赤峰地區乳腺癌HER-2基因FISH檢測及臨床意義

摘 要：目的：通過FISH檢測赤峰地區部分乳腺癌患者組織中HER-2基因的擴增情況并結合臨床病理特征探討其具有的臨床意義。方法：收集從2019年4月至2023年12月的赤峰市腫瘤醫院中的156例乳腺癌病例樣本，并從中選出49例用于FISH檢測的樣本。使用免疫組織化學技術及熒光原位雜交技術評估這些樣本中的HER-2蛋白表現及其基因擴增狀況，并對它們與疾病進程的關系進行深入探討。結果：在這49例做FISH檢測的病人中，共有8人存在HER-2基因擴增的現象，擴增率為16.3%（8/49），對做FISH檢測的49例乳腺癌患者的病理參數進行單因素分析，發現HER-2基因擴增狀態與年齡、腫瘤大小、腫瘤位置、有無淋巴結轉移等因素均無相關性（Pgt;0.05）。結論：（1）結合赤峰地區部分乳腺癌患者的情況，FISH檢測仍是判斷HER-2基因有無擴增最精確的辦法。（2）對IHC評分為（2+）的病人，必須進一步采用FISH檢測來確認HER-2基因的擴增狀況，而對被評為IHC評分為（3+）的病人，同樣也需要利用FISH檢測來明確診斷其HER-2基因的擴增狀況，從而為其制定合適的治療策略。（3）IHC和FISH這兩種技術的聯合運用能大大提升HER-2狀態的準確度，有助于向當地居民提供更為精確的HER-2狀態檢測結果，進而更好地實施個性化的治療方案和預測病情發展趨勢，同時也能更加科學合理地指導赫賽汀藥物的使用。

關鍵詞：乳腺癌；人類表皮生長因子受體-2；熒光原位雜交；免疫組織化學染色

中圖分類號：R737.9" 文獻標識碼：A" 文章編號：1673-260X（2024）12-0040-06

收稿日期：2024-09-09

通信作者：李丹丹，女，碩士，主治醫師。郵箱：109821678@qq.com。

基金項目：赤峰市自然科學科研課題（SZR2023167）

根據世衛組織的報告《Global cancer statistics 2022》，每年有超過兩千萬的新發病案例被診斷為各種類型的癌癥。在這之中，乳腺癌的數量驚人，約占總數的四分之一以上[1]。崔旭初[2]等及遲艷玲[3]等的報道顯示，在赤峰市女性主要惡性腫瘤死因順位排序中，乳腺癌位居第四位，嚴重危害赤峰地區女性的健康與生命。

HER-2即為人類表皮生長因子受體-2（Human Epidermal Growth Factor Receptor-2），它是一個存在于第17條染色體的遠端部分上的原癌基因。該蛋白質過量產生或其拷貝數增多會引發惡性疾病的發展，并增強它的擴散能力；同時也會導致更高的風險出現，如病灶遷移，并且會影響患者的診斷結果、病情進展情況及其預期壽命等重要指標，決定著選擇針對性的抗瘤藥劑的問題[4]。大量的醫學實踐證明了HER-2是預測乳腺癌患者生存期的重要依據之一[5，6]。

赫賽?。℉erceptin）又稱曲妥珠單抗（Trastuzumab），是一種能特異性地作用于HER-2的單抗靶向藥物，能高效地阻斷依賴HER-2的腫瘤細胞的增殖和生存能力[7]。研究表明，HER-2擴增的乳腺癌患者可以從赫賽汀治療中獲益，而未擴增的患者療效不明顯[8-10]。

在美國食物及藥物管理局（FDA）認證下，免疫組織化學（Immunohistochemistry，IHC）法和熒光原位雜交（Fluorescence In Situ Hybridization，FISH）被廣泛應用于檢測HER-2的狀態[11]。FISH檢測是判斷HER-2狀態的金標準[12]。由于HER-2基因FISH檢測與乳腺癌中HER-2基因擴增的關系及其對疾病病理狀態的影響至關重要[13]，而目前關于赤峰地區的乳腺癌HER-2基因FISH檢測的研究還處于空白階段，所以本研究針對部分乳腺癌病人實施HER-2基因FISH檢測并探討其所具有的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2019年4月至2023年12月間赤峰市腫瘤醫院手術切除的乳腺癌標本156例，其中做FISH檢測的49例（檢測率為31.4%，49/156），術前或穿刺前未接受過任何治療，均經病理學明確診斷為浸潤性乳腺癌?；颊呔鶠榕?，年齡28～84歲，平均53.4±10.6歲。所有病例標本均在離體后60min內進行10%甲醛固定石蠟包埋處理，組織切片厚度4μm。本研究材料均使用手術切除標本，其他相關臨床資料均取自患者病理報告及病歷資料。本次研究所用標本的臨床使用申請已獲得醫院倫理委員會審核批準。排除標準：（1）合并嚴重的內科疾病、其他生殖系統癥狀、凝血功能異常者；（2）患有血液系統疾病者；（3）長期服用抗凝藥物者；（4）病理及臨床資料缺損者。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑與儀器

