樟葉越橘內生真菌的生防潛力菌株篩選

摘要：為挖掘對常見農業病害菌彩絨革蓋菌（Coriolus versicolor）、密黏褶菌（Gloeophyllum trabeum）、腐皮鐮孢（Fusarium solani）等具有高拮抗作用的植物內生真菌資源，采用平板對峙法對樟葉越橘內生真菌進行篩選，通過菌落觀察、菌絲生長抑制率和菌絲生長動態數據進行分析，初步研究了拮抗菌株的抗逆特性及其對常見農業病害菌的防治效果。結果表明，1株穗狀彎孢（Curvularia spicifera）VDBF-28對尖孢鐮孢（Fusarium oxysporum）的抑制效果最好，抑菌率為69.02%；1株首都葉點霉（Phyllosticta capitalensis）VDBF-29對密黏褶菌、灰葡萄孢（Botrytis cinerea）、蕓苔鏈格孢（Alternaria brassicicola）的抑制效果最好，抑菌率分別為84.90%、70.39%、70.98%；1株腐皮鐮孢（F. solani）VDBF-34 表現出較強廣譜拮抗能力，其中對彩絨革蓋菌、禾谷鐮孢（F. graminearum）的抑制效果最好，抑菌率分別為79.02%、76.86%；1株扁孔腔菌屬（Lophiostoma sp.）VDBF-41表現出較強廣譜拮抗能力，其中對腐皮鐮孢的抑制效果最好，抑菌率為67.84%。供試12株樟葉越橘內生真菌中，有5種菌株對7株病原真菌均具有較強的拮抗活性。綜上所述，樟葉越橘內生真菌具有較高的生防潛力，可用于常見農業病害菌生防菌劑的開發。

關鍵詞：樟葉越橘；農業病害菌；生防潛力；內生真菌；抗真菌活性；生物防治

中圖分類號：S182""文獻標志碼：A

文章編號：1002-1302（2024）22-0140-07

人口的增長和極端天氣的頻繁發生使得人類面對的糧食危機愈發嚴重，植物病害導致的農業減產致使了食物危機的加重，而面對層出不窮的病害挑戰，人們選擇了采用化學農藥進行統一防治，解決了當下的病害問題卻帶來了更大的土地污染等問題，隨之而來的是食品安全問題。化學農藥的難降解和無差別攻擊使殘留在土壤里的農藥破壞了土壤微生物平衡，降低了土壤肥力，而農作物上的農藥殘留也危害人體健康^［1］。抗病品種的作物研發是防治植物病害的途徑之一，但因育種時間長，致病菌變異速度快而使作物抗病性消失^［2］。因此，當前社會需要應用新的植物病害防控方法，其中生物防治是符合社會發展需要的重要研究方向。

微生物菌劑的環境友好、低毒易降解等優點使其在作物病害防治方面具有廣闊應用前景，而生防菌的開發則尤其重要。目前，生防菌在植物病害防治方面已有顯著的應用成果。生防菌中與生防真菌相關的研究多集中于木霉菌（Trichoderma sp.）、盾殼霉（Coniothyrium sp.）、擬青霉（Paecilomyces sp.）、黏帚霉（Gliocladium sp.）和酵母菌（Saccharomyces sp.）等，而真菌生防制劑研究最多的是木霉菌^［3］。與生防菌有關的研究進展結合了當代農林環境友好型的防治要求，在促進增產增收、降低農殘、人類健康和社會發展等方面發揮了積極作用。

植物內生真菌是一類與植物共生的微生物，可在植物體內或周圍生長并對宿主植物無明顯致病性，且在生長過程中一定階段或全部階段生活在狀態良好的植物體內^［4-5］。植物內生真菌廣泛存在于宿主植物體內的各部位，且隨著宿主生境的變化，其種類和數量也會改變，并且會在一定程度上增強宿主植物的抗逆性及促進宿主植物生長發育^［6-7］。在植物內生真菌中有超過1/3數量的真菌表現出對植物病原真菌有較強的抑制活性^［8］，因此植物內生真菌也成為了生防菌的重要來源，其綠色環保的防治特點使其備受關注^［9］，已有大量國內外研究專注于其生防特點進行機制研究和產品開發^［10-11］。杜鵑花科（Ericaceae）越橘屬植物樟葉越橘（Vaccinium dunalianum）主要分布于云南、四川等地，其葉芽經干燥加工后在彝族民間作為傳統茶飲長期飲用至今^［12-14］。研究發現，樟葉越橘含有豐富的咖啡酰熊果苷類活性物質，具有良好的開發應用前景^［15-17］，該類物質在樟葉越橘中的高含量蓄積，推測除了其本身遺傳、生境因素外，還可能與其內生真菌和宿主之間的互作相關^［18-19］。

