高效液相色譜法測定固體飲料、糖果中的β-胡蘿卜素

摘 要：目的：建立固體飲料、糖果中β-胡蘿卜素的提取方法，利用高效液相色譜法測定樣品中β-胡蘿卜素含量。方法：稱取均勻試樣，添加抗氧化劑，加水分散溶解、石油醚-丙酮（體積比為1∶1）萃取、水洗、濃縮后復(fù)溶用高效液相色譜法測定β-胡蘿卜素的含量。結(jié)果：在β-胡蘿卜素含量0.5～10.0 μg·mL-1范圍內(nèi)，線性相關(guān)系數(shù)R=0.999 5，呈良好相關(guān)性，樣品平均加標(biāo)回收率在91.9%～99.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.14%～3.59%。結(jié)論：該方法相較《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中胡蘿卜素的測定》（GB 5009.83—2016）更簡單、快速，能有效降低前處理過程中氧化損失，可用于固體飲料、糖果中β-胡蘿卜素的測定。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法；β-胡蘿卜素；固體飲料；糖果

Determination of β–Carotenoids in Solid Beverages and Confectionery by High Performance Liquid Chromatography

Abstract： Objective： To establish an extraction method for β-carotene in solid beverages and candies， and to determine the content of β-carotene in the samples using high-performance liquid chromatography. Method： Weigh a uniform sample， add antioxidant， disperse and dissolve in water， extract with petroleum ether acetone （1∶1）， wash with water， concentrate， and then dissolve again. Determine the content of β - carotene by HPLC. Result： The linear coefficient R was 0.999 5 within the range of β - carotene content from 0.5 μg·mL-1 to 10.0 μ g·mL-1， showing good linearity. The sample recovery rate was from 91.9% to 99.3%， and the average relative standard deviation was from 1.14% to 3.59%. Conclusion： This method is simpler and faster compared to GB 5009.83—2016， and can effectively reduce oxidative losses during pretreatment. It can be used for the determination of β - carotene in solid beverages and candies.

Keywords： high-performance liquid chromatography; β-carotene; solid beverages; candy

β-胡蘿卜素為橘黃色脂溶性化合物，是自然界中普遍存在的天然色素。β-胡蘿卜素在樣品中分為游離態(tài)和結(jié)合態(tài)兩種形式，天然食品中的β-胡蘿卜素多為結(jié)合態(tài)胡蘿卜素。β-胡蘿卜素具有營養(yǎng)保健作用以及很強(qiáng)的抗氧化作用，被廣泛添加到食品中，一定條件下能在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為維生素A，起到保護(hù)視力、預(yù)防夜盲癥、干眼癥等作用[1-4]。

β-胡蘿卜素的常用檢測方法有高效液相色譜法[5-6]、紫外-可見光譜法[7-8]、熒光光譜法[9]，其中高效液相色譜法是檢測β-胡蘿卜素最常用的方法。《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中胡蘿卜素的測定》（GB 5009.83—2016）中皂化的前處理方式適用于大部分食品中β-胡蘿卜素的測定。然而對于固體飲料、糖果等類別食品，β-胡蘿卜素多為人工添加，本身屬于游離狀態(tài)，可省去皂化步驟，簡化檢測流程。

β-胡蘿卜素分子式中的多共軛雙鍵結(jié)構(gòu)易受到外界條件，如光、熱、氧等因素的影響而產(chǎn)生異構(gòu)和轉(zhuǎn)化。皂化過程中的加熱、堿濃度都會影響β-胡蘿卜素的測定。SUNDARESAN等[10]針對膳食補(bǔ)充劑中β-胡蘿卜素含量測定，發(fā)現(xiàn)皂化會造成復(fù)合維生素-復(fù)合礦物質(zhì)片中55%的β-胡蘿卜素?fù)p失，而用55～60 ℃熱水溶解片劑后，用有機(jī)溶劑直接提取能得到更接近樣品理論值的分析結(jié)果。國內(nèi)相關(guān)研究表明，皂化溫度與萃取次數(shù)對胡蘿卜素的檢測有較大影響[11-14]。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

固體飲料1、固體飲料2、壓片糖果1、壓片糖果2和軟糖，均為市售。β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品，ANPEL公司；氫氧化鉀、無水硫酸鈉、石油醚和無水乙醇，廣州化學(xué)試劑廠；抗壞血酸，Sigma公司；甲醇、乙腈、三氯甲烷和二氯甲烷，均為色譜純，Merck公司；2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚，Sigma公司；實驗室用水（超純水）。

