毛細管柱氣相色譜內標法檢測蒸餾白酒中甲醇和乙酸乙酯的含量

摘 要：目的：建立毛細管柱氣相色譜內標法測定蒸餾白酒中甲醇和乙酸乙酯含量的方法。方法：以叔戊醇為內標物質，利用氣相色譜-氫火焰離子化檢測器和INNOWAX色譜柱對市售蒸餾白酒中的甲醇和乙酸乙酯進行檢測，內標法定量。結果：通過優化色譜條件，甲醇和乙酸乙酯可以實現有效分離；兩種物質與叔戊醇的濃度比在各自線性范圍內線性關系良好，相關系數分別為0.999 9和0.999 5；在低、中、高3個加標水平下，兩種樣品的平均回收率在96.9%～99.4%，相對標準偏差在0.66%～2.03%。結論：該方法靈敏度好，準確性及分析效率高，適用于檢測蒸餾白酒中甲醇和乙酸乙酯的含量。

關鍵詞：氣相色譜；蒸餾白酒；甲醇；乙酸乙酯

Determination of Methyl Alcohol and Ethyl Acetate in Distilled Baijiu by Capillary Column Gas Chromatography with Internal Standard

LI Yang， XIONG Wen， ZHANG Jie*

（Enshi Center for Disease Control and Prevention， Enshi 445000， China）

Abstract： Objective： To establish a capillary column gas chromatography internal standard method for the determination of methyl alcohol and ethyl acetate in distilled Baijiu. Method： Using tert-amyl alcohol as internal standard material， methanol and ethyl acetate in distilled Baijiu were determined by gas chromatography-hydrogen flame ionization detector and INNOWAX column. Result： By optimizing chromatographic conditions， methanol and ethyl acetate could be effectively separated; the concentration ratio between the two substances and tert-amyl alcohol had a good linear relationship in their respective linear ranges， and the correlation coefficients were 0.999 9 and 0.999 5， respectively; the average recoveries of the two samples were 96.9% to 99.4% and the relative standard deviations were 0.66% to 2.03% under the three levels of low， middle and high. Conclusion： The method has good sensitivity， high accuracy and high analytical efficiency， and is suitable for the determination of methyl alcohol and ethyl acetate in distilled Baijiu.

Keywords： gas chromatography; distilled Baijiu; methanol; ethyl acetate

我國酒文化歷史悠久，其中蒸餾白酒憑借其獨特的釀造工藝和風味，在中國飲食文化中占據重要地位。釀酒原料在白酒釀造過程中會生成以乙醇為主體，醇、酸、酯及醛等多種微量成分共存的復雜體系。甲醇作為白酒中影響消費者健康的醇類物質，具有強烈毒性，在人體內有蓄積作用[1]，對中樞神經系統和視神經有特殊選擇作用，過量攝入會導致多種不適癥狀，如視力模糊（嚴重時可致失明）、呼吸功能障礙（嚴重時可致呼吸衰竭）等[2]。近年來，散裝白酒的質量安全問題日益突出，因此對酒中甲醇含量進行準確定量檢測顯得尤為重要，而乙酸乙酯作為賦予白酒特殊香氣的重要組成酯類，與甲醇和乙醇的沸點相近，高含量乙醇和乙酸乙酯在色譜圖中響應值較大，甲醇峰容易與乙醇峰或乙酸乙酯峰重疊，導致目標峰分離不完全[3]，嚴重影響白酒中甲醇的準確定量檢測。基于此，本文旨在優化色譜條件，建立一種測定蒸餾白酒中甲醇和乙酸乙酯含量的方法。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

白酒樣為包谷酒（酒精度53%vol），市售。

GC-2030AF氣相色譜儀（配備自動進樣器、氫火焰離子化檢測器），日本島津公司；氮氣、氫氣（純度均大于99.999%）；強極性石英毛細管色譜柱，SH-Rtx-Wax（30 m×0.25 mm，0.25 μm）、SH-Rtx-Wax（60 m×0.25 mm，0.25μm）及HP-INNOWax（30 m×0.25 mm，0.25 μm）。

