雞球蟲病7價多表位嵌合重組抗原ET seven真核質粒的構建、表達及其初步功能分析

摘 要： 為構建以雞柔嫩艾美耳球蟲EtAMA1、EtAMA2、EtMIC3、EtMIC4、EtMIC13、EtROP5和EtSAG1等入侵相關蛋白分子為抗原基礎的多表位嵌合重組抗原ET seven真核表達質粒，同時驗證其在DF-1細胞中的表達和通過不同輔助遞送方式在雞體內的表達及其免疫功能。本研究利用生信分析獲得7個抗原表位，分別提取柔嫩艾美耳球蟲不同發育階段蟲體總RNA，通過RT-PCR擴增獲得EtAMA1、EtAMA2、EtMIC3、EtMIC4、EtMIC13、EtROP5和EtSAG1等7個抗原的表位區域編碼基因，構建基因圖譜由公司合成以pcDNA3.1（+）為真核表達載體，構建真核表達質粒pcDNA3.1-ET seven；將鑒定陽性、測序正確的質粒pcDNA3.1-ET seven轉染至DF-1細胞，利用RT-PCR和Western blot方法檢測ET seven重組基因片段在DF-1細胞中的表達；以磷酸鈣納米顆粒作為輔助質粒遞送佐劑檢測pcDNA3.1-ET seven在雞體內引起的細胞因子水平變化，間接ELISA檢測特異性IgG抗體水平。結果顯示：成功構建真核表達質粒pcDNA3.1-ET seven，RT-PCR和Western blot檢測到ET seven的特異性表達，質粒通過磷酸鈣納米佐劑免疫雞體后，檢測細胞因子IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、IFN-γ、CD-40均在三次免疫后7 d高水平表達，其中CD-40與IL-6的表達水平最高。pcDNA3.1-ET seven重組質粒結合磷酸鈣佐劑肌肉注射二次免疫后7 d間接ELISA檢測特異性IgG抗體呈陽性。結果表明，pcDNA3.1-ET seven重組質粒構建成功，在雞體內有良好的免疫原性，為雞球蟲病的疫苗防控提供新的思路和技術支撐。

關鍵詞： 柔嫩艾美耳球蟲；多表位重組質粒；真核表達；DNA疫苗

中圖分類號：S855.9；S852.723

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）11-5159-14

收稿日期：2024-01-11

基金項目：“十四五”廣東省農業科技創新十大主攻方向“揭榜掛帥”項目（2023SDZG02）；廣東省基礎與應用基礎研究基金項目（2021B1515120006）；廣東省科技計劃項目（2021B1212050021；2023B1212060040）；豬禽種業全國重點實驗室開放課題（2023QZ-NK05；2022GZ07）；廣州市科技計劃項目（2023B04J0137；2023A04J0789）；云浮市科技計劃項目（2022020202）；科技創新戰略專項資金（高水平農科院建設）（202110TD；202122TD；R2020PY-JC001；R2019YJ-YB3010；R2020PY-JG013；R2020QD-048；R2021PY-QY007；R2023PY-JG018）；廣東省現代農業產業技術體系創新團隊建設專項（2022KJ119）；廣東省農業科學院協同創新中心項目（XTXM202202）

作者簡介：倪君麗（1998-），女，浙江平湖人，碩士生，主要從事雞球蟲病綜合防控技術研究，E-mail：1565452246@qq.com；劉欣超（1987-），女，吉林省白山人，副教授，主要從事動物寄生蟲病研究，E-mail：304368107@qq.com。倪君麗和劉欣超是同等貢獻作者

*通信作者：孫銘飛，主要從事寄生蟲入侵機制研究及靶向藥物研發，E-mail：smf7810@126.com；顧有方，主要從事動物寄生蟲病研究，E-mail：youfanggu@163.com

Construction， Expression and Preliminary Functional Analysis of the Eukaryotic Plasmid

ET Seven， a 7-valent Multiepitope Chimeric Recombinant Antigen of Chicken Coccidia

NI" Junli1，2， LIU" Xinchao1， SUN" Dong1，2， FANG" Siyun3， WANG" Dingai3， SHEN" Hanqin3， YAN" Zhuanqiang3， QI" Nanshan2， SUN" Mingfei2*， GU" Youfang1*

（1.College of Animal Science and Technology， Anhui Science and Technology University，

Fengyang 233100， China;

2.Key Laboratory of Livestock Disease Prevention of Guangdong

Province， Key Laboratory

of Avian Influenza and Other Major Poultry Diseases Prevention and

Control of Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Institute of Animal Health，

Guangdong Academy of Agricultural Sciences， Guangzhou 510640， China;