HER2基因檢測試劑盒購買于廈門龍進生物科技有限公司，PBS緩沖液、DAB顯色劑均購買于福州邁新生物技術開發有限公司，原位雜交儀（Leica，S500-24）購買于美國雅培ThermoBrite公司。

1.2.2 免疫組織化學（IHC）染色

石蠟連續切片，厚度為4μm，使用防脫載玻片進行撈片。將撈好的切片放入烤箱融蠟，72℃烤片3h，拿出后放到二甲苯溶液脫蠟，6min/缸，共2缸。放在梯度酒精濃度為95%、85%的染色缸內進行水化，3min/缸。接著用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗5次切片，2min/次。之后進行高壓修復，在高壓鍋中加入1L純水和20mL免疫組化抗原修復緩沖液（pH=9.0）煮沸，沸騰后把片子放入鍋中保溫20min，自然冷卻10min，冷水沖涼至室溫，用免疫組化筆畫圈（要稍超過染色組織）。接下來用PBS緩沖液進行三次洗滌并將其甩干，然后加入適量的一抗（兔抗HER-2蛋白），存放在冰箱（4℃）中過夜。取出切片，再次使用PBS緩沖液清潔并甩干。最后滴上適量的二抗（鼠抗兔IgG蛋白），等待15～20min。加二氨基聯苯胺（Diaminobenzidine，DAB）顯色劑顯色，時間5min，之后用自來水沖洗。接著將切片放在蘇木素的染色缸中復染細胞核5min，PBS緩沖液清洗3min。之后將切片放在已經加入自來水的盆中，大幅度搖晃水洗。接著脫水，將切片放在無水乙醇的染色缸中，2min/缸，共2缸。放在二甲苯中透明后，滴加中性樹膠，蓋上蓋玻片，烤箱72℃烤片30min，拿出切片，貼上標簽。在顯微鏡下進行觀察、圖像分析、拍照。

1.2.3 熒光原位雜交（FISH）

1.2.3.1 標本預處理

（1）準備工作。65℃烤片過夜；將盛有純化水的染色缸（操作中的染色缸均為5片立式染色缸）置于水浴鍋中預熱至95～98℃；將盛有40mL 2×氯化鈉檸檬酸緩沖液（Saline Sodium Citrate buffer，SSC）的染色缸置于水浴鍋中預熱至37℃，作為蛋白酶K的工作緩沖液。

（2）操作步驟。組織切片按下列順序依次處理。用松節油或二甲苯脫蠟，脫蠟3次，每次10min；用100%無水乙醇洗脫松節油或二甲苯，洗脫2次，每次5min；放入90%乙醇、70%乙醇、50%乙醇及純化水中，各2min；在95～98℃純化水中，待染色缸內溫度回升至95～98℃后計時20min；在40mL 37℃蛋白酶K工作液（20～200μg/mL 2×SSC）中消化約8～30min；用純化水漂洗，5min；用70%乙醇、90%乙醇、100%乙醇脫水，各2min；將切片完全風干或置于50℃環境中2～5min。

1.2.3.2 標本雜交

將HER2/CEN17探針從-20℃取出，平衡至室溫，簡單離心；取10μL HER2/CEN17探針滴加于切片雜交區域，加蓋22×22mm蓋玻片，排除氣泡。探針使用后立即放回-20℃保存；用橡膠膠水封住蓋玻片的四周，避免橡膠膠水產生氣泡；待橡膠膠水風干后，檢查蓋玻片是否密封，如未密封，再滴加橡膠膠水于缺口處，確保蓋玻片四周密封，再風干；將切片置于原位雜交儀中，設定程序：79℃變性5min，42℃雜交4小時以上（可延長至72小時）。

1.2.3.3 標本洗滌

（1）準備工作。配制40mL洗脫液Ⅰ（40mL 2×SSC、40mL Tween-20）、40mL洗脫液Ⅱ（2mL 2×SSC、40mL Tween-20、38mL純化水）；將洗脫液II預熱至55～65℃，待用。

（2）操作步驟。待雜交結束后，從原位雜交儀中取出切片，用鑷子小心移去橡膠膠水與蓋玻片；在洗脫液I中振蕩漂洗5min；在55～65℃洗脫液Ⅱ中浸洗5min，放入切片后染色缸內溫度回升至55～65℃開始計時，每分鐘晃動切片數秒；在2×SSC中漂洗2min；在70%乙醇中脫水2min；室溫下完全風干。

