高效液相色譜法測定濕米粉中米酵菌酸和毒黃素含量的不確定評定

摘 要：目的：高效液相色譜法測定濕米粉中米酵菌酸和毒黃素含量的不確定度。方法：通過建立數學模型，分析測定過程中的不確定度來源。結果：毒黃素的測定結果為（7.17±0.24） μg·mL-1，米酵菌酸的測定結果為（7.10±0.25） μg·mL-1。結論：該方法主要不確定來源為標準溶液配制過程和樣品定容體積，提示樣品檢測過程中需對這兩個方面進行嚴格控制，以提高檢測數據的準確性。

關鍵詞：毒黃素；米酵菌酸；高效液相色譜法；不確定度評定

Uncertainty Assessment of Bongkrecic Acid and Toxoflavin Content Determination in Wet Rice Noodles by High-Performance Liquid Chromatography

CHEN Jiacong， WEN Xiaoyu， LI Man

（Huizhou Institute for Food and Drug Control， Huizhou 516000， China）

Abstract： Objective： To determine the uncertainty of rice yeast acid and toxoflavin in wet rice flour by HPLC. Method： The source of uncertainty was analyzed by establishing mathematical model. Result： The results of toxoflavin and rice yeast were （7.17±0.24） μg·mL-1 and （7.10±0.25） μg·mL-1 respectively. Conclusion： The main source of uncertainty in this method are the standard solution preparation process and the constant volume of the sample， which suggests that these two aspects should be strictly controlled in the process of sample detection to improve the accuracy of detection data.

Keywords： toxoflavin; bongkrekic acid; high performance liquid chromatography; uncertainty evaluation

毒黃素（Toxoflavin，TF）和米酵菌酸（Bongkrekic Acid，BA）是由椰毒假單胞菌屬酵米面亞種在適宜溫度、濕度等條件下產生的兩種毒素。毒理學研究表明，BA對小鼠靜脈注射的LD50為1.14 mg·kg-1、MED50為0.056 2 mg·kg-1[1]，TF對小鼠靜脈注射的LD50為1.7 mg·kg-1，MED50為8.39 mg·kg-1[2-3]。其中，米酵菌酸耐熱，一般烹調方法不能將其去除，這也是由椰酵假單胞菌引起食物中毒導致病死率高的主要原因之一。為了提升毒黃素和米酵菌酸的發現率，本文采用《食品中毒黃素和米酵菌酸含量測定 高效液相色譜法》（T/HZBX 35—2021）[4]進行分析，然而，任何檢測方法的準確性和可靠性都受到多種因素的影響，包括人員操作、試劑質量、儀器精度以及環境條件等[5]。因此，對檢測方法進行全面的不確定度評定顯得尤為重要。本文依據《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059.1—2012）[6]及《化學分析中不確定度的評估指南》（CNAS—GL006：2019）[7]，對《食品中毒黃素和米酵菌酸含量測定-高效液相色譜法》[4]的檢測方法進行系統的不確定度評估，了解檢測結果的準確性和可靠性，進而提升實驗室的質量控制水平，并為食品安全監管部門提供科學依據，為保障公眾健康貢獻力量。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

毒黃素（CAS號：84-82-2，純度≥98%）、米酵菌酸（CAS號：11076-19-0，純度≥95%）、甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）和QuEChERS dSPE EMR-Lipid，廣州安捷倫科技有限公司；Polish Tube-NaCl/MgSO4，廣州安捷倫科技有限公司；dSPE Cleaneup Tubes（成分配比：300 mg MgSO4、100 mg PSA和100 mg C18；容量：15 mL），上海安譜實驗科技股份有限公司；Cleanert MAS-Q（成分配比：PSA 400 mg、C18 400 mg和MgSO4 1.2 g；容量：15 mL），天津博納艾杰爾科技有限公司；超純水。

1.2 主要儀器與設備

Agilent 1260高效液相色譜儀配DAD檢測器，美國安捷倫公司；梅特勒XS205電子天平；GT-2227QTS智能超聲波清洗儀，廣東固特超聲股份有限公司；Fotector Plus高通量全自動固相萃取儀，廈門?？萍瘓F股份有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準溶液配制

（1）米酵菌酸標準儲備液（0.1 mg·mL-1）。準確稱取米酵菌酸標準品10 mg，用甲醇溶解并轉移至100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度線，搖勻備用。

（2）毒黃素標準儲備液（0.1 mg·mL-1）。準確稱取毒黃素標準品10 mg，用甲醇溶解并轉移至100 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度線，搖勻備用。

（3）標準系列工作液。分別吸取0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mL和25.0 mL米酵菌酸和毒黃素標準儲備溶液，用甲醇稀釋并定容至100 mL容量瓶中，依次配制成濃度為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 μg·mL-1和25.0 μg·mL-1的標準系列工作液，臨用時配制。