3.Wens Foodstuff Group Co. LTD， Xinxing 527400， China）

Abstract：" The aim of this study was to construct multi-epitope recombinant plasmids of Eimeria tenella EtAMA1， EtAMA2， EtMIC3， EtMIC4， EtMIC13， EtROP5， and EtSAG1 antigens and verify their expression in DF-1 cells and chickens through various assisted delivery methods， we employed pcDNA3.1（+） as the eukaryotic expression vector. The eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1-ET Seven was constructed through bioinformatics analysis， obtaining seven epitopes and reverse transcriptional amplification of gene fragments of seven antigen epitope regions in E. tenella mRNA templates at different time points. The company synthesized pcDNA3.1（+） as the eukaryotic expression vector， and constructed the eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1-ET seven. Subsequently， the constructed positive plasmid， pcDNA3.1-ET Seven， was transfected into DF-1 cells. RT-PCR and Western blot analysis was employed to detect the expression of the ET Seven recombinant gene in DF-1 cells. The cytokine levels of pcDNA3.1-ET seven in chickens were detected by calcium phosphate nanoparticles as adjuvant plasmid delivery adjuvant， and specific IgG antibody levels were detected by indirect ELISA. The eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1-ET Seven was successfully constructed， and the specific expression of ET Seven was detected through Western blot analysis and RT-PCR. After the plasmid was immunized with calcium phosphate nano-adjuvant， the detected cytokines IL-2， IL-6， IL-10， IL-12， IFN-γ and CD-40 were all expressed at high levels seven days after three times of immunization， and the expression levels of CD-40 and IL-6 were the highest. The pcDNA3.1-ET Seven recombinant plasmid， when conjugated with calcium phosphate adjuvant， was administered intramuscularly， resulting in a positive detection of specific IgG antibodies through indirect ELISA. The results showed that the pcDNA3.1-ET seven recombinant plasmid was successfully constructed and had good immunogenicity in chickens. This finding provides novel insights and technical support for vaccine prevention and control of chicken coccidiosis.

Key words： Eimeria tenella; multi-epitope recombinant plasmids; eukaryotic expression; DNA vaccine

*Corresponding authors：" SUN Mingfei， E-mail： smf7810@126.com; GU Youfang， E-mail： youfanggu@163.com

雞球蟲病在世界家禽養殖業中的危害一直是個亟待解決的嚴重問題，每年造成巨大的經濟損失，其中柔嫩艾美耳球蟲是危害最嚴重的蟲種之一［1］。藥物防治以及活卵囊疫苗防控是目前采取的常用手段，但由于長期使用藥物導致大量耐藥蟲株的出現，以及活卵囊疫苗存在散毒的風險，目前急需尋求高效、安全的新型疫苗［2］。多表位重組嵌合疫苗是利用基因重組等手段構建的靶向多個不同抗原表位的重組疫苗，是一種防治疾病的新興策略［3-5］。有效的多表位疫苗構建體在每個抗原肽序列中具有重疊的B細胞和T細胞表位，從而誘導針對目標抗原感染的細胞免疫或體液免疫反應，理論上具有更安全和更高效的免疫保護效果［3］。

篩選具有較好免疫原性的抗原是構建新型表位嵌合分子疫苗的關鍵。目前研究表明雞球蟲頂端復合體中微線體、棒狀體和致密顆粒在蟲體入侵宿主細胞過程中起重要作用［6］，在入侵雞體的三個階段中（滑行運動階段、形成運動結合體階段、納蟲空泡階段），由滑動體（moving junction，MJ）介導的滑行運動是建立蟲體與宿主入侵關系的關鍵［7］。蟲體與宿主細胞形成聯系依靠受體和配體的結合，驅動主動侵襲［8］，其中頂膜抗原1（apical membrane antigen 1，AMA1）與其受體棒狀體頸部蛋白2（rhoptry neck protein 2，RON2）形成復合物AMA1-RON2，在侵襲過程中分泌到宿主細胞中并整合到宿主細胞膜中［9］。研究表明，當用作重組蛋白疫苗時，子孢子特異性的EtAMA1可有效誘導部分保護，防止雞體受E. tenella同源攻擊［10］。頂膜抗原2（apical membrane antigen 2，AMA2）與其受體棒狀體頸部蛋白5（rhoptry neck protein 5，RON5）形成的復合體AMA2-RON5在子孢子入侵時期，有助于MJ的形成［11］。寄生蟲入侵宿主細胞的早期階段，微線體蛋白家族（microneme proteins，MICs）參與附著宿主細胞，隨后形成樞紐，輸送蟲體入侵所需能量［12］。其中關于MIC3（microneme protein 3，MIC3）的研究發現，抗EtMIC3的血清能夠阻斷子孢子的侵襲，表現出高度的位點特異性［13］，且更早就有研究發現以EtMIC3表達的DNA疫苗表現出對柔嫩艾美耳球蟲的抗感染能力［14］。MIC4（microneme protein 4，MIC4）可以通過EtMIC4 EGF樣激活EGFR通路，調控AKT和ERK信號通路中關鍵基因的表達，從而抑制細胞凋亡［15］。MIC13（microneme protein 13，MIC13）在弓形蟲中的研究表明，TgMIC13與胚胎細胞上報道的α2-9-連接的二唾液酸（sialic acid，Sia）序列的強烈結合，以及與腸道上皮中發現的4-O-乙酰化-Sia的相對強結合，而微粒黏附重復序列（microneme adhere repeat sequence，MAR）結構域可識別唾液酸，唾液酸是宿主細胞表面被該病原體入侵的關鍵決定因素，因此證明TgMIC13是侵襲過程中的一個重要參與者［16］。棒狀體基部蛋白5（rhoptry bulb protein 5，ROP5）可以通過阻斷活化巨噬細胞中IFN-γ介導清除，來控制毒力［17］。隨著宿主和病原體之間存在進化競爭的假說被提出，其佐證之一是宿主防御蛋白［稱為免疫相關GTP酶（IRG）］與原生動物寄生蟲弓形蟲表達的rhoptry假激酶家族（ROP5）之間的相互作用。研究發現ROP5使用高度多態的表面與IRG的核苷酸結合域相鄰結合，這在IRG結構中產生深刻的變構變化，表現出兩個顯著效果，分別是阻止IRG的寡聚化以及改變弓形蟲絲氨酸/蘇氨酸激酶ROP17和ROP18靶向的兩個蘇氨酸殘基的方向［18］。編碼表面抗原的基因的SAG家族可能是寄生蟲與宿主免疫系統的相互作用的關鍵［19］。SAG蛋白的一個核心功能可能是在寄生蟲入侵之前附著在宿主細胞上［20］。在剛地弓形蟲中，SAG基因在初級附著中起作用，研究已知E. tenella SAG1能夠結合哺乳動物細胞［21］。因此，以上七個抗原蛋白均能夠在蟲體入侵宿主的過程中起關鍵作用，是作為重組抗原疫苗的潛在靶標。

