茶樹果膠甲酯酶及其抑制子家族基因的鑒定及CsPME55參與氟脅迫響應的功能分析

摘要：茶樹（Camellia sinensis）具有氟（Fluoride，F）富集特性，且F主要富集在細胞壁組分的果膠中；果膠甲酯酶（Pectin methylesterase，PME）及其抑制子PMEI（Pectin methylesterase inhibitor）能夠催化果膠的修飾進而影響細胞壁特性，參與植物生長發育、逆境響應等過程。從茶樹舒茶早基因組中鑒定了85個CsPMEs和56個CsPMEIs成員，分別包括4個和5個亞族；不同亞族可能因基因結構、保守基序和表達模式等不同呈現功能分化。熒光定量結果表明，CsPME3a、CsPME55、CsPMEI1和CsPMEI3在福鼎大白茶成熟葉中被F處理顯著誘導表達。此外，過表達CsPME55緩解了F脅迫對擬南芥根系生長的抑制作用，推測CsPME55可能參與茶樹F脅迫調控，研究結果將為進一步研究PME和PMEI家族基因參與F響應的功能奠定基礎。

關鍵詞：茶樹；氟；果膠甲酯酶；果膠甲酯酶抑制子；基因表達；功能分析

中圖分類號：S571.1；Q945.11 " " " " " "文獻標識碼：A " " " " " "文章編號：1000-369X（2024）06-869-18

Identification of Pectin Methylesterase and Its Inhibitory Subfamily Genes， and Functional Analysis of CsPME55 in Response to Fluoride Stress in Camellia sinensis

XU Wenluan， WEN Xiaoju， JIA Yuxuan， NI Dejiang， WANG Mingle*， CHEN Yuqiong*

National Key Laboratory for Germplasm Innovation and Utilization of Horticultural Crops， College of Horticulture and Forestry Sciences， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China

Abstract： Tea plant （Camellia sinensis） has fluoride （F） enrichment characteristics， and F is mainly enriched in the cell wall component pectin. Pectin methylsterase （PME） and its inhibitor PMEI can catalyze the modification of pectin， thereby affecting cell wall characteristics and participating in the regulation of processes like plant growth and development， stress response and so on. In this study， 85 CsPMEs and 56 CsPMEIs were identified from the C. sinensis ‘Shuchazao’ genome， which were divided into 4 and 5 subgroups， respectively. Distinct subgroups may exhibit functional distinction due to varied gene architectures， conserved motifs and expression patterns. Quantitative real-time PCR （qRT-PCR） analysis reveals that the expression levels of CsPME3a， CsPME55， CsPMEI1 and CsPMEI3 were significantly induced in the mature leaves of ‘Fuding Dabaicha’ under F treatment. Moreover， overexpression of CsPME55 alleviated Arabidopsis root growth inhibition induced by F stress， suggesting its potential role in F stress regulation in tea plants. These findings could pave the way for further research on the functional involvement of PME and PMEI gene families in F response.

Keywords： Camellia sinensis， fluoride， pectin methylesterase， pectin methylesterase inhibitor， gene expression， functional analysis

茶樹（Camellia sinensis）是一種重要的葉用經濟作物，其葉可以加工成富含生物活性成分和愉悅風味的飲品，在全世界范圍內廣受歡迎。茶樹被發現具有氟（Fluoride，F）富集特性，可以通過空氣、土壤、水分等途徑吸收和富集F[1]。F不是茶樹生長發育的必需元素，卻是人體必需微量元素，而飲茶通常被認為是人體獲取F的第二途徑，但長期飲用F含量較高的茶會危害人體健康[2-3]。F脅迫會誘發茶樹的氧化應激，干擾其基因表達、信號傳導等正常生理生化過程，造成生長發育不良，導致根系發黑、葉邊緣壞死、細胞結構受損等癥狀[4-5]，同時也會影響茶樹品質成分如兒茶素、氨基酸等關鍵次級代謝物的合成[6-8]。