前期研究表明，樟葉越橘的不同部位中均含有種類豐富的內生真菌^［20-22］，樊苗苗等和嚴冬等發現，葉和嫩枝中的大多數內生真菌對三七絲核病菌（Verticillium cinnabarium）等病原真菌具有較強的抑制作用，且發現嫩枝內的活性菌株種類比葉內生活性真菌更為豐富^［23-24］。為進一步挖掘樟葉越橘中具有生防潛力的內生菌株，本研究以彩絨革蓋菌（Coriolus versicolor）等2種木腐菌和蕓苔鏈格孢（Alternaria brassicicola）等5種病原真菌為指示菌，采用平板對峙法測定從樟葉越橘分離鑒定出的12株內生真菌的拮抗活性，以期為樟葉越橘內生真菌資源進一步的開發利用提供參考并為常見植物病害的生物防治提供新的微生物資源。

1"材料與方法

1.1"試驗材料

1.1.1"供試內生真菌"供試內生真菌歸屬見表1，菌株于2016年從云南省武定縣樟葉越橘中分離，經形態鑒別及分子鑒定后由西南地區林業生物質資源高效利用國家林業和草原局重點實驗室（西南林業大學）提供保存。

1.1.2"供試指示菌"供試7種指示菌株為病原真菌，彩絨革蓋菌（Coriolus versicolor）和密黏褶菌（Gloeophyllum trabeum）2種木腐菌購自中國林業微生物保藏管理中心，腐皮鐮孢（Fusarium solani）、禾谷鐮孢（F. graminearum）、灰葡萄孢（Botrytis cinerea）、尖孢鐮孢（F. oxysporum）和蕓苔鏈格孢（Alternaria brassicicola）5種植物病原真菌購自中國科學院微生物研究所菌種保藏中心。

1.1.3"供試培養基"PSA培養基：200 g馬鈴薯，20 g 蔗糖，18 g瓊脂，1 L蒸餾水。

1.2"試驗方法

1.2.1"菌株培養"將供試菌株從保存冷凍管里用接種針挑取出并將其接種在含有20 mL PSA培養基、直徑為8.5 cm的培養皿正中間，28 ℃恒溫培養7 d。

1.2.2"拮抗活性測試"拮抗活性測試于2021年1—5月在西南林業大學西南地區林業生物質資源高效利用國家林業和草原局重點實驗室進行。采用五點對峙法進行供試樟葉越橘內真菌拮抗真菌篩選測試^［23-24］。培養皿直徑統一為8.5 cm，菌餅直徑統一為0.5 cm。在PSA培養基中心點接種病原菌菌餅，以病原菌菌餅為中心，并通過中心進行十字交叉后把內生真菌菌餅放到交叉線上，形成4個2.5 cm的間隙，每組設置3個重復，28 ℃黑暗恒溫培養，從培養3 d起每天測量菌落直徑和抑菌帶距離，對照組長滿時停止測量并進行抑菌率計算。

1.3"數據分析

通過使用WPS Office 2023和SPSS 21.0軟件開展對拮抗真菌的篩選測試數據的方差分析，當Plt;0.05時，說明差異具有顯著性。

2"結果與分析

2.1"供試12株內生真菌對2種木腐菌的拮抗活性篩選結果

研究發現，在拮抗活性測試中，當抑制率≥75%時，該內生真菌具有強拮抗能力，當50%≤抑制率lt;75%時，該菌具有較強拮抗能力，當抑制率lt;50%時，該菌則具有弱拮抗能力^［23-24］。由表2可知，對彩絨革蓋菌抑菌效果達標的活性菌株有9株，占內生真菌總數的75.00%；對密黏褶菌抑菌效果達標的活性菌株有11株，占內生真菌總數的91.67%，表明樟葉越橘內生真菌對供試2種木腐菌具有廣泛較強的拮抗作用。供試內生真菌中，Diaporthe heveae（VDBF-20）、Curvularia spicifera（VDBF-28）、Phyllosticta capitalensis（VDBF-29）、Fusarium solani（VDBF-34）、Lophiostoma sp.（VDBF-41）對彩絨革蓋菌和密黏褶菌的抑制率均gt;70%。