質粒遞送進體內一直存在較成熟的技術手段，包括基因槍、膠體金顆粒、以及in vivo-jet PEI脂質體和CpG ODN寡聚核苷酸等。但不同于蛋白的遞送佐劑，由于其適用范圍以及操作難度，未能探索出一種操作簡便且易制備的質粒遞送佐劑。本研究選用的磷酸鈣納米顆粒是相對比較成熟的DNA疫苗佐劑之一，已證明可以增強體液和細胞免疫反應，并且使用新的NP技術可以誘導CD8 T細胞免疫反應［22］，并具有多種優點，例如生物相容性，安全性，抗原能有效遞送至特定位置［23］。

本研究旨在構建ET seven真核表達質粒，同時驗證其在DF-1細胞中的表達以及通過磷酸鈣納米顆粒佐劑在雞體內引起的細胞因子水平與特異性IgG抗體水平的變化，為進一步開發和研制柔嫩艾美耳球蟲基因工程疫苗奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

pcDNA3.1（+）真核表達載體與DF-1細胞由廣東省農業科學院動物衛生研究所寄生生物研究室保存；DNA膠回收試劑盒、無內毒素質粒小提試劑盒購自天根生化科技；低內毒素質粒小提大量試劑盒購自美基生物公司；大腸桿菌TOP 10購自諾維贊生物公司；DMEM培養基、opti-MEM減血清培養基、脂質體轉染試劑lipofectamine 3000與TMB單組分顯色液均購自賽默飛世爾科技公司：His標簽鼠抗體、HRP標記羊抗鼠IgG抗體與HRP標記羊抗雞抗體均購自Proteintech公司；限制性內切酶Bsg Ⅰ與BamH Ⅰ購自New England Biolabs公司；引物合成由上海生工生物公司負責，其他化學試劑均購自上海生工生物公司。

1.2 方法

1.2.1 生信分析獲得抗原表位

利用免疫表位數據庫IEDB（https：//iedb.org/）的Kolaskar and Tongaonkar antigenicity方法［24］結合DNA star軟件，分析其與MHC結合能力、與MHC加工相關性、結合后免疫原性，篩選出7個抗原性高的抗原表位（表1）。

1.2.2 引物設計及合成

根據篩選出的抗原表位的基因序列，利用Primer premier 5.0設計各抗原表位基因的特異性引物（表2），引物由上海生工生物公司合成。

1.2.3 ET seven基因真核表達質粒的構建

將驗證存在于柔嫩艾美耳球蟲生活史的7個預測基因片段通過公司合成連接到pcDNA3.1（+）真核質粒載體，轉化于TOP 10感受態細胞，涂布于含有氨芐的LB平板，37 ℃培養過夜后挑取白色單菌落接種至含氨芐的LB液體培養基中過夜培養。同時采用無內毒素質粒小提試劑盒與低內毒素質粒小提大量試劑盒提取質粒，進行雙酶切鑒定（Bsg Ⅰ/BamH Ⅰ）與PCR鑒定后，將質粒送至上海生工生物有限公司進行序列測定。

1.2.4 ET seven基因真核表達質粒轉染DF-1細胞

將DF-1細胞接種于6孔細胞培養板中，用含10%胎牛血清的DMEM培養基培養細胞至匯合度約80%時，棄掉上清，PBS緩沖液清洗2～3次，換用opti-MEM減血清培養基使細胞適應2 h后，重新更換opti-MEM減血清培養基。按脂質體轉染試劑說明書，將重組質粒pcDNA3.1-ET seven和空質粒pcDNA3.1分別轉染DF-1細胞，空白組不作任何處理。37 ℃，5% CO2培養箱中培養6 h后更換新的含有5%胎牛血清的DMEM培養基繼續培養至48 h與60 h收取細胞RNA與蛋白樣品。

1.2.5 PCR方法檢測ET seven基因DF-1細胞中的轉錄

采用RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，使用promega公司的RQ1 Rnase-Free Dnase酶孵育提取的RNA，用以去除質粒DNA的干擾。參照Prime Script Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒進行cDNA合成。以cDNA為模板，進行PCR擴增。特異性引物為（5′→3′）F：GCAATGCCCTAATGCCGAAG/R：ACTGGGT-CGGATTATCGCTG。PCR反應體系為10 μL，Premix Taq 5 μL，模板1 μL，上、下游引物（10 mol·μL-1）各1 μL，ddH2O補至10 μL。94℃預變性3 min，94℃變性45 s，54℃退火1 min，72℃延伸1 min，30個循環；72℃延伸10 min。取5 μL PCR產物于含核酸染料（Gold View）的2%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。

1.2.6 Western blot檢測重組蛋白的表達

收集轉染60 h的DF-1細胞進行蛋白提取，將蛋白通過SDS-PAGE電泳分離后，80 V轉印90 min至NC膜，以His-tag（1∶2 000）為一抗4℃孵育12 h，羊抗鼠HRP-IgG（1∶3 000）為二抗室溫孵育1 h，采用ECL顯色。