無水乙醇、甲醇、乙酸乙酯及叔戊醇，均為色譜純；15種組分白酒標準溶液（ZKP3049-15），滕州中科譜分析儀器有限公司。

1.2 色譜條件

柱溫箱升溫程序：初始溫度40 ℃保持3 min，以5 ℃·min-1升至130 ℃，再以20 ℃·min-1升溫至200 ℃，保持5 min。進樣口溫度為250 ℃，柱流量為1.20 mL·min-1，分流比為70∶1，氫火焰離子化檢測器溫度為250 ℃，氫氣和空氣流速分別為35、350 mL·min-1，進樣量為1.0 μL。

1.3 試劑及標準溶液的配制

（1）乙醇溶液（40%，V/V）：量取40 mL無水乙醇，純水定容至100 mL，混勻。

（2）混合標準工作溶液（甲醇濃度為5 000 mg·L-1，乙酸乙酯濃度為6 000 mg·L-1）：分別準確稱取0.250 g甲醇和0.300 g乙酸乙酯至50 mL容量瓶中，用乙醇溶液定溶至50 mL，混勻，于4 ℃冰箱中低溫保存待用。

（3）叔戊醇標準溶液（7 506 mg·L-1）：準確稱取0.375 3 g叔戊醇至50 mL容量瓶中，用乙醇溶液定溶至刻度線，混勻，于4 ℃冰箱中低溫保存待用。

1.4 標準曲線的建立

分別準確吸取適量混合標準工作溶液于7個10 mL容量瓶中，用40%乙醇溶液（V/V）定容至刻度線，配制成不同質量濃度的混合標準系列溶液，混勻，分別取1.0 mL于進樣瓶中，加入30 μL叔戊醇標準溶液，立即加蓋密封后混勻，上機測定。

1.5 方法檢出限和定量限

將裝有995 μL乙醇溶液的20支進樣小瓶分為2組，分別使用微量移液器和氣密性注射器加入5 μL混合標準工作溶液和30 μL內標叔戊醇標準溶液，加蓋密封后混勻，上機測定。

1.6 回收率和精密度

分別準確移取1.0 mL白酒樣品于20支進樣小瓶中，其中2支作為本底樣品，其余18支分為3組，每組分別加入混合標準工作溶液20、40 μL和70 μL，最后各加入30 μL內標叔戊醇標準溶液，加蓋密封混勻后，上機測定，計算各組的回收率和相對標準偏差。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的優化

2.1.1 石英毛細管色譜柱的篩選及待測組分定性

甲醇和乙醇同為醇類物質，物理特性相似，導致二者分離難度較大[4]。采用長度、內徑和固定相液膜厚度不同的強極性聚乙二醇石英毛細管柱，考察不同色譜柱對目標組分分離效果的影響。由圖1可知，待測組分在不同色譜柱上出峰順序無明顯差異，當使用內徑、膜厚度及固定相相同而長度不同的Rtx-Wax色譜柱時[圖1（a）和圖1（b）]，被分析物的保留時間隨柱長度的增加而延長，目標物質分離效果均不理想，乙酸乙酯峰、甲醇峰完全重疊，甲醇與乙醇、叔戊醇與乙醇的分離度較差，出現峰形不對稱和嚴重拖尾現象，直接影響甲醇、乙酸乙酯的準確定量；當使用內徑較大、液膜較厚的INNOWAX色譜柱時，乙酸乙酯、甲醇、叔戊醇實現完全分離，峰形尖銳對稱、分離度高、半峰寬、響應靈敏[圖1（c）]。因此，最終選擇HP-INNOWAX石英毛細管柱進行后續實驗。

2.1.2 分流比的確定

分流比即為分流流量與色譜柱柱流量之比，適當的分流比可改善半峰寬及對稱性，有效提高組分間的分離度[3]。保持其他色譜條件不變，分別設置分流比為20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1、80∶1、90∶1及100∶1，考察各目標物質的分離效果。不同分流比對保留時間、分離度、峰面積、半峰寬及理論塔板數的影響如表1所示。不同分流比下保留時間的相對標準偏差為0.93%，改變分流比對保留時間無明顯影響，但可對組分分離度、峰面積、峰形及柱效產生一定程度影響。分流比越大，進入到色譜柱的樣品量越小，峰面積逐漸變小，分流歧視影響增大，測定靈敏度降低；半峰寬隨分流比的增加呈現變窄的趨勢，但在（70∶1）～（100∶1）時變化不明顯。因此，為避免分流比過小引起柱超載和溶劑拖尾遮掩目標峰，以及分流比過大導致分流歧視增大和分析靈敏度降低，最終選擇分流比為70∶1進行后續實驗。