由圖1可知，VDBF-34有明顯的抗菌活性，它能在有限的培養空間內與病原菌產生空間或營養競爭，通過在短時間內充分利用培養基中的營養物質并與病原真菌產生空間或營養竟爭從而抑制真菌生長。拮抗活性測試中，對彩絨革蓋菌的拮抗能力最強的是VDBF-34，抑菌率為79.02%，其次是VDBF-41，抑菌率為74.71%。對密黏褶菌表現出最高抑制率的是VDBF-29，抑菌率為84.90%；其次是VDBF-34和VDBF-41，抑菌率均為83.53%。

由圖2-a可知，在與彩絨革蓋菌對峙過程中，大部分內生真菌對峙組在4～8 d內出現彩絨革蓋菌直徑生長拐點，達到直徑生長最大值，且真菌直徑在拐點出現后的5d內達到穩定。 VDBF-39對彩絨革蓋菌的促生長現象并不明顯。供試的大部分樟葉越橘內生真菌均可在培養中期表現出對彩絨革蓋菌的抑制作用，且抑制作用較強。

由圖2-b可知，在與密黏褶菌對峙過程中，大部分內生真菌在3～8 d中顯示出對密黏褶菌的生長促進效果，但會在促進效果出現后3～5 d內表現出對密黏褶菌的生長抑制作用。VDBF-39在對峙全程中表現出對密黏褶菌的生長促進作用。供試的大部分樟葉越橘內生真菌對密黏褶菌都具有較強抑制作用，且表現為先促進后抑制。

2.2"供試12株內生真菌對5種病原真菌的拮抗活性篩選結果

由表3可知，有6株菌株能夠有效抑制腐皮鐮孢，在供試內生真菌中占比高達50.00%。對灰葡萄孢有較強抑菌能力的菌株數達7株，菌數占比58.33%；對禾谷鐮孢有較強或強抑菌能力的菌株則達9株，占比高達75.00%。對尖孢鐮孢和蕓苔鏈格孢具有較強或強抑菌能力的菌株數量與禾谷鐮孢一致。在拮抗活性測試中，有5株內生真菌對5種病原真菌呈現廣泛較強抑制效果，其中，包括菌株Penicillium cairnsense（VDBF-26）、VDBF-29、VDBF-34、Aspergillus versicolor（VDBF-36）和VDBF-41。由圖3可知，VDBF-34和VDBF-41對禾谷鐮孢呈現強拮抗能力，抑制率分別為76.86%和76.08%。

在與灰葡萄孢拮抗作用結果中，Lachnum brevipilosum（VDBF-38）在與其對峙中呈現出抑菌圈。由圖3可知，VDBF-38培養5 d后，在其與灰葡萄孢對峙交界處出現明顯的抑制現象，接近VDBF-38的菌落前沿菌絲出現萎縮現象。

在與腐皮鐮孢對峙過程中，大部分內生真菌在3～5 d中出現對病原真菌的生長促進作用，在促進作用出現后1～2 d內轉為抑制作用并達到病原真菌直徑穩定狀態。VDBF-41對腐皮鐮孢的生長促進效果在3～5 d內不高，在培養5 d時腐皮鐮孢菌落直徑達到最大值，在5～7 d中腐皮鐮孢的菌落直徑逐漸變小并最終達到穩定。