茶樹根系具有很強的F吸收轉運能力，它主要通過木質部向上運輸F[7]。F主要分布在葉片中，且多在成熟葉中富集，因此有學者認為F含量也可以作為茶葉品質評價指標之一[9-11]。據報道，細胞壁是F富集的主要部位，葉片中有67%～92%的F分布在細胞壁中，而果膠是茶樹葉片細胞壁累積F的主要部位，其F含量占細胞壁總F含量的56%～71%[10]。果膠是最具流動性、最易帶電的，可能對環境變化最敏感的細胞壁成分，因此非常適合用于防御監測，在細胞壁力學、細胞壁完整性以及細胞壁介導的植物免疫中發揮重要作用[12-14]。

同型半乳糖醛酸（Homogalacturonan，HG）是最豐富的果膠類型，它在高爾基體中以高度甲酯化狀態被合成，運輸到細胞外間隙（Extracellular space，ECS）后被果膠甲酯酶（Pectin methylesterase，PME）選擇性地去甲酯化，而PME的活性反過來又受PME抑制子（Pectin methylesterase inhibitor，PMEI）的調節，即PME和PMEI共同調控HG的修飾，進而調節細胞壁特性[15-16]。PME和PMEI對于細胞擴張、植物生長發育和植物免疫都至關重要，其功能研究在多種植物中都有報道，比如，AtPME35能夠調控細胞壁去甲酯化程度，在擬南芥（Arabidopsis thaliana）莖伸長過程中提供機械支撐[17]；過表達OsPMEI28能夠通過增加果膠甲酯化水平；導致水稻（Oryza sativa）矮化[18]；FvPME38/39在草莓（Fragaria vesca）果實軟化過程中發揮重要的調控作用[19]，CsPMEs和CsPMEIs參與調控低溫誘導下的臍橙（Citrus sinensis Osbeck）果實粒化[20-21]；AtPME17能夠增加病原體誘導的PME活性和擬南芥對灰孢桿菌的抗性，而GhPMEI3能夠增強棉花（Gossypium hirsutum）對黃萎病的抗性[22-23]。此外，茶樹PME能夠增強茶樹對鋁的（Aluminum，Al）耐受性[24-25]，而茶樹PMEI也有參與冷脅迫響應及開花發育的報道[26]。據報道[10]，F的添加能夠促進茶樹細胞壁果膠的去甲酯化，同時誘導PMEs的活性和基因表達增加，但PME對F富集的影響及具體機制還有待進一步探索。

本研究中對茶樹PME和PMEI基因家族進行了全基因組鑒定，對其理化性質、基因結構、保守結構域、系統進化以及在F脅迫下的表達等進行了分析；同時，對CsPME55在轉基因擬南芥中的功能進行了初步分析。旨在為進一步研究PME和PMEI基因家族參與F脅迫條件下的基因功能奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料和處理

本研究選用茶樹品種鄂茶10號（ICR-22945）和福鼎大白茶（ICR-22965）一年生扦插苗進行F處理，水培處理在華中農業大學茶樹種質資源圃大棚中進行。先置于去離子水中緩苗7 d，再使用1/2茶樹營養液（pH=5.0）[27]連續培養1個月，每7 d換1次營養液，然后轉至外源添加NaF的營養液（0.5 mmol·L-1 NaF，pH=5.5）[28]中培養，分別在0、1、2 h和12 h剪取茶樹嫩葉（第一葉）和成熟葉（倒數第二片葉子），液氮速凍后于﹣80 ℃冰箱保存備用，用于分析茶樹PMEs和PMEIs在F脅迫條件下的表達。本研究克隆CsPME55開放閱讀框所用材料為福鼎大白茶的新梢（一芽一葉），采自華中農業大學茶樹種質資源圃。

