進行PCR擴增，使用毛細管電泳熒光檢測法對擴增產(chǎn)物進行檢測（由生工生物工程股份有限公司完成）。使用GeneMarker v2.2.0軟件對毛細管電泳結果進行分析，并將SSR分析結果錄入Microsoft Excel 2016中。

1.5數(shù)據(jù)分析

采用GenAIEx 6.5軟件估算參試刺梨種質的遺傳多樣性參數(shù)：包括等位基因數(shù)（NA）、有效等位基因數(shù)（NE）、觀測雜合值（Ho）、期望雜合值（HE）、香農(nóng)信息指數(shù)（/），利用軟件CERVUS3.0計算多態(tài)性信息指數(shù)（PIC），利用NTSYS pe2.1軟件計算遺傳相似系數(shù)，并按照UPGMA方法進行聚類分析，繪制聚類圖。利用SPSS Statistics17.0軟件進行方差分析和相關性分析。

2結果與分析

2.1不同SSR引物擴增情況

每省份選取1個樣本（共8個）進行引物篩選，篩選標準為：能擴增出清晰的條帶且表現(xiàn)出多態(tài)性（圖1）。結果共篩選出12對SSR引物，其中月季SSR引物6對，刺梨SSR引物6對，引物詳細情況如表2所示。利用12對引物對261份樣本進行擴增，共擴增出95條帶，其中薩蔓莎月季SSR擴增出53條帶，刺梨SSR擴增出42條帶。

2.2不同SSR引物對剌梨種群間遺傳參數(shù)的影響

對所有刺梨及進行遺傳多樣性研究結果如表3所示：來自于刺梨EST-SSR引物的估算結果為：可檢測的等位基因數(shù)目（NA）為3.000-8.600，平均為5.200，平均有效等位基因數(shù)目（NE）為3.488；平均多態(tài)性信息含量（PIC）平均值為0.674，所有引物的PIC值都大于0.5，均為高度多態(tài)性引物；平均觀測雜合度（Ho）和預期雜合度（HE）分別為0.656和0.682；平均Shannon信息指數(shù)，為1.313。基于月季EST-SSR引物的估算結果：平均NA和NE分別為3.825和2.206，PIC變化范圍為0.224-0.576，平均值僅為0.459，屬于中等多態(tài)性水平，平均Ho和HE分別為0.398和0.477；平均/為0.862。混合EST-SSR的12對引物估算結果：平均NA和NE分別為4.513和2.830，平均PIC值為0.568，平均Ho和HE分別為0.528和0.580，平均/為1.088，居于刺梨SSR和月季SSR得到的結果之間，且差異幾乎一致。以張懷山的關于刺梨引物開發(fā)和遺傳多樣性研究論文作為參考與本研究相比較，參考的SSR估算的平均NA、NE、Ho、HE和，分別為4.400、3.015、0.750、0.640和1.156，結果更加貼近月季SSR的結果，NE、HE、和I分別僅高于月季SSR的0.575、0.163和0.294。

2.3不同SSR引物對剌梨種群間遺傳距離的影響

利用GenAlex軟件計算的遺傳距離結果見表4、5所示，遺傳距離整體較小，說明各群體親緣關系較近。其中基于刺梨EST-SSR得到的遺傳距離為0.008～0.340，平均值為0.116，其中遺傳距離最遠的是江西和重慶（0.340）。基于月季EST-SSR得到的遺傳距離范圍為0.032～0.277，平均遺傳距離為0.123，其中遺傳距離最遠的是湖南和湖北（0.277）。基于混合SSR得到的遺傳距離范圍為0.012-0.201，平均值為0.094，最遠遺傳距離為江西和重慶（0.201）。

對刺梨EST-SSR、月季EST-SSR以及混合SSR得到的各群體間遺傳距離進行相關性分析，結果如表6所示，其中混合SSR得到的遺傳距離與刺梨EST-SSR和月季EST-SSR得到的遺傳距離均表現(xiàn)為顯著相關，月季和刺梨之間結果無相關性。