1.2.3.4 標本復染及觀察

取10μL抗淬滅/復染劑（4，6-二脒基-2-苯基吲哚1 000ng/mL、對苯二胺800ng/mL溶于油和磷酸緩沖鹽溶液pH=7.4）滴加于切片的雜交區域（抗淬滅/復染劑臨用前取出，用后立即放回-20℃保存），加蓋22×22mm蓋玻片，在熒光顯微鏡下進行觀察。

1.2.4 統計學方法

研究數據采用SPSS 26.0統計軟件，結果用例數和概率表示，組間比較用卡方檢驗或確切概率法，若Plt;0.05則證明數據有統計學意義。

2 結果

2.1 IHC法檢測乳腺癌HER-2蛋白表達情況

乳腺癌組織的石蠟切片上，HER-2蛋白的IHC法表達結果如圖1，根據IHC判斷標準[13]，判讀A為HER-2蛋白表達（0）；B為HER-2蛋白表達（1+）；C為HER-2蛋白表達（2+）；D為HER-2蛋白表達（3+）。

2.2 FISH法檢測乳腺癌HER-2基因擴增情況

乳腺癌組織的石蠟切片上，HER-2基因的FISH探針檢測結果如圖2，HER-2基因的FISH探針檢測簇狀擴增結果如圖A，癌細胞核紅色的信號點（為正方形所指）連接成簇時，根據判斷標準[13]直接判讀為HER-2基因擴增；圖B中癌細胞核紅色的信號點（為正方形所指）的數目相對于綠色信號點（為圓形所指）的數目之比為（HER-2/CEP17）3.43gt;2.0，且平均HER-2基因拷貝數為7.9gt;4.0，根據判斷標準判讀圖B為HER-2基因擴增；圖C中癌細胞核紅色的信號點（為正方形所指）的數目相對于綠色信號點（為圓形所指）的數目之比為（HER-2/CEP17）1.22lt;2.0，且平均HER-2基因拷貝數為3.05lt;4.0，根據判讀標準判讀為未擴增。

2.3 IHC和FISH檢測檢測結果符合率

在挑選出做FISH檢測的49例的患者中，HER-2基因擴增8例，擴增率為16.3%，參考表1的數據。本研究發現，在那些同時使用了IHC法來評估乳腺癌的HER-2蛋白表現的患者群體里，有4位患者的HER-2蛋白呈現出（1+）的表現，而這四位的HER-2基因沒有擴增；另外37名患者顯示的是（2+）的HER-2蛋白表現，6人存在著HER-2基因的擴增，31人的HER-2基因沒有擴增。最后，還有兩位患者顯示出了（3+）的HER-2蛋白表現，其中1人是HER-2基因的擴增，另1人是未擴增的情況。未用IHC檢測乳腺癌HER-2蛋白表達的有6人，其中1人擴增，另外5人展現出不擴增的情況。得出IHC HER-2（0/1+）與FISH陰性符合率為100%（4/4），IHC HER-2（2+）與FISH陽性符合率為16.2%（6/37），IHC HER-2（3+）與FISH陽性符合率為50%（1/2）。

2.4 乳腺癌組織HER-2基因擴增與臨床病理特征關系

對做FISH檢測的49例乳腺癌患者的疾病病理狀態進行統計分析得出：HER-2基因擴增狀態與年齡、腫瘤大小、有無淋巴結轉移、腫瘤位置等因素均無相關性（Pgt;0.05），見表2。

3 討論

由于在臨床中使用赫賽汀來治療HER-2過量的乳腺癌患者的成功案例越來越多，因此對于準確識別和解讀HER-2狀況的要求也在不斷增加。目前臨床實踐檢測HER-2基因的兩種方法主要是IHC染色法和FISH檢測[11]。IHC方法利用抗原和抗體之間的相互作用，識別并量化腫瘤細胞表面抗原的方式。然而免疫組化法有一定的弊端，其依賴于對樣本的主觀解讀，同一塊切片可能因病理醫師間的差異而產生多種解釋；另外，實驗過程中的各種變數也會干擾結果的評估，如福爾馬林處理會降低或消除蛋白質抗原的活性，酒精暴露會導致其他非特異性的蛋白質抗原染色等。同時，不同批號的抗體濃度也有所變動[14，15]。為了避免這些潛在的影響，病理科必須實施嚴謹的質量管控措施，包括標準化的操作流程和評級系統。定期執行質控和管理工作有助于提升IHC測試結果的一致性和可靠度。