1.2 茶樹PME和PMEI基因家族成員的鑒定

使用PME家族Pfam登錄號（PF01095）和PMEI家族Pfam登錄號（PF04043）在InterPro數據庫[29]獲得PME和PMEI家族的隱馬爾可夫模型（HMM），利用HMM在HMMER網站（www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer）獲得CsPMEs和CsPMEIs的序列（E-value≤1e-5），以茶樹舒茶早基因組為參考基因組進行搜索比對，茶樹基因組下載自Tea Plant Information Archive（TPIA）[30]，結合PROSITE（https：//prosite.expasy.org）、SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de）和CDD網站（www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/

bwrpsb/bwrpsb.cgi）進行結構域核實和確認。

1.3 茶樹PME和PMEI基因家族成員蛋白的生物信息學分析

利用在線網站ExPASy（https：//web.expasy.

org/compute_pi）預測蛋白分子量和理論等電點（pI）；利用GSDS 2.0（https：//gsds.gao-lab.

org）進行基因結構分析；分別使用MEME（https：//meme-suite.org/meme）和CDD網站檢索保守基序和特征結構域，并利用TBtools[31]進行可視化；使用MEGA X軟件[32]中的鄰接法（Neighbor-Joining）對茶樹、擬南芥和水稻PMEs和PMEIs進行系統進化樹繪制，其中Bootstrap value設置為1 000。

1.4 茶樹PME和PMEI基因家族成員的表達分析

茶樹PMEs和PMEIs在茶樹8個組織中的表達數據獲取自TPIA。分別使用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（華越洋，北京）和cDNA第一鏈合成試劑盒（SIMGEN，杭州）進行RNA提取和反轉錄，獲得的cDNA用于逆轉錄PCR（Reverse transcription-PCR，RT-PCR）和即時PCR（Quantitative real time PCR，qRT-PCR）。利用在線軟件Genscript（www.genscript.com/

tools/real-time-pcr-taqman-primer-design-tool）設計PMEs和PMEIs基因特異性定量引物（表1），分別以CsEF-1α和CsUBC為嫩葉和成熟葉中的內參基因進行歸一化分析[33]。試驗參照PerfectStart? Green qPCR SuperMix（全式金，北京）的試劑說明書，在ABI Step One Plus? Real Time PCR System（Applied Biosystems，美國）上進行，試驗結果利用 算法進行分析[34]。其中，將0 h的表達量設定為1.0。

1.5 CsPME55的克隆與轉基因擬南芥植株的獲得

以福鼎大白茶的cDNA為模板，以CsPME55-F/R（表1）為引物，利用PrimeSTAR? GXL DNA Polymerase（TaKaRa，大連）擴增不含終止密碼子的CsPME55的開放閱讀框。將所得擴增產物連接pTOPO-Blunt Vector（艾德萊，北京）后菌液檢測，陽性克隆送北京擎科新業生物技術有限公司測序，并對測序正確的陽性克隆進行質粒抽提（艾德萊，北京）。以上述質粒為模板，以pBinGlyRed3-CsPME55-

F/R（表1）為引物進行PCR擴增，擴增產物參照ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit（諾唯贊，南京）重組試劑盒說明書在SmaI位點插入連接到植物表達載體pBinGlyRed3中，獲得pBinGlyRed3-CsPME55重組質粒。利用凍融法將pBinGlyRed3質粒（Vector）和上述重組質粒轉入農桿菌GV3101感受態細胞，通過蘸花法得到擬南芥轉基因T0代植株，利用pBinGlyRed3載體的DsRed的紅色熒光蛋白標記特性[35]，結合PCR鑒定結果[36]，獲得T1代陽性種子，經過3代篩選最終得到T3代純合株系。