1.2.7 磷酸鈣納米顆粒結合pcDNA3.1-ET seven的免疫反應

采用低內毒素質粒小提大量提試劑盒提取空載體質粒pcDNA3.1（+）與重組質粒pcDNA3.1-ET seven，并測定質粒濃度。磷酸鈣納米顆粒與殼聚糖的制備參考Qia［25］、Rabiee［26］、Sokolova［27］、Pedraza［28］等的方法，將15.6 mmol·L-1檸檬酸鈉、12.5 mmol·L-1磷酸氫鈉和12.5 mmol·L-1氯化鈣25度攪拌48 h，200 W超聲30 min，調整pH＞等電點，離心取沉淀，與稀釋過的質粒4℃輕晃結合。將10 mg殼聚糖粉末溶解于10 mL的0.1％乙酸中，4 ℃輕晃過夜，用注射器將三聚磷酸鹽滴入此混合物攪拌，將二者1∶1混合，振蕩器結合3 h。將1日齡無球蟲健康雛雞84只飼養至3日齡，隨機分成4組（表3），每組21只，分別在3日齡、10日齡、17日齡進行免疫。

在10日齡、17日齡、24日齡采集心臟血液及各組脾組織。脾組織通過組織細胞總RNA提取試劑盒提取RNA，參照Prime Script Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒進行cDNA合成。以cDNA為模板進行RT-PCR擴增檢測IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、IFN-γ、CD-40細胞因子的轉錄，以β-actin為內參，參考Gahan等［29］的方法，引物及退火溫度見表4。

心臟血樣以4 000 r·min-1離心3 min取血清，間接ELISA法檢測血清特異性IgG。取96孔ELISA板，每孔包被200 ng ET seven蛋白抗原，4 ℃放置12 h，PBST洗板3次；200 μL·孔-1加入1% BSA，37 ℃封閉1 h，PBST洗板3次；每孔加入100 μL 1∶1 000稀釋待測血清，37℃孵育60 min，PBST洗板3次；每孔加入100 μL 1∶2 000稀釋的山羊抗雞IgG-HRP，37℃孵育60 min，PBST洗板3次；每孔加入200 μL TMB單組分顯色液，37℃避光作用10 min，每孔加入50 μL 2 mol·L-1濃硫酸終止反應，用酶標檢測儀讀取OD450 nm值。計算P/N比值，大于或等于2.1判定為陽性，比值小于2.1為陰性。比較三次免疫后7 d針對ET seven蛋白的特異性IgG抗體水平變化。

2 結 果

2.1 抗原表位的生信分析

利用免疫表位數據庫IEDB（https：//iedb.org/）的Kolaskar and Tongaonkar antigenicity方法［24］，分析其與MHC結合能力、與MHC加工相關性、結合后免疫原性，篩選出七個抗原性高的抗原表位。篩選出AMA1、AMA2、MIC3、MIC4、MIC13、ROP5、SAG1的表位區域抗原指數分別為0.92、0.77、0.56、1.04、0.84、0.8、0.65，通過DNA star軟件分析七個片段連接后的親水性強弱，選擇構建可溶性性最高的MIC13-AMA2-MIC3-MIC4-ROP5-SAG1-AMA1的組合順序，由EAAAK小分子多肽連接，構建為ET seven，抗原指數為0.8，見圖1。

2.2 pcDNA3.1-ET seven真核表達載體構建

對柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊、子孢子以及裂殖子mRNA進行七個抗原基因片段的PCR擴增（圖2），其中AMA1基因片段大小約為250 bp；AMA2基因片段大小約為350 bp；MIC3基因片段大小為350 bp；MIC4基因片段大小約為300 bp；MIC13基因片段大小約為400 bp；ROP5基因片段大小約為500 bp；SAG1基因片段大小約為400 bp，證明預測片段在柔嫩艾美耳球蟲生活史中存在，重組質粒通用引物PCR鑒定（圖3）基因片段長度大小約為2 000 bp，符合預期，雙酶切（圖4）及測序鑒定正確，酶切位點為Bsg Ⅰ與BamH Ⅰ，Bsg Ⅰ位于目的片段內部，酶切長度理論值為1 075 bp，結果表明ET seven與pcDNA3.1載體連接正確，ET seven基因片段大小為1 731 bp。

2.3 pcDNA3.1-ET seven真核表達載體轉錄水平檢測

真核表達質粒pcDNA3.1-ET seven和pcDNA3.1轉染DF-1細胞48 h后，提取細胞總RNA，使用Promega公司的RQ1 Rnase-Free Dnase酶孵育，通過PCR特異性引物擴增，檢測目的基因ET seven的特異性表達。結果顯示Dnase酶孵育后RNA電泳顯示無特異性條帶，而Dnase酶孵育后RNA反轉錄成cDNA后，電泳可見特異性條帶，大小約為100 bp，符合預期，見圖5。

2.4 pcDNA3.1-ET seven真核表達載體蛋白水平檢測

重組質粒pcDNA3.1-ET seven轉染DF-1細胞60 h后，收集細胞裂解液后進行Western blot，結果顯示細胞轉染重組質粒在75 ku左右出現條帶，與預測結果大小一致，而空載體與未轉染的樣品孔未出現該條帶，見圖6。