2.4不同SSR引物對剌梨種群間遺傳分化的影響

經(jīng)GenAlex軟件得到的遺傳分化F統(tǒng)計量和基因流數(shù)值如表7所示。基于刺梨SSR得到的平均Fis、Fit和Fst值分別為0.033、0.090和0.062，種群間基因流值波動較大（Nm=4.181），屬低等遺傳分化程度。基于月季SSR得到的平均Fis、Fit和Fst值分別為0.257、0.328和0.128，Nm為2.444，屬中等遺傳分化程度，比刺梨SSR的基因流低1.737，差異較大。月季SSR和刺梨SSR的Fst結果與混合SSR的差異一致。刺梨SSR的Fst結果更接近參考SSR的結果，而月季SSR的Nm更加貼近參考SSR的結果。

AMOVA分析結果如圖2所示，4類SSR所得結果存在少許差異，均說明刺梨群體遺傳變異主要是由種群內變異引起。基于刺梨SSR種群間的變異分量占總變異的4.62％，種群內的遺傳變異占總變異的95.38％（圖2A）；基于月季SSR的種群間和種群內遺傳變異分別占總變異的8.64％和91.36％（圖2B）；基于混合SSR種群間和種群內遺傳變異分別占6.64％和93.36％（圖2C）；參考數(shù)值的種群間和種群內遺傳變異分別占總變異的7.28％和92.72％（圖2D）。分析4種結果，月季SSR和刺梨SSR所得分子方差分析結果差別最大，混合SSR所得結果介于兩者之間，且差距幾乎一致；參考數(shù)值與月季SSR結果更為相似。

2.5不同SSR引物對刺梨種群聚類分析的影響

根據(jù)GenAlex計算的遺傳相似度，利用NTSYS-pe 2.1軟件以UPGMA方法進行聚類分析，如圖3所示。從圖3A中可以看出，刺梨EST-SSR在相似系數(shù)0.86處將8個群體刺梨聚為兩類，其中江西省的種質單獨為一類，其他7個省市種質為一類；從圖38中可以看出，月季EST-SSR在相似系數(shù)0.84處將8個群體刺梨聚為兩類，其中湖南省和江西省的種質為一類，其他6個省市的為一類；混合SSR在相似系數(shù)0.88處將8個群體刺梨聚為兩類，其中江西省的種質單獨為一類，其他7個省市的為一類，結果與刺梨EST-SSR的基本一致，如圖3C所示。

3討論

目前SSR標記成為揭示植物種群遺傳多樣性的良好選擇，原因有三：SSR標記在高等植物中一般位于基因組的非編碼區(qū)，其位點上的錯配和突變極少影響生物個體的生存和繁殖力，表現(xiàn)為中性進化；第二，除染色體著絲粒附近區(qū)域外，微衛(wèi)星在染色體上的分布沒有明顯的差異，基本上是均勻分布，此外，SSR引物在近緣物種中具有高度保守性。已有研究證明薔薇科植物之間SSR引物具有較高通用性，薩蔓莎月季是薔薇科薔薇屬月季組觀賞植物，是刺梨近緣種的典型代表，目前其基因組和轉錄組已經(jīng)公布。本研究利用的刺梨SSR引物來自前人開發(fā)的已證實存在多態(tài)性的引物；混合SSR即刺梨SSR+月季SSR，綜合了兩種標記的引物更具有客觀性，利用近緣物種薩蔓莎月季已公開的EST序列開發(fā)SSR標記，與刺梨EST-SSR標記、混合SSR標記和參考的SSR標記分別對261各樣本進行遺傳多樣性、遺傳距離、遺傳分化和聚類分析，對結果進行比較分析，驗證近緣物種SSR在刺梨中具有通用性。