1.6 轉基因擬南芥的表型分析及CsPME55的亞細胞定位

將同期收獲的野生型（WT）和T3代轉基因擬南芥種子（Vector、OE-1、OE-2和OE-3）

經低溫春化和消毒后播種在含有不同濃度NaF（0、0.2、2 mmol·L-1和3 mmol·L-1）的1/2MS固體培養基（酷萊博，北京）中，放置于組培室（晝/夜參數：24 ℃/22 ℃，16 h/8 h）中培養3 d后統計擬南芥的萌發率，培養2周后拍照記錄并稱取鮮重，同時使用Image J軟件（Version 1.8.0）測量根長。將上述樣品烘至恒重后磨成粉末置于干燥條件下儲存，用于后續水溶性F含量的測定。利用超聲波和沸水浸提測定F含量。精確稱取0.02 g上述粉末于離心管中，加入2 mL超純水，75 ℃超聲浸提40 min，100 ℃沸水浸提30 min，每10 min振蕩混勻1次，然后12 000 r·min-1離心15 min。冷卻后取1 mL上清液，加入1 mL總離子緩沖液［3 mol·L-1三水合乙酸鈉∶0.75 mol·L-1二水合檸檬酸鈉=1∶1（V/V）進行配制］，充分混勻后用F離子電極（雷磁，上海）測量，利用標準曲線計算F含量，F含量測定包括3個生物學重復。為了確認CsPME55的亞細胞定位，利用激光共聚焦顯微鏡（Leica SP8，德國）觀察空載和CsPME55轉基因擬南芥（一周齡）葉片表皮細胞中的紅色熒光信號（RFP）并拍照，RFP分別在552 nm和590～650 nm被激發和接收。

2 結果與分析

2.1 茶樹PME和PMEI家族的鑒定

在茶樹中分別鑒定出85個PMEs和56個PMEIs，基本信息分別見表2和表3。PMEs中包含59個I型PME（同時包含PME結構域和PMEI結構域）和26個II型PME（僅包含PME結構域），編碼序列（Coding sequence，CDS）長度為378～3 624 bp；蛋白質分子量為13.53～133.42 kDa；理論pI為4.75～9.65。而PMEIs的CDS序列長度為417～1 506 bp；蛋白質分子量

為15.10～54.93 kDa；理論pI為3.93～9.76。

2.2 進化樹分析

分別以擬南芥、水稻和茶樹的194條PME蛋白序列和183條PMEI蛋白序列構建進化樹，結果表明（圖1），PME家族可被分為4個亞族（Ⅰ～Ⅳ），其中超70%（60個）的成員屬于Ⅰ亞族；而PMEI家族可被分為5個亞族（Ⅰ～Ⅴ），其中半數成員（28個）屬于Ⅴ亞族。

2.3 基因結構和保守基序分析

基因結構分析發現，除CsPME17/38不含內含子，CsPME21含有14個內含子外，其余CsPMEs的內含子個數為1～5個（表2）；而在56個CsPMEIs中，只有13個被檢索到有內含子，其中，CsPMEI13包含9個內含子，數量最多（表3）。

利用MEME鑒定CsPMEs和CsPMEIs的保守基序（Motif）。如圖2所示，CsPMEs的Motif數量為4～16，其中絕大多數蛋白包含Motif 1～5和Motif 8，說明這幾個Motif較為保守且可能承擔較為重要的生物學功能。此外，同一亞族的蛋白Motif相似性較高，暗示其在進化過程中可能具有相似的功能分化，PME特征結構域（Domain）的分析也印證了這一觀點，比如亞族Ⅱ的成員均為Ⅰ型PME，而亞族Ⅳ的成員均為Ⅱ型PME。和PME相比，PMEI蛋白Motif的數量較少（圖3），為1～9，其中CsPMEI51只包含Motif 2，CsPMEI43只包含Motif 14，此外，CsPMEI13包含兩個PMEI特征結構域。

2.4 表達模式分析

TPIA的組織表達數據表明，多數CsPMEs在根或花中特異性表達（圖4），比如CsPME57僅在根中表達，CsPME23在花中特異性高表達；而部分CsPMEs在茶樹各組織均有表達，比如CsPME3a在頂芽、嫩葉、莖和花中均有高豐度表達；此外，CsPME24、CsPME36、CsPME70和CsPME71未檢測到表達。