2.5 磷酸鈣納米顆粒結合pcDNA3.1-ET seven重組質粒免疫反應變化

以磷酸鈣納米顆粒結合pcDNA3.1-ET seven重組質粒，采用腿部多點肌肉注射免疫接種，三次免疫7 d后采取每組心臟血樣檢測IgG水平變化，采取脾臟提取RNA，然后反轉錄為cDNA，RT-PCR檢測各組免疫后7 d IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、IFN-γ、CD-40的轉錄水平。

結果，磷酸鈣納米顆粒結合pcDNA3.1-ET seven重組質粒的試驗組在前兩次免疫后7 d均無明顯差異，但在第三次免疫后7 d，即24日齡時能夠引起對比空白組和對照組在IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、IFN-γ、CD-40細胞因子mRNA高水平的變化，檢測的細胞因子指標中CD-40的上調最為顯著，且與兩組對照組差異最顯著，IL-6次之，IL-10最低，除IL-12外，佐劑對照和空載體對照的細胞因子mRNA相對表達量均與空白組和免疫早期相比上調，見圖7。

磷酸鈣結合pcDNA3.1-ET seven質粒免疫后，IgG水平隨免疫次數顯著上升，與空白組對比差異極顯著（Plt;0.001），其中二次免疫后7 d，即17日齡時，檢測其特異性IgG抗體水平呈陽性，且三次免疫后，即24日齡呈現強陽性，其余各組除空載體組第三次免疫后7 d呈陽性外，均呈陰性，見圖8。

3 討 論

球蟲疫苗在全身和局部淋巴器官中誘導基于Th1細胞和細胞因子的反應，因此目前的球蟲疫苗除了活卵囊疫苗外，國內外學者均致力于研究一種能夠特異性針對球蟲感染，且可以引起有效長期保護的新型疫苗，其中重組DNA疫苗是較理想的發展方向，DNA疫苗可同時誘導體液與細胞免疫應答，產生持久性免疫應答，具有易生產，穩定性強，貯存、運輸方便等優點［30］。多表位的抗原可以針對性地產生球蟲生活史中不同時期抗原片段的抗體，同時可以構建保護腸道相關抗原結合的抗原表位，增強對球蟲的抵抗能力。Fatollahzadeh等［23］成功構建編碼GRA14和ROP13基因的重組DNA疫苗，能夠引起IL-17與IL-22顯著上調，同時誘導高水平的IgG反應，降低弓形蟲載蟲量。ET seven同時囊括了柔嫩艾美耳球蟲生活史的入侵階段的優勢抗原，其基因序列高度保守，具有更為優勢的免疫原性，能夠誘導特異性的細胞水平免疫應答反應。