由圖4可知，供試的大部分樟葉越橘內生真菌對腐皮鐮孢均具有較強抑制作用，表現為先促進后抑制。在與禾谷鐮孢對峙過程中，大部分內生真菌的表現與在彩絨革蓋菌中相似，而普遍出現真菌直徑拐點的時間范圍為5～8 d，供試的大部分樟葉越橘內生真菌對禾谷鐮孢均有較強抑制作用。在與灰葡萄孢對峙過程中，大部分的內生真菌在3～5 d中出現真菌生長促進作用，達真菌直徑生長拐點，并在5～6 d轉為生長抑制作用，達到病原真菌生長直徑穩定狀態，但VDBF-39對灰葡萄孢的生長影響并不明顯，供試的大部分樟葉越橘內生真菌對腐皮鐮孢均具有較強抑制作用，表現為先促進后抑制。在與尖孢鐮孢和蕓苔鏈格孢的對峙過程中，大部分的內生真菌在3～5 d中出現真菌直徑生長拐點，表現出拮抗作用，并在拐點出現后的3 d內達到病原真菌生長直徑穩定狀態。

3"討論與結論

腐皮鐮孢、尖孢鐮孢等常見農作物病害菌嚴重影響作物產量與質量，傳統的化學農藥法帶來的土地污染和研究的新抗病品種抗性降低等問題難以滿足綠色可持續的發展需要。為了滿足農作物產量質量和綠色、生態的發展要求，生物防治成為了農業領域的研究重點。具有生防活性的微生物是生物防治中的主角，大量研究表明利用生防菌進行生物防治是一種切實可行的方法。生防菌可通過幫助植物對抗非生物脅迫（如干旱、高溫、低溫等）和生物脅迫（如病原菌和蟲害）來增強植物的抗性^［25］，減輕植物的應激反應并緩解病害的影響^［26］。一些生防菌可分泌黏液使根系更好地吸收水分和養分，并通過與其他微生物協同作用，改善土壤結構、提高土壤保持水分和有機質含量^［27］。又或可分泌次生代謝產物，這些代謝產物具有顯著的抗菌和殺菌活性，可以幫助保護植物免受病原菌侵害^［28］。樟葉越橘內生真菌種類豐富，本試驗中對供試指示菌具有廣譜較強拮抗活性的5株內生真菌分別屬于青霉屬、葉點霉屬、鐮刀菌屬、曲霉屬和扁孔腔菌屬菌株，這些屬的菌株均有關于在生防菌應用方面的相關研究報道，如Ding等從喜樹（Camptotheca acuminata）中分離得到的青霉屬菌株對植物病原菌水稻紋枯病（Rhizoctonia solani）、藤倉赤霉（Gibberella fujikuroi）、稻瘟病菌（Pyricularia grisea）、小麥赤霉病（Gibberella zeae）、青椒枯萎病（Fusarium oxysporum f. sp. vasinfectum）的病原菌生長均有抑制作用^［29］。汪瀅等從黃精（Polygonatum sibiricum）青霉屬菌株中分離得到灰黃霉素等化合物，表現出廣譜抗真菌活性，對灰葡萄孢、炭疽病菌（Colletotrichum orbiculare）、蔓枯病菌（Didymella bryoniae）和核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）具有良好的抑菌效果^［30］。Tran等從柑橘（Citrus reticulata）中分離得到的首都葉點霉可有效防治柑橘黑斑病^［31］，杜衎等從北柴胡（Bupleurum chinense）中分離得到的腐皮鐮孢BCR-097對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、層生鐮刀菌（F. proliferatum）、尖孢鐮孢、腐皮鐮孢有良好的抑菌作用^［32］。從樟葉越橘分離得到的VDBF-34與北柴胡中分離得到的BCR-097呈現出同樣對尖孢鐮孢的高抑菌活性和對植物致病真菌的廣譜抗性。Mohamed等從雜色曲霉代謝產物中分離得到的二芳基醚對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）等顯示有較高的抑菌率^［33］，Mao等發現從羅漢果（Siraitia grosvenorii）中分離得到的扁孔腔菌屬真菌產生的3，4-二氫異香豆素衍生物具有良好的抑菌活性^［34］。針對供試廣譜活性內生真菌，系統開展其活性物質及其與宿主的互作關系等研究，將為進一步的生防菌劑開發應用提供參考。

