玫瑰發酵液的制備及其生物活性的探究

摘 要：本文利用植物乳植桿菌發酵制備不同發酵時間的玫瑰發酵液，并對其總多糖、總酚、超氧化物歧化酶、總酸、DPPH自由基清除率、羥自由基清除率以及酪氨酸酶活性抑制率等指標進行測定。結果表明，玫瑰發酵液的最佳發酵時間為30 h。在此條件下，發酵液的總多糖含量為0.319 mg·mL-1，總酚含量為73.153 μg·mL-1，超氧化物歧化酶酶活力為14.130 U·mL-1，總酸含量為0.012 6 g·kg-1。玫瑰發酵液的濃度為1%、5%、10%時，對DPPH自由基的清除率分別為80.769%、85.452%、85.618%；對羥自由基的清除率分別為82.818%、87.972%、91.924%；對酪氨酸酶的活性抑制率分別為78.800%、82.800%、107.200%。結果顯示，玫瑰發酵液具備較好的抗氧化能力和生物活性。

關鍵詞：玫瑰；發酵；植物乳植桿菌；生物活性

Study on the Preparation and Biological Activity of Rose Fermentation Liquid

YAO Jiawei1， LI Muyuan2， NIE Yutong3， YAO Aibing1， LI Jinxin2*

（1.Ningxia Jiahe Huayu Ecological Agriculture Co.， Ltd.， Shizuishan 753000， China; 2.Ningxia University， Yinchuan 750021， China; 3.Qufu Normal University， Jining 273100， China）

Abstract： In this paper， the fermentation liquid of rose with different fermentation time was prepared by the fermentation of Lactiplantibacillus plantarum， and its total polysaccharide， total phenol， superoxide dismutase， total acid， DPPH free radical scavenging rate， hydroxyl free radical scavenging rate and tyrosinase activity inhibition rate were measured. The results showed that the optimum fermentation time of rose fermentation liquid was 30 h. Under these conditions， the total polysaccharide， total phenol content， superoxide dismutase activity and total acid content were 0.319 mg·mL-1， 73.153 μg·mL-1， 14.130 U·mL-1 and 0.012 6 g·kg-1 respectively. When the concentration of rose fermentation liquid was 1%， 5% and 10%， the scavenging rates of DPPH free radicals were 80.769%， 85.452% and 85.618%， respectively. The scavenging rates of hydroxyl free radicals were 82.818%， 87.972% and 91.924%， respectively. The inhibition rates of tyrosinase activity were 78.800%， 82.800% and 107.200%， respectively. The results showed that rose fermentation liquid had better antioxidant capacity and biological activity.

Keywords： rose; fermentation; Lactiplantibacillus; bioactivity

玫瑰是一種具有重要經濟價值，集藥用、食用、綠化和美化等多種功能于一體的木本植物[1]。成熟的玫瑰花瓣中含有大量的芳香油、氨基酸、維生素、可溶性糖、酚類化合物及生物堿[2]，在食品工業中用途廣泛[3]。當前，通過生物發酵技術，可以生產加工玫瑰酒[4]、玫瑰醋[5]和玫瑰飲料[6]等。利用微生物進行發酵，可以將玫瑰花瓣中豐富的營養成分轉化為更易于吸收的形式，并且可能產生新的生物活性物質[7]。李濤濤[8]研究發現，益生菌發酵玫瑰花瓣能夠顯著提高沒食子酸、槲皮素、對香豆酸等單體酚的含量，并檢測到綠原酸。趙丹等[9]研究發現，經釀酒酵母發酵后的玫瑰發酵液具有清除DPPH自由基的能力，并能顯著抑制酪氨酸酶活性，為其在美白功效食品中的應用提供科學依據。國內的研究主要集中在利用不同的微生物進行玫瑰花瓣的發酵，如酵母菌、乳酸菌和霉菌等[10]。研究發現，不同的微生物可以對玫瑰發酵液的成分和風味產生顯著影響[11]。發酵過程能夠提高玫瑰中的多酚類化合物和抗氧化活性的生物利用度[12]。例如，一些研究表明，發酵可以促進玫瑰花青素的釋放，從而增強其抗氧化能力[13]。