本研究以pcDNA3.1（+）作為真核表達載體，成功將構建ET seven基因的真核表達質粒pcDNA3.1-ET seven通過脂質體轉染至DF-1細胞，采用PCR與Western blot試驗證實了pcDNA3.1-ET seven質粒能在DF-1細胞中瞬時表達。由于高劑量質粒的轉染難以規避質粒殘留的影響，干擾mRNA水平表達的檢測，因此使用Dnase酶對轉染后細胞樣本RNA進行孵育，以去除假陽性的影響。PCR結果顯示在約100 bp處有特異性條帶，且測序反饋比對后序列正確，Western blot結果也顯示重組質粒轉染細胞后在75 ku左右出現條帶，表明質粒轉染細胞后蛋白表達成功。磷酸鈣納米顆粒結合pcDNA3.1-ET seven免疫后細胞因子檢測結果顯示，IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、IFN-γ、CD-40均呈現上調趨勢。這與Paston等［31］認為的DNA疫苗在通過佐劑輔助質粒進入胞膜后，可以引起一定的免疫原性結論相符。IL-2為促炎因子，能夠促進B細胞增殖，活化T細胞與NK細胞，同時還可以促進IFN-γ的分泌［32］。IL-6通過刺激急性期反應、造血和免疫反應來促進宿主防御［33］，在腸道中IL-6水平升高有助于增強發炎部位固有層中T細胞的存活率和細胞凋亡抵抗力，CD4+ T細胞的這種擴增導致炎癥的持續存在。IL-6還通過刺激腸上皮細胞（intestinal epithelial cells，IEC）的增殖和擴增來引發重要的穩態功能［34］。本試驗在加強免疫后能夠引起高水平的IL-2與IL-6分泌，細胞免疫已經開始啟動，樹突狀細胞（dendritic cell，DC）細胞也被激活，IL-2作為調節免疫功能的幾種淋巴細胞的信使之一，誘導抗原刺激T細胞的增殖。其中IL-6的分泌量最高，認為本試驗選用的7個抗原進入雞體后轉錄翻譯的蛋白是針對腸道球蟲入侵，因此與腸道免疫更為相關的IL-6指標的上升符合預期，且能說明針對性的腸道細胞免疫較為強烈。細胞因子IL-10是一種關鍵的抗炎介質，可保護宿主免受對病原體和微生物群的過度旺盛反應，同時在其他環境中發揮重要作用。IL-10與其受體的結合會激活主要的JAK1-TYK2-STAT3信號級聯反應，最終誘導STAT3介導的抗炎反應［35］。試驗由于產生的高水平的IL-6對于雞體來說炎癥反應較強烈，IL-10在應對高水平的炎癥反應時，開始與受體結合誘導STAT3介導抑炎反應來平衡內環境的穩態。除IL-10外，IL-6是另一個最顯著激活STAT3的細胞因子，在相同的細胞類型中，促炎細胞因子和抗炎細胞因子也可能通過相同的分子發出信號，盡管誘導的反應截然不同，并導致不同的基因激活程序［36］。當DC被IL-6刺激時，STAT3是促炎的，但當被IL-10刺激時，STAT3是抗炎的［37］。其他促炎因子，尤其是IL-6，對于DC的競爭刺激是導致IL-10的上調的原因之一。IL-12由轉化的B細胞產生，可刺激NK細胞的細胞毒性和IFN-γ的產生，對T細胞有促進有絲分裂作用，在腸道穩態和炎癥中起關鍵作用，與腸道炎癥的發病機制有關［38］。也可以通過促進IL-10和抑制性受體表達以及特化Treg細胞群的出現來支持一系列抗炎機制［39］。因此，試驗結果顯示IL-12與IL-10的同時上調符合IL-12對IL-10的調節。IFN-γ是Th1主導的自身免疫過程的特征細胞因子，相關研究表明在炎癥和自身免疫性疾病期間，IFN-γ的內源性產生應被視為具有雙向免疫調節后果的過程，通常會導致病理學的緩和［40］。IFN-γ還可能刺激APC分泌更多的IL-12，從而觸發IFN-γ產生周期的重新激活，被稱為IFN-γ合成的正反饋回路，在腫瘤和炎癥環境中均存在這種變化［41］。IL-12的分泌量較IL-10與IFN-γ更高，位于這二者分泌的上游，側面印證其在二者之間的調節作用。此外DC中的IFN-γ信號轉導可以促進共刺激分子（如CD40、CD54、CD80、CD86和CCR7）的高表達［42］。CD40是腫瘤壞死因子受體（TNFR）超家族的共刺激成員，與其配體結合可激活TRAF6來激活相關信號通路，導致DC的存活及成熟［43］。同時也可以間接激活NK細胞，主要是通過抗原遞呈細胞（antigen presenting cell，APC）分泌IL-12［44］。CD40在試驗中分泌量最高，提示炎癥反應的整體水平較高，同時CD40促進IL-12進一步上調抑炎因子IL-10。磷酸鈣納米顆粒中的殼聚糖常被用作免疫增強劑廣泛使用［26］。殼聚糖納米顆?？梢耘cDNA結合并保護其免受核酸酶降解［45］，透過生物屏障。研究表明殼聚糖作為DNA的載體，能夠增強體液和細胞免疫反應［46］，可以激活巨噬細胞，增加細胞因子的產生，并增強細胞毒性CTL反應［47］，可以通過誘導IFN的產生來刺激DC成熟，增強抗原特異性T輔助性T（Th-1）反應［48］，因此可以解釋佐劑對照以及質粒對照在試驗中的有關細胞因子水平的上調。綜上，ET seven可以引起高水平的細胞免疫，同時雞體協調激活相關通路介導雙向免疫調節維持內環境穩態，但單次免疫及兩次免疫難以引起高水平的細胞免疫應答，三次加強免疫效果顯著增強，不排除免疫程序也可能對DNA疫苗的免疫有局限性，考慮合適的免疫日齡可能會改變細胞免疫應答起效的時間。在磷酸鈣納米顆粒包被pcDNA3.1-ET seven免疫血清反應原性的試驗中，間接ELISA檢測到特異性IgG在二次免疫后呈現陽性，且隨免疫次數增加形成強陽性，證明質粒pcDNA3.1-ET seven可誘導有效的體液免疫水平，免疫雞體后具有良好的免疫原性與反應原性，這與Smith等［49］在新冠DNA疫苗的研發中，在小鼠體內的免疫結果一致，一次免疫的體液免疫水平不足以達到陽性，但在二次免疫后7 d呈現陽性且免疫滴度持續升高，綜合細胞免疫及體液免疫水平，加強免疫的策略明顯優于單次免疫，這與Song等［50］和Ding等［51］的結論相同，也為DNA球蟲疫苗的使用，提供了防控新思路。

在后續的研究中，需要探索ET seven DNA疫苗與蛋白疫苗的聯合免疫，結合prime-boost免疫策略，以研究細胞免疫結合體液免疫在特定免疫程序下對柔嫩艾美耳球蟲入侵雞體的免疫保護效果評價，以期為球蟲新型疫苗的研究及應用提供新思路。

4 結 論

本研究成功構建雞球蟲7價多表位嵌合重組抗原ET seven真核質粒，在體外DF-1細胞轉染有表達，結合磷酸鈣納米顆粒佐劑免疫雞體有較好免疫反應，均能引起細胞免疫和體液免疫應答。ET seven具有良好的免疫原性，能夠為雞球蟲基因工程疫苗的研發提供新思路。

參考文獻（References）：

［1］ SIBLEY L D. Intracellular parasite invasion strategies［J］. Science， 2004， 304（5668）：248-253.

［2］ BLAKE D P， KNOX J， DEHAECK B， et al. Re-calculating the cost of coccidiosis in chickens［J］. Vet Res， 2020， 51（1）：115.

［3］ ZHANG L F. Multi-epitope vaccines：a promising strategy against tumors and viral infections［J］. Cell Mol Immunol， 2018， 15（2）：182-184.

［4］ BIBI S， ULLAH I， ZHU B D， et al. In silico analysis of epitope-based vaccine candidate against tuberculosis using reverse vaccinology［J］. Sci Rep， 2021， 11（1）：1249.

