食品中黑果腺肋花楸提取物花色苷的測定

摘 要：建立超高效液相色譜法（Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC）測定黑果腺肋花楸果產品中花色苷含量。樣品經90%甲醇-2%鹽酸溶液超聲萃取，經0.22 μm微孔濾膜過濾后用超高效液相色譜儀-紫外檢測器分析。選用色譜柱UPLC BEH C18，流動相A：甲醇∶乙腈∶甲酸∶水體積比為2∶2∶1∶5，流動相B：10%甲酸水溶液；流速為0.4 mL·min-1；進樣體積為5 μL；柱溫為室溫；運行時間為10 min。矢車菊素-3-半乳糖苷和矢車菊素-3-阿拉伯糖苷在標準曲線濃度范圍內線性關系良好，回收率均大于90%。本方法簡單，檢測靈敏度高，穩定性好，適用于食品樣品中黑果腺肋花楸果中花色苷含量的檢測。

關鍵詞：超高效液相色譜法（UPLC）；矢車菊素-3-半乳糖苷；矢車菊素-3-阿拉伯糖苷

Determination of Anthocyanin Extract of Aronia melanocarpa in Food

WU Shaomin， LI Yuzhen， YANG Jing， CHEN Hanfeng

（Access （Guangzhou） Testing Technology Service Co.， Ltd.， Guangzhou 510730， China）

Abstract： To establish a method for the determination of anthocyanins in Aronia melanocarpa in food by ultra performance liquid chromatography （UPLC）. The sample was extracted by ultrasound with 90% methanol-2% hydrochloride acid solution. It was filtered through a 0.22 μm microporous filter membrane and analyzed using UPLC with UV detector. Select a chromatography column UPLC BEH C18， with a mobile phase A of methanol∶acetonitrile∶ormic acid∶water volume ratio of 2∶2∶1∶5， mobile phase B of 10% formic acid; the flow rate was 0.4 mL·min-1; the injection volume was 5 μL; the column temperature was room temperature; the running time was 10 minutes. The linear relationship of cyanidin-3-galactoside and cyanidin-3-arabinosside within the concentration range of the standard curve was good and recovery rates greater than 90%. This method is simple， with high sensitivity and good stability. It is suitable for the detection of anthocyanins content of Aronia melanocarpa in food samples.

Keywords： ultra performance liquid chromatography （UPLC）; cyanidin-3-galactoside; cyanidin-3-arabinosside

黑果腺肋花楸[Aronia melanocarpa （Michx.） Elliott]，別名野櫻莓，入藥部位為果實[1]，具有抗氧化、清除自由基、抗炎、抗腫瘤、抗病毒、降血糖以及抗輻射等作用[2-6]。黑果腺肋花楸于2018年9月被國家衛生健康委員會批準為新食品原料，每日使用量≤10 g·d-1（以鮮品計）。但目前并無統一、具體、規范、明確的質量控制標準，這對于黑果腺肋花楸產品的開發與推廣造成很大障礙。

所有漿果中，黑果腺肋花楸果中花色苷含量最高[7]。黑果腺肋花楸果中絕大部分的花色苷為矢車菊素的糖苷衍生物（占總花色苷9.0%～98.7%）。相關研究[8]得出主要的4種花色苷及占比為矢車菊素-3-半乳糖苷（68.68%）、矢車菊素-3-阿拉伯糖苷（25.62%）、矢車菊素-3-葡萄糖苷（5.28%）、矢車菊素-3-木糖苷（0.42%）。因此，本文選取占比高的矢車菊素-3-半乳糖苷和矢車菊素-3-阿拉伯糖苷作為目標物進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

含有黑果腺肋花楸果的粉末樣品A（市售），不含有黑果腺肋花楸果的粉末陰性樣品B（市售）。

甲醇（默克，色譜純）；乙腈（默克，色譜純）；甲酸（默克，色譜純）；鹽酸（分析純，廣州試劑廠）；矢車菊素-3-半乳糖苷標準品（上海詩丹德）；矢車菊素-3-阿拉伯糖苷標準品（上海詩丹德）。水為符合《分析實驗室用水規格和試驗方法》（GB/T 6682—2008）規定的一級水。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜儀配紫外檢測器，沃特世；UPLC BEH C18液相色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），沃特世公司；分析天平（感量0.1 mg），梅特勒-托利多公司；超聲波振蕩器（S180H），艾爾瑪公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準品溶液的配制