本文通過植物乳植桿菌發酵制備不同發酵時間的玫瑰發酵液，并對其總多糖、總酚、超氧化物歧化酶、總酸、DPPH自由基清除率、羥基自由基清除率以及酪氨酸酶活性抑制率等指標進行測定，為其在食品中的應用提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

玫瑰花瓣、去離子水、植物乳植桿菌，善恩康生物科技（宿州）有限公司；DPPH（1，1-二苯基-2-苦基肼）（純度為98%）、甲醇（分析純）、乙醇（分析純）、鄰苯二酚、磷酸緩沖溶液、水楊酸、硫酸亞鐵、過氧化氫、酚酞指示劑、氫氧化鈉、DNS試劑、鹽酸溶液、葡萄糖、沒食子酸、福林酚試劑、碳酸鈣、總超氧化物歧化酶測試盒、熊果苷、維生素C和酪氨酸酶。

BSA224S分析天平；L6s紫外分光光度計；酶標儀；正壓過濾器；ST16R冷凍離心機；數顯恒溫水浴鍋；鼓風干燥箱；可調式電爐；50 mL滴定管，天玻A級；ZQWY-218N型恒溫振蕩培養箱；QL-902渦旋振蕩儀；ZDJ-4A自動電位滴定儀；E-201-C-65 pH復合電極；PB-10 pH計。

1.2 實驗方法

1.2.1 玫瑰發酵液的制備

取2.0%玫瑰干粉、3.0%葡萄糖與一定量去離子水于燒杯中混勻，置于121.0 ℃條件下，滅菌25 min。取出后冷卻至室溫，獲得發酵培養液。在無菌條件下，取30.0 mg植物乳植桿菌接種到發酵培養液中，在搖床（40.0 ℃）中進行振蕩培養，以獲得玫瑰發酵產物；然后將該產物在85.0 ℃下滅菌30 min，冷卻。將滅活后的玫瑰發酵液以10 000 r·min-1離心10 min，除去菌體，收集上清；再使用0.45 μm濾膜進一步除去殘留。將最終得到的上清液，置于80.0 ℃水浴鍋中滅菌20 min，冷卻。通過上述方法制作發酵時間分別為6、12、18、24、30 h和36 h的玫瑰發酵液。

1.2.2 玫瑰發酵液總多糖含量測定

發酵液總多糖待測樣的制備參照王鵬亭等[14]、曾志恒等[15]方法進行改良。用移液管精密吸取不同發酵時間的玫瑰發酵液6 mL，置于25 mL容量瓶中，加入6 mol·L-1的HCl溶液6 mL，封口，置于消解儀中，100.0 ℃加熱30 min，冷卻至室溫，加2～3滴酚酞指示劑，用6 mol·L-1 NaOH溶液滴定至溶液初顯淡紅色，加水定容至25 mL，搖勻，即得發酵液總多糖待測樣。

精密移取制備的待測樣5.0 mL于50 mL容量瓶中，并定容至刻度線。精密移取稀釋后的發酵液總多糖待測樣2.0 mL于25 mL容量瓶中，補水至5.0 mL，加入DNS試劑5.0 mL，混勻，沸水加熱5 min，冷卻至室溫，定容至25 mL，去離子水為空白，于540 nm處測定吸光度，計算不同發酵時間的發酵液中的總多糖含量。

1.2.3 玫瑰發酵液總酚含量測定

采用Folin-Ciocalteu法測定總酚含量。參照LANG等[16]的方法，分別取16 μL不同發酵時間的發酵液與50 μL福林酚試劑混合在96孔板中，在室溫下避光反應2 min，隨后加入50 μL 10%的碳酸鈣溶液，在25.0 ℃水浴中加熱1 h，最后測定其在765 nm處的吸光度。以沒食子酸作為標準品計算總酚含量。

1.2.4 玫瑰發酵液超氧化物歧化酶酶活力測定

在離心管內加入生理鹽水2 mL，分別緩慢加入玫瑰發酵液1 mL，共3 mL，置于渦旋振蕩儀上渦旋混勻。離心后取上清液，重復離心一次，上清液即為超氧化物歧化酶粗提液。