1.3.2 樣品前處理方法

稱取粉碎/混勻的試樣2 g于50 mL塑料離心管中，加入80%甲醇10 mL，渦旋混合2 min，超聲處理10 min，然后以5 000 r·min-1的速率離心5 min。吸取上清液至預裝dSPE EMR-Lipid吸附劑的離心管中，渦旋混合2 min，再次以5 000 r·min-1的速率離心5 min。取上清液于氮吹管中，重復上述提取、凈化步驟，合并上清液。將合并后的上清液于40 ℃水浴中氮吹至體積小于1 mL，用甲醇定容至1 mL，經0.22 μm濾膜過濾后待測。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A：甲醇；流動相B：水（甲酸調節pH值至3.0）；流速：1 mL·min-1；檢測波長：258 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL，梯度洗脫程序見表1。

1.3.4 試樣溶液的測定

以標準工作液濃度為橫坐標，以高效液相色譜儀響應對應的峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。用高效液相色譜儀對試樣溶液進行測定，得到相應的峰面積，根據標準曲線計算試樣溶液中毒黃素和米酵菌酸的濃度。

2 結果與分析

2.1 數學模型及不確定度來源分析

2.1.1 數學模型

根據食品中毒黃素和米酵菌酸含量測定-高效液相色譜法，毒黃素和米酵菌酸含量的計算公式為

（1）

式中：X為試樣中被測物的含量，mg·kg-1；C為從標準曲線得到待測液中目標物的濃度，μg·mL-1；I為試樣溶液定容體積，mL；m為試樣質量，g；1 000為單位換算系數。

毒黃素和米酵菌酸含量測定過程中，引入測量重復性影響因素的修正因子N，故將式（1）改寫為式（2），即

（2）

式中：N為測量重復性影響因素的修正因子，N=1，輸入量C、I、m和N互不相關，且X的計算公式只有輸入量C、I、m的積和商形式，因而用簡化的方式計算相對合成標準不確定度[8]為

（3）

2.1.2 不確定來源分析

根據測定過程，高效液相色譜法測定食品中毒黃素和米酵菌酸含量過程中引入的各不確定度分量及其表示符號見表2[9]。

2.2 不確定度評定

2.2.1 樣品溶液配制引入的相對標準不確定度urel（C）

樣品溶液配制引入的相對標準不確定度urel（C）包括4個來源[10]。①標準溶液配制過程中標準品純度引入的相對標準不確定度urel（P）；②標準品稱量引入的相對標準不確定度urel（M）；③標準溶液配制過程引入的相對標準不確定度urel（V）；④校準曲線擬合引入的相對標準不確定度urel（A）。

（1）標準品純度引入的相對標準不確定度urel（P）。毒黃素和米酵菌酸證書上顯示含量分別為98.00%、95.00%，未明示其不確定度。本文以其真值在±0.05%區間內分布，按不確定度的B類評定方法[11]，矩形分布，則毒黃素標準品引入的相對標準不確定度為

米酵菌酸標準品引入的相對標準不確定度為

（2）標準品稱量引入的相對標準不確定度urel（M）。標準物質稱量采用十萬分之一天平，電子天平經檢定合格，由檢定證書可知稱量重復性誤差為0.03 mg，示值誤差0.01 mg；天平按B類不確定度評定方法，取矩形（均勻）分布，k=。

則重復性誤差引入的標準不確定度為

天平示值誤差引入的標準不確定度為

實驗中稱量采用減重法，包括去皮和放樣兩次操作，這兩次稱量是相互獨立的，所以標準品稱量引入的標準不確定度為

標準品質量MR=10 mg。則標準品稱量引入的相對標準不確定度為

（3）標準溶液配制過程引入的相對標準不確定度urel（V）。標準曲線配制過程中，使用100 mL容量瓶、1 mL移液器和2、5、10、25 mL A級單標移液管。其標準不確定度主要來源于容量瓶、移液器的校準和溫度影響。產品信息表明，容量瓶、移液器已在20 ℃校準，而實驗室的溫度一般在±5 ℃之間變化[12]，引起的不確定度可通過溫度范圍和體積膨脹系數進行計算，過程中主要考慮液體的體積膨脹。已知甲醇體積膨脹系數為1.2×10-3 ℃-1，服從矩形分布（k=）。則由溫度影響產生的允許誤差為（V×?T×1.2×10-3），容量瓶、移液器分別服從三角形分布（k=）、矩形分布（k=），根據其容量允差（a），參考《移液器檢定規程》（JJG 646—2006）[13]、《常用玻璃量器檢定規程》（JJG 196—2006）[14]要求，由標準溶液配制過程中引入的相對標準不確定度見表3。