值得注意的是，在抑菌試驗菌落直徑變化觀察中，部分內生真菌在前期未接觸病原菌菌絲時促進病原菌生長，但在后期對病原菌生長具有高度抑制效果，其原因可能是內生真菌來源的揮發性物質對病原真菌的生長有影響，但在生長后期隨著內生真菌生長速度加快及次生代謝物的產生，病原真菌生長得到抑制。對于生防菌的利用多集中于生防菌的非揮發性成分抑菌效果，卻很少關注真菌揮發性有機物的抑菌作用，對生防菌的揮發性成分與病原真菌生長關系的研究是較少的，這一點需要在生防菌開發和利用方面加以完善。

在抑菌試驗菌落直徑變化觀察的后期，部分病原真菌出現“反撲”現象，原本被抑制的病原菌隨著時間增長在原內生真菌菌落上長出自己的菌絲，這一點是需要關注的，因為真菌生長的試驗時間設計往往是參考病原真菌生長速率的，這意味著如果延長試驗設計時間可能會有病原真菌嚴重反撲的現象，而發現這種現象的可能在常見的試驗時長中是很難得見且加以重視的。因此，在抑菌試驗設計上，針對長勢極快的內生真菌或病原真菌，應該以更完善的觀察來研究真菌間的相互作用情況，以預防未來應用生防菌時出現“時間效應”的可能。

本研究從云南武定地區的樟葉越橘內分離得到的12株內生真菌中篩選出5株對7株供試指示菌均具有較強拮抗活性的菌株，分別為VDBF-26、VDBF-29、VDBF-34、VDBF-36和VDBF-41，以上具有廣泛拮抗作用的內生真菌具有開發成廣譜生物農藥的開發潛力。VDBF-28、VDBF-29、VDBF-34、VDBF-41因其專一高拮抗活性的特點，具有開發成有針對性的微生物制劑的潛力。

參考文獻：

［1］朱書生，黃惠川，劉屹湘，等. 農業生物多樣性防控作物病害的研究進展［J］. 植物保護學報，2022，49（1）：42-57.

［2］Miah G，Rafii M Y，Ismail M R，et al. Blast resistance in rice：a review of conventional breeding to molecular approaches［J］. Molecular Biology Reports，2013，40（3）：2369-2388.

［3］Alfiky A，Weisskopf L. Deciphering Trichoderma-plant-pathogen interactions for better development of biocontrol applications［J］. Journal of Fungi，2021，7（1）：61.

［4］Saikkonen K，Faeth S H，Helander M，et al. FUNGAL ENDOPHYTES：a continuum of interactions with host plants［J］. Annual Review of Ecology and Systematics，1998，29：319-343.

［5］Kusari S，Hertweck C，Spiteller M.Chemical ecology of endophytic fungi：origins of secondary metabolites［J］. Chemistry amp; Biology，2012，19（7）：792-798.

［6］Rana K L，Kour D，Kaur T，et al. Endophytic microbes：biodiversity，plant growth-promoting mechanisms and potential applications for agricultural sustainability［J］. Antonie van Leeuwenhoek，2020，113（8）：1075-1107.

［7］Aly A H，Debbab A，Proksch P. Fungal endophytes：unique plant inhabitants with great promises［J］. Applied Microbiology and Biotechnology，2011，90（6）：1829-1845.

［8］Kuldau G，Bacon C. Clavicipitaceous endophytes：their ability to enhance resistance of grasses to multiple stresses［J］. Biological Control，2008，46（1）：57-71.

［9］安雪菲，羅旭璐，唐軍榮，等. 樟葉越橘根優勢內生菌對宿主組培苗干旱脅迫生理的影響［J］. 西南林業大學學報（自然科學），2022，42（1）：108-114.

［10］Deshmukh S K，Gupta M K，Prakash V，et al. Endophytic fungi：a source of potential antifungal compounds［J］. Journal of Fungi，2018，4（3）：77.

［11］李雨欣，戴欣宇，曹雪梅，等. 生防菌在植物病害領域的研究進展［J］. 湖南生態科學學報，2023，10（2）：109-116.

［12］方瑞征. 中國越橘屬的研究［J］. 云南植物研究，1986，8（3）：239-258.

［13］侯寬昭. 中國種子植物科屬詞典［M］. 2版.北京：科學出版社，1982.

［14］楊"芳，邵金良，楊"斌，等. 雀嘴茶營養成分的分析及評價［J］. 現代食品科技，2011，27（12）：1516-1519.