采用羥胺法測定超氧化物歧化酶活性，具體測定方法參照總超氧化物歧化酶測試盒說明書進行[17]。超氧化物歧化酶酶活力的計算公式為

（1）

式中：A0為對照管吸光度；A1為管吸光度；Dx為反應體系稀釋倍數；D0為樣品測試前稀釋倍數。

1.2.5 玫瑰發酵液總酸含量測定

為避免二氧化碳對總酸測定的干擾，將煮沸后的蒸餾水作為溶劑通過空白實驗消除CO2干擾[18]。分別取25 mL蒸餾水于150 mL錐形瓶中，加入2～3滴0.2%的酚酞指示劑，用0.01 mol·L-1 NaOH標準溶液進行滴定，觀察溶液由無色變為粉紅色，且30 s內不褪色，即為終點，記錄滴定體積。使用0.2%的酚酞為指示劑，用0.01 mol·mL-1 NaOH標準溶液滴定，觀察由黃色變為橙紅色，且30 s內不褪色，記錄滴定體積，從而計算玫瑰發酵液的總滴定酸度。

1.2.6 玫瑰發酵液抗氧化能力測定

采用DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼）評估玫瑰發酵液的抗氧化活性，參考LEKOUAGHET等[19]的方法。用移液槍準確取80 μL的玫瑰發酵液（30 h）于96孔板中，加入DPPH溶液，并用甲醇稀釋至200 μL，充分混合后在避光條件下反應30 min。最后在517 nm處測定吸光度，計算DPPH自由基清除率。DPPH自由基清除率的計算公式為

（2）

式中：A0為甲醇與DPPH溶液的吸光度；A1為玫瑰發酵液與DPPH溶液的吸光度；A2為玫瑰發酵液樣品與甲醇的吸光度。

羥基自由基清除實驗。利用水楊酸法，在510 nm測定玫瑰發酵液的羥基自由基清除能力。羥基自由基清除率的計算公式為

（3）

式中：A0為空白對照的吸光度；Ax為待測物質組的吸光度；Ax0為待測樣背景組的吸光度（OD510 nm）。

1.2.7 玫瑰發酵液酪氨酸酶活性抑制的測定

酪氨酸酶是生物體內合成黑色素的重要酶，抑制其活性可間接減少黑色素的合成，從而實現美白效果。實驗設置了樣品組和對照組（熊果苷）。使用pH=6.8的磷酸鹽緩沖液，配制成酶活力為60 U·mL-1的酪氨酸酶以及濃度為0.1 mg·mL-1的L-酪氨酸。反應體系在96孔板中的總容量為200 μL，包括L-酪氨酸40 μL、酪氨酸酶溶液40 μL、緩沖液和待測樣品溶液共120 μL。玫瑰發酵液終濃度為1%、5%、10%，對應加入玫瑰發酵液為2、10、20 μL，緩沖液為118、110、100 μL。總體系為200 μL，L-酪氨酸40 μL、酪氨酸酶溶液40 μL。將酶標儀檢測系統設置為溫度37 ℃，將待測的96孔板迅速放在酶標儀檢測系統，測定475 nm處的吸光度，每2 min檢測1次，持續40 min。

2 結果與分析

2.1 玫瑰發酵液的總多糖含量結果

試驗考察了不同發酵時間（6、12、18、24、30 h和36 h）的玫瑰發酵液的總多糖含量。如圖1所示，總多糖含量隨著發酵時間的延長呈現先上升后下降的趨勢，且當發酵時間為30 h時，玫瑰發酵液的總多糖含量最高，為0.319 mg·mL-1。

2.2 玫瑰發酵液的總酚含量結果分析

試驗考察了不同發酵時間（6、12、18、24、30 h和36 h）的玫瑰發酵液的總酚含量。由圖2可知，隨著發酵時間的延長，玫瑰發酵液的總酚含量呈現先增加后減少的趨勢。當發酵時間為30 h時，玫瑰發酵液的總酚含量最高，達到73.153 μg·mL-1。在發酵時間為36 h時，玫瑰發酵液的總酚含量相對降低，可能是因為植物乳植桿菌在生長代謝過程中為了維持自身生命活動，使得酚類物質轉化成其他代謝產物，導致總酚量下降。