2.1.3 初始溫度優化結果及分析

色譜柱的初始溫度既要保證待測組分完全分離，又要保證所有組分都能流出色譜柱，且應避免分析時間過長。通常，溫度越低，低沸點物質分離度越好[5]。保持其他色譜條件不變，設置初始溫度分別為30、35、40、45、50 ℃和55 ℃，考察不同初始溫度對目標物質分離效果的影響。不同初始溫度對保留時間、分離度、峰面積、半峰寬、理論塔板數的影響如表2所示。結果表明，不同初始溫度對各組分保留時間、分離度、柱效及色譜峰峰形影響較大。初始溫度越高，出峰越快，保留時間、分離度、理論塔板數變小，溫度變化造成保留時間的重現性較差，從而影響待測組分的定性結果。雖然在較低溫度下可改善低沸點化合物的分離度，但可能使已汽化的高沸點組分重新凝華導致組分損失和色譜柱污染，同時基于色譜柱的聚合物固定相在黏流狀態下的傳質阻力較小，容易獲得較高的柱效，且INOWAX色譜柱的使用溫度下限為40 ℃，因此選擇初始溫度為40 ℃進行后續實驗。

2.1.4 初始溫度保持時間

在氣相色譜分析過程中，進入正式程序之前，于特定初始溫度條件下對樣品進行處理的時間長度至關重要。這段時間被稱為初始溫度保持時間，其直接影響到后續步驟中甲醇、酯類等成分的分離效果。若該時間段過短，則可能導致某些關鍵組分，如丙酸乙酯無法從溶劑峰中被清晰地分辨出來[5]。保持其他色譜參數不變，設置初始溫度保持時間分別為1、2、3、4、6 min和8 min，考察不同初始溫度保持時間對最終檢測結果的影響。結果表明，適當增加初始溫度保持時間有助于提高各色譜峰的分辨率，且不會顯著改變目標化合物的響應強度（峰面積）。隨著保持時間的增加，各目標峰可以獲得較好的分離效果，但同時各色譜峰出現半峰寬增加、峰高降低以及理論塔板數減少的現象，導致分析時間也隨之延長。綜合考慮，選擇初始溫度保持時間為3 min進行后續實驗。

2.1.5 升溫速率

升溫速率是影響氣相色譜分離效果和分析效率的重要因素之一。隨著升溫速率的減小，分離度增大，但當升溫速率超過某一閾值后，分離度開始下降[6]。設置一階升溫速率分別為4、5、8、12 ℃·min-1，考察升溫速率對分離效果的影響。不同升溫速率對各組分分離效果和效率的影響如圖2所示。較慢的升溫速率（如4 ℃·min-1和5 ℃·min-1），有助于體系接近平衡條件，使相鄰兩峰更好地分離，從而提高分辨率。然而，這種條件下樣品的測定時間較長，且對儀器靈敏度要求較高。升溫速率越快，各組分在較短時間內集中出峰，整體色譜峰的保留時間縮短，理論塔板數變大，分析效率提升，但甲醇、乙酸乙酯等化合物峰的分離度降低，導致部分組分不能完全分離。當升溫速率為8 ℃·min-1和12 ℃·min-1時，可能會導致某些組分的分離度顯著下降，甚至發生峰的重疊，進而影響色譜圖的清晰度及結果的準確性。因此，最終選擇升溫速率為5 ℃·min-1進行后續實驗。

2.1.6 色譜柱流量

氣相色譜的載氣流速是促使目標物質分離的重要原因之一[7]，柱流速直接影響組分的分離效果、出峰時間以及峰面積大小[8]。保持其他色譜條件不變，設置色譜柱流量分別為0.50、1.00、1.20、1.50、1.75、2.00 mL·min-1和2.50 mL·min-1，考察不同柱流量對目標組分分離效果的影響。不同柱流量對保留時間、峰面積、分離度、半峰寬及理論塔板數的影響如表3所示。結果表明，不同色譜柱流量對甲醇峰面積無明顯影響，對保留時間、分離度、半峰寬及理論塔板數有重要影響。隨著柱流量的增大，保留時間和理論塔板數明顯縮短、減小；當柱流量為0.50 mL·min-1和1.00 mL·min-1時，目標物的分離度隨柱流量的增加而增大，繼續增加柱流量時分離度反而逐漸減小；在柱流量為0.50～1.75 mL·min-1時，半峰寬隨柱流量的增加而變窄，當柱流量大于1.75 mL·min-1時又逐漸變寬。因此，過低的柱流量導致實驗分析時間延長，分離效果差，而過高的色譜柱流量又會導致組分流失而影響測定的靈敏性[9]。綜合考慮，選擇柱流量為1.20 mL·min-1進行后續實驗。