分別稱取矢車菊素-3-半乳糖苷14.59 mg（純度92.16%）和矢車菊素-3-阿拉伯糖苷12.38 mg（純度96.60%）至10 mL容量瓶，用90%甲醇-2%鹽酸溶解并定容，為標準儲備液。

準確移取矢車菊素-3-半乳糖苷標準儲備液1 mL和矢車菊素-3-阿拉伯糖苷標準儲備液1 mL至10 mL容量瓶中，用10%甲酸水定容并搖勻，制得中間儲備液。

準確移取中間儲備液0.1、0.2、0.4、0.8 mL和1.6 mL至10 mL容量瓶中用10%甲酸水定容搖勻。制備成矢車菊素-3-半乳糖苷濃度為1.344 6、2.689 2、5.378 4、10.756 8 μg·mL-1和21.513 6 μg·mL-1以及矢車菊素-3-阿拉伯糖苷濃度為1.196 0、2.392 0、4.784 0、9.568 0 μg·mL-1和19.136 0 μg·mL-1的系列標準溶液。

1.3.2 樣品前處理

準確稱取樣品5.0 g至離心管，加入30 mL 90%甲醇-2%鹽酸溶液，放入超聲波振蕩器中超聲提取30 min，放置室溫后用90%甲醇-2%鹽酸溶液定容至50 mL容量瓶；移取1 mL至10 mL容量瓶中，用10%甲酸水溶液搖勻定容，經0.22 μm微孔濾膜過濾至樣品瓶，供液相色譜測定。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：UPLC BEH C18液相色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相A：甲醇∶乙腈∶甲酸∶水體積比為2∶2∶1∶5；流動相B：10%甲酸水；流速：0.4 mL·min-1；進樣體積：5 μL；柱溫：室溫；運行時間：10 min。洗脫程序詳見表1。

2 結果與分析

2.1 提取液選擇

目前花色苷的提取試劑主要是甲醇、乙醇、水，由于花色苷分子中3，5，7-三羥基-2-苯基苯并吡喃的母核結構，其在酸性水溶液中以穩定的黃烊鹽陽離子存在，而在堿性條件下以結構不穩定的藍色醌式堿形式存在，因此常在提取試劑中加入鹽酸以提高花色苷的穩定性。提取后再稀釋至合適濃度上機。本研究考察不同濃度的提取液對矢車菊素-3-阿拉伯糖苷的提取效果，結果發現采用90%甲醇-2%鹽酸溶液提取最為理想（圖1）。同理，矢車菊素-3-半乳糖苷也是采用90%甲醇-2%鹽酸溶液提取最為理想。

2.2 色譜柱選擇

分別采用UPLC HSS SB C18（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）、UPLC HSS C18（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）和UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）3種色譜柱對同一標準溶液（9.568 0 μg·mL-1矢車菊素-3-阿拉伯糖苷和10.756 8 μg·mL-1矢車菊素-3-半乳糖苷混標溶液）和樣品A進行上機分析。

采用UPLC HSS SB C18和UPLC HSS C18對標準溶液進行分析的色譜圖如圖2（a）和圖2（b）所示，標準品色譜峰分離不開。采用UPLC BEH C18色譜柱對標準品和樣品A進行分析的色譜圖如圖2（c）和圖2（d）所示，標準品及樣品峰型較好，樣品峰與雜峰已徹底分離。故本方法采用UPLC BEH C18色譜柱作為分析柱。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系