組織分析發現（圖5），多數CsPMEIs在根或花中表達較高，如CsPMEI43在花中高表達；而部分CsPMEIs在茶樹各組織均有表達，如CsPMEI1/29僅在老葉中表達較低；此外，CsPMEI12等7個基因未檢測到表達。

2.5 CsPMEs和CsPMEIs在F脅迫條件下的表達分析

分別在PME和PMEI基因家族中隨機選擇了4個基因，對其在F脅迫下的表達水平進行了qRT-PCR分析（圖6）。在茶樹品種鄂茶10號中，除CsPMEI1外，其余基因在嫩葉中的表達整體呈下調趨勢，而CsPME31、CsPME51和CsPME55在成熟葉中表達上調。在茶樹品種福鼎大白茶中，未在其嫩葉中檢測到CsPME3a、CsPME31和CsPMEI17的表達，CsPME55表達無顯著變化，而CsPME51、CsPMEI1、CsPMEI3和CsPMEI31均呈現出先上調后下調的表達趨勢（圖6A）；在成熟葉中，CsPME3a、CsPME55、CsPMEI1和CsPMEI3均被誘導表達，CsPME31、

CsPME51和CsPMEI17下調表達，而CsPMEI31的表達則出現了動態變化，即先降后升再降，并在2 h時達到最大值（圖6B）。上述結果表明，F脅迫條件下，CsPMEs和CsPMEIs的表達水平與茶樹品種的F富集特性以及葉片成熟度有關。

2.6 過表達CsPME55對轉基因擬南芥F耐受的影響分析

上述結果表明，CsPME55在8個組織中均有較高表達，同時其在鄂茶10號和福鼎大白茶的成熟葉中均能夠受F誘導而上調表達，因此，選擇了CsPME55進行進一步的功能驗證。為驗證CsPME55的生物學功能，將WT和轉基因擬南芥株系（Vector、OE-1、OE-2和OE-3）播種在未添加（Control）和外源添加NaF的1/2MS培養基中。播種3 d后發現，3 mmol·L-1 NaF顯著抑制了擬南芥種子的萌發，使萌發率降低到了40.00%～63.33%，而CsPME55過表達株系（OE-1、OE-2和OE-3）表現出萌發優勢（圖7）；播種14 d后，擬南芥在添加外源NaF后根系發

育受到明顯抑制（圖8A），包括根系生長（圖8C）和側根發育（圖8D），且WT和Vector受抑制程度更重，0.2 mmol·L-1 NaF條件下表現最為明顯。此外，和對照相比，外源添加2 mmol·L-1 NaF顯著降低了擬南芥的鮮重（圖8B）。F含量測定發現，對照條件下僅有WT和OE-2的F含量存在顯著差異（Plt;0.05）（圖8E）；而添加0.2 mmol·L-1外源NaF之后，與WT相比，所有轉基因擬南芥F含量均較低，且Vector、OE-2和OE-3顯著降低；添加2 mmol·L-1外源NaF之后，與WT和Vector相比，CsPME55過表達株系中的F含量較低，且OE-3顯著降低（Plt;0.05）。上述結果表明，過表達CsPME55能夠在一定程度上緩解F脅迫對轉基因擬南芥生長的抑制，尤其是根系發育。

2.7 CsPME55的亞細胞定位

為確定CsPME55蛋白的亞細胞定位，利用激光共聚焦顯微鏡觀察了一周齡的CsPME55轉基因擬南芥，對照為pBinGlyRed3空載。結果表明，空載蛋白的紅色熒光信號（RFP）在擬南芥細胞核和細胞質中廣泛存在，而pBinGlyRed3-CsPME55蛋白集中在細胞質中（圖9）。