2.3 玫瑰發酵液的總酸含量結果分析

試驗考察了不同發酵時間（6、12、18、24、30 h和36 h）的玫瑰發酵液的總酸含量。如圖3所示，在發酵時間為6～24 h時，玫瑰發酵液的總酸含量（以H＋計）基本處于平穩狀態，而在發酵時間為30 h時，玫瑰發酵液的總酸含量上升且達到最大值，為0.012 6 g·kg-1。

2.4 玫瑰發酵液的超氧化物歧化酶活性結果分析

試驗考察了不同發酵時間（6、12、18、24、30 h和36 h）的玫瑰發酵液的超氧化物歧化酶活性。如圖4所示，在發酵時間為30 h時，玫瑰發酵液的超氧化物歧化酶酶活力達到峰值，為14.130 U·mL-1。

綜上結果表明，發酵時間對玫瑰發酵液的影響是較為明顯的。30 h是最佳發酵時間，此階段總多糖、總酚、總酸含量以及SOD酶活力均達到最大值。因此，試驗選擇最佳發酵時間為30 h。

2.5 玫瑰發酵液的體外抗氧化能力結果分析

DPPH清除率、羥自由基清除率是評估抗氧化能力的重要指標。發酵30 h的玫瑰發酵液體外抗氧化能力檢測結果如圖5所示。玫瑰發酵液的濃度為1%、5%和10%時，對DPPH自由基的清除率分別為80.769%、85.452%和85.618%；對羥自由基的清除率分別為82.818%、87.972%和91.924%。0.5%的維生素C對DPPH自由基和羥基自由基的清除率分別為89.29%、86.44%。經對比發現，濃度為10%的玫瑰發酵液的抗氧化能力與濃度為0.5%的維生素C的抗氧化能力較一致，結果證明玫瑰發酵液具有良好的抗氧化功效。

2.6 玫瑰發酵液的酪氨酸酶活性抑制結果分析

黑色素的合成受到酪氨酸酶的影響。酪氨酸酶催化L-酪氨酸轉化為多巴，并進一步將多巴氧化為多巴醌，最終生成黑色素。如圖6所示，玫瑰發酵液濃度為1%、5%、10%時，對酪氨酸酶活性的抑制率分別為78.800%、82.800%、107.200%。0.5%的熊果苷對酪氨酸酶活性的抑制率為71.200%。經對比分析，玫瑰發酵液對酪氨酸酶的活性抑制率比濃度為0.5%的熊果苷略高，結果證明玫瑰發酵液具有一定的美白作用。

3 結論

通過植物乳植桿菌發酵玫瑰花瓣，制備不同發酵時間的玫瑰發酵液，并對其總多糖、總酚、超氧化物歧化酶、總酸、DPPH自由基清除率、羥自由基清除率以及酪氨酸酶活性抑制率進行分析。結果表明，玫瑰發酵液的最佳發酵時間為30 h。在此條件下，發酵液的總多糖含量為0.319 mg·mL-1，總酚含量為73.153 μg·mL-1，超氧化物歧化酶酶活力為14.130 U·mL-1，總酸含量為0.012 6 g·kg-1。玫瑰發酵液的濃度為1%、5%、10%時，對DPPH自由基的清除率分別為80.769%、85.452%、85.618%；對羥自由基的清除率分別為82.818%、87.972%、91.924%；對酪氨酸酶的活性抑制率分別為78.800%、82.800%、107.200%。結果顯示，玫瑰發酵液具備較好的抗氧化能力和生物活性。這為其在食品中的應用提供了科學依據，未來可以進一步探索其具體機制及應用效果。

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基金項目：2023年寧夏回族自治區科技廳縣域科技成果引進示范推廣項目“鮮花酵素工藝技術引進應用與示范”（2023CKI03064）。

作者簡介：姚嘉偉（1998—），男，寧夏石嘴山人，碩士，工程師。研究方向：園林植物與觀賞園藝。

通信作者：李錦馨（1963—），女，山東萊州人，碩士，教授。研究方向：花卉生理生態學和風景園林規劃與設計。E-mail： nxchq@163.com。