對比IHC染色，FISH技術具有靈敏度高，結果為雙色熒光信號，具有避免綠色熒光干擾的優勢，通過使用FISH技術可以準確地評估患者的HER-2基因擴增狀況[16]。然而基因表達調節過程相當復雜，例如癌癥等原因可能引發部分基因的擴增，但是這不一定意味著這些基因會過度表達蛋白質。另外，針對乳腺癌的靶向療法中，赫賽汀能夠與乳腺癌細胞表面的HER-2受體相互作用并阻止或減緩腫瘤細胞的生長及生存能力[17]。根據中國的《乳腺癌HER2檢測指南（2019年版本）》[13]，已經廢除了對FISH判斷結果中的疑惑，如果FISH HER-2/CEP17比例低于2，且平均HER-2拷貝數量為4至6個每細胞之間，那么就需要結合IHC的結果來做出最終決定。隨著醫療實踐經驗的豐富和新研究數據的發現，美國臨床腫瘤學會（American Society of Clinical Oncology，ASCO）美國病理學家學會（College of American Pathologists，CAP）指南對于HER-2陽性的閾值也一直在調整。

49例乳腺癌石蠟標本中，在新標準下[13]，本研究HER-2基因擴增率為16.3%，低于國外[18，19]報道的25%，國內李昕等[20]報道的30.96%，這可能與地區、費用、儀器等的差異有關。本研究得出IHC評分為（0/1+）與FISH檢測的陰性符合率為100%（4/4），提示IHC檢測HER-2結果為（0/1+）的患者與FISH檢測高度一致，略高于王清等[21]報道的97.1%，并且本研究的病例中未出現相關文獻[21，22]報道的IHC評分為（0/1+）的患者有HER-2基因擴增的病例，這樣的結果可能與樣本數量少有關。IHC評分為（2+）與FISH檢測的陽性符合率為16.2%（6/37），與MAGDALENA BT等[23]人的研究結果基本符合。這樣的結果表明IHC檢測HER-2狀態為（2+）的患者，IHC與FISH的檢測結果存在較大差異，存在假陽性或者假陰性的狀態，所以在臨床實踐中，出現經IHC檢測初篩HER-2狀態為（2+）的患者時，為了確保此患者能夠用靶向藥物進行治療，必須進行FISH檢測來確定HER-2基因的狀態。IHC評分為（3+）與FISH檢測的陽性符合率為50%（1/2例），雖然低于要建超[4]96.8%的報道，但是本研究也存在HER-2（3+）的患者FISH檢測不擴增。據研究表明[4，13]，用赫賽汀治療的前提為IHC評分為（3+）或者FISH檢測為擴增。結合本研究的結果，如果對這位IHC評分為（3+）的患者不再進行FISH檢測而直接用靶向藥物予以治療，但最終經金標準FISH檢測為不擴增，那么實際結果是此患者不能從靶向藥物治療中獲益。本研究與一些專家[24，25]均認為結合IHC和FISH的方法是最有效的檢測方法。

已有的研究資料顯示，中國的乳腺癌發病高峰年齡通常出現在45至55歲的區間內，而且年輕患者的生存狀況往往更糟糕，這使得年齡成了預測疾病結果的一個重要風險因子[26，27]，本研究年齡經單因素分析與HER-2基因擴增無相關性（Pgt;0.05），與相關文獻一致[28]。本研究發現在腫塊發生位置上，左乳腫塊發生率略大于右乳腫塊發生率，同樣經單因素分析不具有統計學意義（Pgt;0.05），與相關文獻結果一致[27]。通常情況下，乳腺癌患者的初次就醫主因多為無癥狀的腫塊，且腫塊的大小與其預后狀況密切相關。然而，本研究結果顯示，HER-2基因擴增和腫瘤大小并無明顯關聯（Pgt;0.05）。相反，已有其他研究指出，當腫瘤直徑超過兩厘米時，其發生HER-2基因擴增的風險會顯著增加[28]。此外，王鴻雁等[29]人還報道HER-2基因擴增還可能與淋巴結轉移有關，但張明帥等[28]人的報道認為HER-2基因擴增狀態與淋巴結有無轉移無關，本研究結果也顯示HER-2基因擴增狀態與淋巴結有無轉移無關（Pgt;0.05）?？傊壳瓣P于HER-2基因擴增情況與哪些病理特征相關聯，是一個爭論性問題，樣本數量較少可能是諸多原因之一，所以本研究有待加大樣本量以展開更深層次的研究。

綜上所述，本研究得出：（1）結合赤峰地區部分乳腺癌患者的情況，FISH檢測仍是判斷HER-2基因有無擴增最精確的辦法。（2）對于被評為IHC評分為（2+）的病人，必須進一步采用FISH檢測來確認HER-2基因的擴增狀況，而對于被評為IHC評分為（3+）的病人，同樣也需要利用FISH檢測來明確診斷其HER-2基因的擴增狀況，從而為其制定合適的治療策略。（3）IHC和FISH這兩種技術的聯合運用能大大提升HER-2狀態的準確度，有助于向當地居民提供更為精確的HER-2狀態檢測結果，進而更好地對其實施個性化的治療方案和預測病情發展趨勢，同時也能更加科學合理地指導赫賽汀藥物的使用。

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