2.2 方法學評價

2.2.1 線性關系

以甲醇與叔戊醇、乙酸乙酯與叔戊醇的濃度比為橫坐標，其對應的峰面積比為縱坐標，分別繪制標準曲線（圖3），得到甲醇、乙酸乙酯的線性方程和相關系數。結果表明，甲醇與叔戊醇的濃度比在100～900 線性關系良好，線性方程為Y=0.002 237X-0.017 879，相關系數為0.999 9；乙酸乙酯與叔戊醇的濃度比在120～1 080線性關系良好，線性方程為Y=0.002 654X-0.073 412，相關系數為0.999 5。

2.2.2 方法檢出限和定量限

以3倍信噪比（S/N=3）對應的濃度計算檢出限，10倍信噪比（S/N=10）對應的濃度計算定量限，結果如表4所示。該方法在兩種不同加標方式下測得的檢出限和定量限無明顯差異，方法靈敏度高，檢測誤差小，目標組分可以被準確地檢測和定量。

2.2.3 回收率和精密度

按照1.6項方法進行加標回收實驗，結果如表5所示。在低、中、高3個加標水平下，甲醇和乙酸乙酯的平均回收率為96.9%～99.4%，相對標準偏差為0.66%～2.03%，表明優化色譜條件后，方法的回收率高、精密度好，測定結果準確可靠。

3 結論

白酒的基質組成較為復雜，且沸點相近的揮發性組分甲醇、乙酸乙酯、乙醇較難分離，毛細管色譜柱的選擇、柱流量、分流比、升溫程序等色譜條件直接影響著白酒中甲醇測定的準確性，從而造成白酒中甲醇的假性超標。本文通過優化色譜條件和方法學考察，建立了一種檢測蒸餾白酒中甲醇和乙酸乙酯含量的方法，該方法線性良好，能夠有效降低乙酸乙酯對甲醇峰的干擾作用，靈敏度、準確性及分析效率高，可為白酒衛生質量監控和評價提供科學準確的技術支撐。

參考文獻

[1]石相莉，鄧全道.酒中甲醇、雜醇油、乙酸乙酯、己酸乙酯的檢測[J].中國衛生檢驗雜志，2007（11）：2107-2113.

[2]趙浩然，趙華，李勝男.氣相色譜內標法測定黔北地區散裝白酒中的甲醇[J].中國衛生工程學，2023，22（3）：326-328.

[3]方海仙，普婭麗，普家云，等.氣相色譜法測定白酒中甲醇、乙酸乙酯和己酸乙酯含量的優化[J].食品安全質量檢測學報，2021，12（17）：6879-6886.

[4]李曉丹.白酒中甲醇能力驗證結果與分析[J].現代食品，2020（10）：187-189.

[5]張文，張琪瑋.毛細管氣相色譜法分析白酒中的甲醇和酯類[J].現代農業科技，2016（20）：256-259.

[6]劉一平，張孝文.升溫速率對汽油色譜分離結果的影響[J].中國高新技術企業，2013（10）：89-90.

[7]金陽.氣相色譜測定苯系物時儀器條件對測定結果的影響[J].化工安全與環境，2023，36（1）：58-61.

[8]樊美霞，汪毅，戴鵬，等.氣相色譜法測定微量乙酸乙酯含量方法研究[J].廣東化工，2024，51（8）：104-108.

[9]解永磊，秦松巖，王昕彤，等.氣相色譜測定揮發性脂肪酸的條件優化[J].廣東農業科學，2014，41（23）：98-101.

作者簡介：李洋（1986—），男，寧夏固原人，本科，主管檢驗師。研究方向：食品衛生檢驗檢測。

通信作者：張杰（1977—），男，湖北恩施人，本科，主任技師。研究方向：實驗室管理與衛生檢驗檢測。E-mail： 543715380@qq.com。