則標準溶液配制過程引入的相對標準不確定度為

（4）校準曲線擬合引入的相對標準不確定度urel（A）。毒黃素和米酵菌酸的標準工作液包含6個質量濃度點，每個質量濃度點分別進樣2次，以色譜峰面積的平均值（表4）為縱坐標（Y），以工作液質量濃度（X）為橫坐標，線性回歸方程Y=AX+B，用最小二乘法擬合，數據結果見表5。標準工作溶液質量濃度為橫坐標擬合標準曲線方程Y=AX+B（A為斜率，B為截距）及相關系數（R2），根據貝塞爾公式[15-16]，按式（4）～式（6）計算校準曲線擬合引入的相對標準不確定度urel（A），結果如表5所示。

（4）

（5）

（6）

式中：SR為擬合工作曲線的標準差；A為擬合工作曲線的斜率；p為樣品平行測定的次數，p=3；n為目標物標準工作溶液測定的總次數，n=6×2=12；為樣品溶液中目標物質量濃度的平均值，μg·mL-1；為目標物標準工作溶液質量濃度的平均值，；Xi，std為標準工作溶液中某一目標物質量濃度的測定值，μg·mL-1；B為擬合工作曲線的截距；Yi，std為某一種目標物標準工作溶液各濃度點對應的峰面積。

綜上可知，毒黃素樣品溶液配制引入的相對合成標準不確定度為

米酵菌酸樣品溶液配制引入的相對合成標準不確定度為

2.2.2 樣品稱量引入的相對標準不確定度urel（m）

樣品質量通過兩次稱量（減量法）得到，其不確定度來源包括校準﹑重復性和分辨力，重復性歸入毒黃素和米酵菌酸含量的重復性測量中，因此只評定電子天平校準和分辨力引入的標準不確定度。天平稱量過程引入的測量不確定度分析參照標準品稱量不確定度的計算，其標準不確定度為

濕米粉平行樣平均稱量2.03 g，則稱量引入的相對標準不確定度為

2.2.3 樣品定容體積引入的相對標準不確定度urel（I）

樣品溶液定容使用1 mL A級容量瓶，允許誤差為±0.010 mL，服從三角形分布（k=），由此引入的標準不確定度為。由溫度變化引入的標準不確定度為

最終定容體積引入的相對標準不確定度為

2.2.4 重復性測量引入的相對標準不確定度urel（N）

同時稱取3份添加7 μg·mL-1毒黃素和米酵菌酸標物的濕米粉樣品進行處理，高效液相色譜儀獨立重復測定，根據公式（7）～（9），3份濕米粉樣品的重復測量結果見表6。

（7）

（8）

（9）

式中：Xi為樣品測定結果，μg·mL-1；為3份樣品測定結果平均值，μg·mL-1；n為樣品測定次數，n=3；為樣品測定結果標準差，μg·mL-1；為樣品重復性測定不確定度。

經計算，濕米粉樣品中毒黃素和米酵菌酸樣品的測定結果的標準差分別為1.762×10-2 μg·mL-1和3.606×10-3 μg·mL-1；樣品重復性測定引入的標準不確定度分別為1.017×10-2、2.082×10-3，則毒黃素重復性測量引入的相對標準不確定度urel（N1）為1.418×10-3；米酵菌酸重復性測量引入的相對標準不確定度urel（N2）為2.931×10-4。

2.3 相對合成標準不確定度ucrel（X）

濕米粉中毒黃素的相對合成標準不確定度為

濕米粉中米酵菌酸的相對合成標準不確定度為

毒黃素和米酵菌酸的各不確定度分量對合成不確定度的貢獻結果見表7。由表7可知，對于毒黃素和米酵菌酸，對合成不確定度貢獻排前4的分量分別為標準溶液配制過程、樣品定容體積、校準曲線擬合及重復性測量。其中，標準溶液配制過程和樣品定容體積的貢獻比例之和在85%以上，而其他5個分量的不確定度貢獻較小。

2.4 擴展不確定度與檢測結果表示

當置信概率P=95%（k=2），根據毒黃素和米酵菌酸含量測定的平均值分別為7.173 μg·mL-1和7.102 μg·mL-1；則毒黃素的擴展不確定度為

米酵菌酸的擴展不確定度為

則毒黃素的測量結果為（7.17±0.24） μg·mL-1，

k=2，P=95%；米酵菌酸的測量結果為

（7.10±0.25） μg·mL-1，k=2，P=95%。

3 結論

本文對高效液相色譜法測定濕米粉中米酵菌酸和毒黃素含量的不確定度進行了系統評定。結果表明，當毒黃素和米酵菌酸的含量分別為7.17 μg·mL-1和7.10 μg·mL-1時，其擴展不確定度分別為0.24 μg·mL-1、0.25 μg·mL-1（k=2）。該方法主要不確定度來源為標準溶液配制過程和樣品定容體積。因此，可以通過使用更高精度的量器配制標液、增加測定次數、規范操作等措施降低不確定度的引入，進而保證檢測數據的準確性與可靠性。

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作者簡介：陳嘉聰（1982—），男，廣東惠州人，本科，高級工程師。研究方向：食品檢測技術。