［5］ FADAKA A O， SIBUYI N R S， MARTIN D R， et al. Immunoinformatics design of a novel epitope-based vaccine candidate against dengue virus［J］. Sci Rep， 2021， 11（1）：19707.

［6］ TAHIR M J. Isolation and characterization of dense granules of Eimeria tenella sporozoites［D］. Guelph： The University of Guelph.， 1998.

［7］ TONKIN M L， ROQUES M， LAMARQUE M H， et al. Host cell invasion by Apicomplexan parasites：insights from the co-structure of AMA1 with a RON2 peptide［J］. Science， 2011， 333（6041）：463-467.

［8］ VULLIEZ-LE NORMAND B， TONKIN M L， LAMARQUE M H， et al. Structural and functional insights into the malaria parasite moving junction complex［J］. PLoS Pathog， 2012， 8（6）：e1002755.

［9］ BESTEIRO S， MICHELIN A， PONCET J， et al. Export of a Toxoplasma gondii rhoptry neck protein complex at the host cell membrane to form the moving junction during invasion［J］. PLoS Pathog， 2009， 5（2）：e1000309.

［10］ PASTOR-FERNNDEZ I， KIM S， BILLINGTON K， et al. Development of cross-protective Eimeria-vectored vaccines based on apical membrane antigens［J］. Int J Parasitol， 2018， 48（7）：505-518.

［11］ OLAJIDE J S， QU Z G， YANG S L， et al. Eimeria proteins：order amidst disorder［J］. Parasit Vectors， 2022， 15（1）：38.

［12］ TOMLEY F M， SOLDATI D S. Mix and match modules：structure and function of microneme proteins in Apicomplexan parasites［J］. Trends Parasitol， 2001， 17（2）：81-88.

［13］ LI W Y， WANG M Y， CHEN Y F， et al. EtMIC3 and its receptors BAG1 and ENDOUL are essential for site-specific invasion of Eimeria tenella in chickens［J］. Vet Res， 2020， 51（1）：90.

［14］ WANG X Q， WU L L， GAO Y， et al. Evaluation of the protective effect of pVAX-EtMIC3-recombined plasmid against E." tenella in chicken［J］. Parasitol Res， 2017， 116（3）：1023-1028.

［15］ ZHANG X S， ZHAO Y J， ZHANG Y， et al. Role of EtMIC4 EGF-like in regulating the apoptosis of Eimeria tenella host cells via the EGFR pathway［J］. Poult Sci， 2022， 101（10）：102075.

［16］ FRIEDRICH N， SANTOS J M， LIU Y， et al. Members of a novel protein family containing microneme adhesive repeat domains act as sialic acid-binding lectins during host cell invasion by Apicomplexan parasites［J］. J Biol Chem， 2010， 285（3）：2064-2076.

［17］ BEHNKE M S， FENTRESS S J， MASHAYEKHI M， et al. The polymorphic pseudokinase ROP5 controls virulence in Toxoplasma gondii by regulating the active kinase ROP18［J］. PLoS Pathog， 2012， 8（11）：e1002992.

［18］ REESE M L， SHAH N， BOOTHROYD J C. The Toxoplasma pseudokinase ROP5 is an allosteric inhibitor of the immunity-related GTPases［J］. J Biol Chem， 2014， 289（40）：27849-27858.

［19］ CHOW Y P， WAN K L， BLAKE D P， et al. Immunogenic Eimeria tenella glycosylphosphatidylinositol-anchored surface antigens （SAGs） induce inflammatory responses in avian macrophages［J］. PLoS One， 2011， 6（9）：e25233.

［20］ REID A J， BLAKE D P， ANSARI H R， et al. Genomic analysis of the causative agents of coccidiosis in domestic chickens［J］. Genome Res， 2014， 24（10）：1676-1685.

［21］ JAHN D， MATROS A， BAKULINA A Y， et al. Model structure of the immunodominant surface antigen of Eimeria tenella identified as a target for sporozoite-neutralizing monoclonal antibody［J］. Parasitol Res， 2009， 105（3）：655-668.

［22］ LIN Y H， WANG X， HUANG X F， et al. Calcium phosphate nanoparticles as a new generation vaccine adjuvant［J］. Expert Rev Vaccines， 2017， 16（9）：895-906.

［23］ FATOLLAHZADEH M， ESKANDARIAN A， DARANI H Y， et al. Evaluation of Th17 immune responses of recombinant DNA vaccine encoding GRA14 and ROP13 genes against Toxoplasma gondii in BALB/c mice［J］. Infect Genet Evol， 2021， 96：105150.

［24］ MOREIRA R S， FILHO V B， CALOMENO N A， et al. EpiBuilder：a tool for assembling， searching， and classifying B-Cell epitopes［J］. Bioinform Biol Insights， 2022， 16：11779322221095221.

［25］ QIU C， WU Y Y， GUO Q Y， et al. Preparation and application of calcium phosphate nanocarriers in drug delivery［J］. Mater Today Bio， 2022， 17：100501.

［26］ RABIEE N， BAGHERZADEH M， GHADIRI A M， et al. Calcium-based nanomaterials and their interrelation with chitosan：optimization for pCRISPR delivery［J］. J Nanostruct Chem， 2022， 12（5）：919-932.

［27］ SOKOLOVA V V， RADTKE I， HEUMANN R， et al. Effective transfection of cells with multi-shell calcium phosphate-DNA nanoparticles［J］. Biomaterials， 2006， 27（16）：3147-3153.