［15］Zhao P，Tanaka T，Hirabayashi K，et al. Caffeoyl arbutin and related compounds from the buds of Vaccinium dunalianum［J］. Phytochemistry，2008，69（18）：3087-3094.

［16］Luo X L，Li N，Xu M，et al. HPLC simultaneous determination of arbutin，chlorogenic acid and 6′-O-caffeoylarbutin in different parts of Vaccinium dunalianum Wight［J］. Natural Product Research，2015，29（20）：1963-1965.

［17］Li N，Zeng W L，Luo X L，et al. A new arbutin derivative from the leaves of Vaccinium dunalianum Wight［J］. Natural Product Research，2018，32（1）：65-70.

［18］丁紹武，張"鵬，劉夢銘. 植物內生菌對植物生長的影響研究進展［J］. 現代農業科技，2020（11）：132-134.

［19］Khare E，Mishra J，Arora N K. Multifaceted interactions between endophytes and plant：developments and prospects［J］. Frontiers in Microbiology，2018，9：2732.

［20］Fan M，Chen X，Luo X，et al. Diversity of endophytic fungi from the leaves of Vaccinium dunalianum［J］. Letters in Applied Microbiology，2020，71（5）：479-489.

［21］羅旭璐.樟葉越橘原植物及其組織培養系的化學成分分析［D］. 昆明：西南林業大學，2015：114-115.

［22］曾為林. 樟葉越橘枝的內生菌及Penicillium crustosum次生代謝產物的分離鑒定［D］. 昆明：西南林業大學，2018：24-26.

［23］樊苗苗，陳肖學，張"訸，等. 樟葉越橘葉內生真菌的抑菌活性研究［J］. 西南林業大學學報（自然科學），2018，38（2）：141-147.

［24］嚴"冬，曾為林，陳肖學，等. 樟葉越橘嫩枝內生真菌的植物病原菌拮抗活性［J］. 中南林業科技大學學報，2021，41（3）：64-71.

［25］Khan A L，Hamayun M，Kang S M，et al. Endophytic fungal association via gibberellins and indole acetic acid can improve plant growth under abiotic stress：an example of Paecilomyces formosus LHL10［J］. BMC Microbiology，2012，12：3.

［26］Baltruschat H，Fodor J，Harrach B D，et al. Salt tolerance of barley induced by the root endophyte Piriformospora indica is associated with a strong increase in antioxidants［J］. The New Phytologist，2008，180（2）：501-510.

［27］Philippot L，Raaijmakers J M，Lemanceau P，et al. Going back to the roots：the microbial ecology of the rhizosphere［J］. Nature Reviews Microbiology，2013，11（11）：789-799.

［28］Kusari S，Zühlke S，Spiteller M. An endophytic fungus from Camptotheca acuminata that produces camptothecin and analogues［J］. Journal of Natural Products，2009，72（1）：2-7.

［29］Ding T，Jiang T，Zhou J，et al. Evaluation of antimicrobial activity of endophytic fungi from Camptotheca acuminata （Nyssaceae）［J］. Genetics and Molecular Research，2010，9（4）：2104-2112.

［30］汪"瀅，王國平，王麗薇，等. 一株多花黃精內生真菌的鑒別及其抗菌代謝產物［J］. 微生物學報，2010，50（8）：1036-1043.

［31］Tran N T，Miles A K，Dietzgen R G，et al. Phyllosticta capitalensis and P.paracapitalensis are endophytic fungi that show potential to inhibit pathogenic P.citricarpa on citrus［J］. Australasian Plant Pathology，2019，48（3）：281-296.

［32］杜"衎，高德民，孫"燕，等. 北柴胡內生真菌分離鑒定及其生防促生活性分析［J］. 山東農業科學，2023，55（6）：85-94.

［33］Mohamed G A，Ibrahim S R M，Asfour H Z.Antimicrobial metabolites from the endophytic fungus Aspergillus versicolor［J］. Phytochemistry Letters，2020，35：152-155.

［34］Mao Z L，Xue M Y，Gu G，et al. Lophiostomin A-D：new 3，4-dihydroisocoumarin derivatives from the endophytic fungus Lophiostoma sp.Sigrf10［J］. RSC Advances，2020，10（12）：6985-6991.