SSR標記是植物遺傳多樣性分析的有效的工具，反之，遺傳多樣性分析結果和種質親緣關系也是驗證SSR標記是否可靠的方法。本研究遺傳多樣性分析結果顯示，基于不同引物得到的遺傳多樣性均較高，分別為：刺梨SSR得到的/=1.313，HE=0.682，月季SSR得到的/=0.862，HE=0.477，相近于張懷山的結果（t=0.87，HE=0.51），而高于吳詩琪的研究結果（/=0.534、HE=0.359），這是因為本研究群體大小和采樣范圍與張懷山的研究相當，且本研究的SSR引物一部分來源于此研究，而吳詩琪的研究采樣范圍和群體數(shù)量較小。進一步對PIC值和，值進行方差分析，發(fā)現(xiàn)兩種來源的SSR差異不明顯（/值的S2=0.03，PIC值的S2=0.02），這與刺槐（Robinia pseudoacacia L.）、紫丁香（Syringa oblata Lindl.）、梅花（Prunus mume Sieboldamp; Zucc.）、云南移[木衣]（Docynia delavayi （Franch）Schneid.）的結果一致，證實了SSR引物通用性良好。

本研究的遺傳距離總體較小，表明各種群親緣關系近。遺傳距離相關性分析結果表示：月季SSR、刺梨SSR均與混合SSR所得結果表現(xiàn)為顯著相關，月季SSR與刺梨SSR所得遺傳距離結果不存在相關性，原因是本研究所用的SSR標記處于EST序列上的不同位置，不存在重疊和關聯(lián)。3種SSR聚類結果相似度高，均把8個種群分為2類，刺梨SSR把湖南和江西聚為一類，原因為湖南與江西鄰近。基于月季SSR得到的聚類結果，將江西的種質單獨分為一類，更貼近混合SSR結果。刺梨SSR和月季SSR的遺傳分化系數(shù)Fst分別為0.062和0128，與張懷山的研究比較（Fst=0.073），前者結果更加相近，因為本研究刺梨SSR引物來自張懷山所研究引物，結果合理。本研究遺傳分化系數(shù)低于野生半夏（Pinelliatemate （Araceae》（Fst-0.909）、云南大花香水月季（Rosa odorata var.gigantea （Crep）Rehd）（0.3051），屬于低遺傳分化水平，種群間的基因交流頻繁（Nm=2.444～4.181），種群間的遺傳變異占總變異的極少部分（4.62％～8.64％），多數(shù)變異來自種群內，與張懷山的研究結果一致。分析原因為：刺梨在云貴川一帶屬于連續(xù)分布，無地理隔斷，可通過鳥獸、風媒介使花粉交流頻繁；刺梨耐陰且適應性極強，位于河道旁的刺梨因河水的沖擊，種子或其他繁殖材料會順著河道擴散至地勢較低的地方，都導致基因交流頻繁；本研究以省為劃分種群的單位，不同種群間樣本的地理距離可能會小于同一種群內樣本間的地理距離，故所得種群間的遺傳分化較小。

4結論

本研究開發(fā)的月季SSR標記為中等多態(tài)性水平（PIC=0.459），刺梨SSR標記為高度多態(tài)性水平（PIC=0.674）。本研究利用月季SSR、刺梨SSR和混合SSR分別對261份野生刺梨進行遺傳參數(shù)（NE、HE和/）估算，結合參考論文的遺傳參數(shù)進行差異性分析，結果發(fā)現(xiàn)不同來源的SSR所得數(shù)據(jù)存在一定的差異，但差異不顯著；基于不同來源的SSR得到的聚類結果和遺傳分化參數(shù)進行比較分析，結果極為相似，說明薩蔓莎月季SSR在刺梨中通用性較好，為刺梨群體遺傳學及核心種質資源收集保存研究奠定了分子學基礎，拓展了刺梨分子生物學研究的標記來源，將有力推動刺梨遺傳改良研究進展。