［28］ PEDRAZA C E， BASSETT D C， MCKEE M D， et al. The importance of particle size and DNA condensation salt for calcium phosphate nanoparticle transfection［J］. Biomaterials， 2008， 29（23）：3384-3392.

［29］ GAGHAN C， ADAMS D， MOHAMMED J， et al. Characterization of vaccine-induced immune responses against coccidiosis in broiler chickens［J］. Vaccine， 2022， 40（28）：3893-3902.

［30］ 黃詩雯， 宋 碩， 王致萍， 等. 人乳頭瘤病毒治療性疫苗的研究進展［J］. 病毒學報， 2020， 36（2）：314-321.

HUANG S W， SONG S， WANG Z P， et al. Research progress in human papillomavirus therapeutic vaccines［J］. Chinese Journal of Virology， 2020， 36（2）：314-321. （in Chinese）

［31］ PASTON S J， BRENTVILLE V A， SYMONDS P， et al. Cancer vaccines， adjuvants， and delivery systems［J］. Front Immunol， 2021， 12：627932.

［32］ MITRA S， LEONARD W J. Biology of IL-2 and its therapeutic modulation：mechanisms and strategies［J］. J Leukoc Biol， 2018， 103（4）：643-655.

［33］ TANAKA T， NARAZAKI M， KISHIMOTO T. IL-6 in inflammation， immunity， and disease［J］. Cold Spring Harb Perspect Biol， 2014， 6（10）：a016295.

［34］ KAUR S， BANSAL Y， KUMAR R， et al. A panoramic review of IL-6：structure， pathophysiological roles and inhibitors［J］. Bioorg Med Chem， 2020， 28（5）：115327.

［35］ SARAIVA M， VIEIRA P， O’GARRA A. Biology and therapeutic potential of interleukin-10［J］. J Exp Med， 2020， 217（1）：e20190418.

［36］ HUTCHINS A P， DIEZ D， MIRANDA-SAAVEDRA D. The IL-10/STAT3-mediated anti-inflammatory response：recent developments and future challenges［J］. Brief Funct Genomics， 2013， 12（6）：489-498.

［37］ BRAUN D A， FRIBOURG M， SEALFON S C. Cytokine response is determined by duration of receptor and signal transducers and activators of transcription 3 （STAT3） activation［J］. J Biol Chem， 2013， 288（5）：2986-2993.

［38］ VERSTOCKT B， SALAS A， SANDS B E， et al. IL-12 and IL-23 pathway inhibition in inflammatory bowel disease［J］. Nat Rev Gastroenterol Hepatol， 2023， 20（7）：433-446.

［39］ TAIT WOJNO E D， HUNTER C A， STUMHOFER J S. The immunobiology of the interleukin-12 family：room for discovery［J］. Immunity， 2019， 50（4）：851-870.

［40］ KELCHTERMANS H， BILLIAU A， MATTHYS P. How interferon-γ keeps autoimmune diseases in check［J］. Trends Immunol， 2008， 29（10）：479-486.

［41］ GARRIS C S， ARLAUCKAS S P， KOHLER R H， et al. Successful anti-PD-1 cancer immunotherapy requires T cell-dendritic cell crosstalk involving the cytokines IFN-γ and IL-12［J］. Immunity， 2018， 49（6）：1148-1161. e7.

［42］ PAN J P， ZHANG M H， WANG J L， et al. Interferon-gamma is an autocrine mediator for dendritic cell maturation［J］. Immunol Lett， 2004， 94（1-2）：141-151.

［43］ CROFT M， BENEDICT C A， WARE C F. Clinical targeting of the TNF and TNFR superfamilies［J］. Nat Rev Drug Discov， 2013， 12（2）：147-168.

［44］ SHIMIZU K， ASAKURA M， FUJII S I. Prolonged antitumor NK cell reactivity elicited by CXCL10-expressing dendritic cells licensed by CD40L+ CD4+ memory T cells［J］. J Immunol，， 2011， 186（10）：5927-5937.

［45］ ABELEV B， ADAM J， ADAMOV D， et al. Exclusive J/ψ photoproduction off protons in ultraperipheral p-Pb collisions at SNN=5. 02 TeV［J］. Phys Rev Lett， 2014， 113（23）：232504.

［46］ XING L， FAN Y T， ZHOU T J， et al. Chemical modification of chitosan for efficient vaccine delivery［J］. Molecules，， 2018， 23（2）：229.

［47］ SEFERIAN P G， MARTINEZ M L. Immune stimulating activity of two new chitosan containing adjuvant formulations［J］. Vaccine， 2000， 19（6）：661-668.

［48］ CARROLL E C， JIN L， MORI A， et al. The vaccine adjuvant chitosan promotes cellular immunity via DNA sensor cGAS-STING-dependent induction of type I interferons［J］. Immunity， 2016， 44（3）：597-608.

［49］ SMITH T R F， PATEL A， RAMOS S， et al. Immunogenicity of a DNA vaccine candidate for COVID-19［J］. Nat Commun， 2020， 11（1）：2601.

［50］ SONG K D， LILLEHOJ H S， CHOI K D， et al. A DNA vaccine encoding a conserved Eimeria protein induces protective immunity against live Eimeria acervulina challenge［J］. Vaccine， 2000， 19（2-3）：243-252.

［51］ DING X， LILLEHOJ H S， DALLOUL R A， et al. In ovo vaccination with the Eimeria tenella EtMIC2 gene induces protective immunity against coccidiosis［J］. Vaccine， 2005， 23（28）：3733-3740.

（編輯 白永平）