3 討論

本研究從茶樹舒茶早基因組中分別鑒定了85個CsPMEs和56個CsPMEIs。鑒定的基因數多于Huang等[25]鑒定的CsPMEs以及Li等[26]鑒定的CsPMEIs，這可能與參考的數據庫以及篩選鑒定的標準不完全相同有關。參考擬南芥和水稻的PME和PMEI蛋白的系統發育關系，茶樹PME和PMEI家族分別被分為4個和5個亞家族，基因結構和保守基序分析也支持這個分類，每個亞家族成員間都有相似的基因結構和保守基序。同時一些基因的序列、基因結構以及保守基序相似性極高，如CsPME32a/b和CsPMEI9a/b，這表明兩個家族中可能存在功能冗余。

基因的表達模式是基因功能預測的重要依據，表達模式分析發現，CsPMEs和CsPMEIs在各組織中的表達存在較大差異，表明其在不同組織中可能存在功能分化。PMEs的表達被證明具有組織特異性、以特定的方式受脅迫調控、參與植物防御響應并在廣泛的發育過程中受到調控的特點[37]。例如，AtPME35在花序莖基部特異性表達并參與調控擬南芥莖伸長[17]，而在保衛細胞中高度表達的AtPME34能夠受脫落酸誘導表達，通過促進氣孔運動來增加擬南芥耐熱性[38]，因此根據組織表達特性可以推斷，在花中特異性高度表達的CsPME13和CsPMEI54等基因可能參與茶樹花發育。F響應分析發現，CsPME3a、CsPME55、CsPMEI1和CsPMEI3在福鼎大白茶成熟葉中被誘導上調表達，同時F又主要在成熟葉中富集，推測它們可能參與F脅迫響應。

F脅迫會影響茶樹的正常生長發育，而PME和PMEI能夠通過參與細胞壁修飾而廣泛地參與到植物的生長發育、氣孔運動、逆境響應等過程的調控，F代謝相關基因的表達被認為是植物耐F和維持F穩態的重要因素[8]。為了進一步確定CsPMEs在茶樹響應F脅迫中的作用，本研究利用擬南芥轉基因系統對CsPME55進行了初步功能分析，過表達CsPME55在3 mmol·L-1 NaF脅迫條件下的種子萌發率高于WT以及空載，這表明CsPME55可能在種子萌發過程中發揮作用，類似功能在萵苣（Lactuca sativa）、擬南芥和棉花中均有報道[39-40]，PME

在種子發育和發芽過程中可能存在誘導作用，且PME活性與種子萌發能力存在正相關[41]。F脅迫會影響茶樹根系發育[10]，而過表達CsPME55在一定程度上緩解了F脅迫誘導的擬南芥根系抑制。PME和PMEI在根系發育和礦質元素耐受的研究早有報道，AtPME46被發現能夠通過降低PME酶活性，減少Al與細胞壁的結合，從而減輕Al誘導的根系生長抑制[42]，而OsPME14能夠提高根尖細胞壁的PME活性和Al含量，且過表達水稻對Al脅迫更敏感[43]；木薯（Maninot esculenta）PMEI成員MePMEI1被發現可以抑制細胞壁的PME活性，且能夠促進過表達擬南芥對重金屬鉛的耐受[44]。CsPME55在8個組織中均有較高表達且在根部表達最高，同時其在成熟葉中的表達能夠受F誘導而上調，推測CsPME55可能在F脅迫響應中發揮作用，而CsPME55能夠在一定程度上緩解F脅迫對轉基因擬南芥的生長抑制，可能與其定位在細胞質有關。

綜上，本研究對茶樹PME和PMEI家族基因基本理化特性、系統進化關系、蛋白序列、組織表達和F響應進行了分析，初步探索了CsPME55在F脅迫響應中可能發揮的作用。結果表明，茶樹PMEs和PMEIs具有組織特異性表達且可能參與F脅迫響應，但參與調控植物響應F脅迫的具體分子機制還需要進一步的研究。

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