選取1.344 6、2.689 2、5.378 4、10.756 8 μg·mL-1和21.513 6 μg·mL-1的矢車菊素-3-半乳糖苷以及1.196 0、2.392 0、4.784 0、9.568 0 μg·mL-1以及19.136 0 μg·mL-1矢車菊素-3-阿拉伯糖苷工作溶液按照優化好的最佳色譜條件進行測定，繪制標準曲線，進行線性回歸分析（圖3）。矢車菊素-3-半乳糖苷線性回歸方程為y=42 133x-1 078，相關系數R2=0.999 8。矢車菊素-3-阿拉伯苷線性回歸方程為y=43 442x-2 903.3，相關系數R2=0.999 9。

2.3.2 專屬性

檢查陰性樣品B溶液對結果是否存在干擾。如圖4所示，陰性樣品B在目標峰位置沒有出現明顯定量峰，不影響矢車菊素-3-半乳糖苷（保留時間約為3.46 min）和矢車菊素-3-阿拉伯糖苷（保留時間約為4.67 min）的定量。

2.3.3 溶液穩定性

將濃度為4.033 8 μg·mL-1的矢車菊素-3-半乳糖苷和2.392 0 μg·mL-1矢車菊素-3-阿拉伯糖苷對照品工作溶液和樣品溶液分別在放置一定時間后測定，考察目標組分峰面積的變化，結果如表2所示。

由表2可見，對照品和樣品A在12 h內峰面積變化較小，峰面積的相對偏差在2%以內，并無新的雜質峰出現，樣品A溶液在12 h內比較穩定。

2.3.4 檢出限及定量限

在信噪比為3時得到矢車菊素-3-半乳糖苷檢出限為7.5 μg·g-1，矢車菊素-3-阿拉伯糖苷檢出限為5.5 μg·g-1。當S/N＞10時，得到矢車菊素-3-半乳糖苷定量限25.0 μg·g-1，矢車菊素-3-阿拉伯糖苷定量限18.2 μg·g-1。

2.3.5 精密度

兩個分析員分別連續測定按規定濃度配制的6份樣品A，計算12個測定結果的相對標準偏差，結果如表3所示。由表3可知，矢車菊素-3-半乳糖苷和矢車菊素-3-阿拉伯糖苷的RSD分別為3.11%和3.43%，方法重復性好。

2.3.6 準確度

每個加標水平進行3次平行檢測，計算加標回收率（本底值為精密度測試中12個測定結果的平均值）。由表4可知，9個加標樣矢車菊素-3-半乳糖苷的回收率在103.80%～111.78%，矢車菊素-3-阿拉伯糖苷的回收率在101.01%～105.55%。

3 結論與討論

花色苷準確定量的前提是最大限度提取花色苷，目前花色苷的提取試劑主要是甲醇、乙醇、水，由于花色苷分子中3，5，7-三羥基-2-苯基苯并吡喃的母核結構，其在酸性水溶液中以穩定的黃烊鹽陽離子存在，而在堿性條件下以結構不穩定的藍色醌式堿形式存在，因此常在提取試劑中加入鹽酸以提高花色苷的穩定性。同時在洗脫溶劑中加入適量的甲酸來提供色譜系統較低的pH值，維持花色苷陽離子的穩定性，提高花色苷的色譜分離度，減少色譜峰拖尾現象。在反相色譜系統中，花色苷化合物的結構特征，如苷元種類、糖苷化和酰基化類型，決定了其化合物極性及色譜保留行為。目前文獻主要采用反相色譜法對花色苷進行色譜分離[9]。本文考察發現UPLC BEH C18對花色苷的保留最好，分離度高且峰形好；進一步調整流動相組成、梯度洗脫程序、流速以及色譜柱柱溫，最終確定流動相A：甲醇∶乙腈∶甲酸∶水體積比為2∶2∶1∶5，流動相B：10%甲酸水溶液，線性梯度洗脫，流速為0.4 mL·min-1，柱溫為室溫，在10 min內矢車菊素-3-半乳糖苷和矢車菊素-3-阿拉伯糖苷得到很好的色譜保留與分離。因此本方法也為行業內對含有黑果腺肋花楸提取物食品中花色苷的檢測提供參考。

參考文獻

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