UltiMate3000液相色譜儀，德國Thermo；EFAA-DC-24全自動氮吹儀，上海安譜；Milli-Q Reference超純水系統(tǒng)，法國Millpore；萬分之一電子天平，德國賽多利斯；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國Heidolph。

1.2 試驗方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

①標(biāo)準(zhǔn)儲備液（100 μg·mL-1）：準(zhǔn)確稱取β-胡蘿卜素對照品10.0 mg（精確到0.1 mg），加入0.25 g"2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚，用二氯甲烷溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL棕色容量瓶中定容至刻度，于-20 ℃避光保存。②標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別精密量取儲備液0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.30 mL、0.40 mL和1.00 mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液于10 mL棕色容量瓶中，用二氯甲烷定容至刻度，搖勻，得到β-胡蘿卜素的濃度分別為0.5 μg·mL-1、1.0 μg·mL-1、2.0 μg·mL-1、3.0 μg·mL-1、4.0 μg·mL-1和10.0 μg·mL-1。

1.2.2 樣品前處理（不含皂化步驟）

稱取1～2 g試樣，加入1 g抗壞血酸，加50 mL水混勻，于25 ℃搖床振蕩處理30 min后，將試液轉(zhuǎn)入250 mL分液漏斗，加入50 mL萃取試劑，輕輕搖動，排氣，蓋好瓶塞，振搖3 min后靜置分層，重復(fù)萃取3次。合并有機(jī)相，用水洗至中性，棄去水相，有機(jī)相通過無水硫酸鈉過濾除水，轉(zhuǎn)入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶，40 ℃減壓濃縮，近干。氮?dú)獯蹈桑?.00 mL二氯甲烷定容，經(jīng)0.45 μm膜過濾后上機(jī)檢測。

1.2.3 樣品前處理（含皂化步驟）

稱取1～2 g試樣，加入1 g抗壞血酸，加50 mL水混勻，加入75 mL無水乙醇，搖勻，再加入25 mL 50%濃度的氫氧化鉀溶液，蓋上瓶塞。置于已預(yù)熱至（53±2）℃恒溫振蕩水浴箱中，皂化30 min。取出，靜置，冷卻至室溫。將試液轉(zhuǎn)入250 mL分液漏斗，加入50 mL萃取試劑，輕輕搖動，排氣，蓋好瓶塞，振搖3 min后靜置分層，重復(fù)萃取3次。合并有機(jī)相，用水洗至中性，棄去水相，有機(jī)相通過無水硫酸鈉去除水分，轉(zhuǎn)入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶，40 ℃減壓濃縮，近干。氮?dú)獯蹈桑?.00 mL二氯甲烷定容，經(jīng)0.45 μm膜過濾后上機(jī)檢測。

1.3 提取條件的優(yōu)化

（1）不同萃取劑、溫度、萃取次數(shù)對β-胡蘿卜素含量的影響。由同一人員，同一批次樣品，同一儀器，按1.2.2進(jìn)行樣品預(yù)處理，上機(jī)檢測，分別考察不同萃取劑[石油醚（沸點(diǎn)：30～60 ℃）、石油醚（沸點(diǎn)：60～90 ℃）、石油醚-丙酮（體積比為1∶1）、丙酮、正己烷和二氯甲烷]、不同提取溫度（25 ℃、40 ℃、55 ℃和70 ℃）、不同萃取次數(shù)（1次、2次、3次、4次和5次）對β-胡蘿卜素含量的影響。

（2）不同濃度的氫氧化鉀溶液對β-胡蘿卜素含量的影響。按1.2.3進(jìn)行樣品預(yù)處理，上機(jī)檢測，考察不同氫氧化鉀溶液濃度（0%、10%、30%、50%和70%）對β-胡蘿卜素含量的影響。

1.4 液相色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18液相色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），美國 Agilent；流動相：三氯甲烷∶乙腈∶甲醇=3∶12∶85，含抗壞血酸0.4 g·L-1，經(jīng)0.45 μm膜過濾后備用；流速：2.0 mL·min-1；檢測波長：450 nm；柱溫：35 ℃±1 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取條件優(yōu)化

2.1.1 萃取試劑的選擇

β-胡蘿卜素是類胡蘿卜素之一，屬于脂溶性維生素，易溶于石油醚、正己烷、二氯甲烷等有機(jī)溶劑。由表1可知，石油醚-丙酮（1∶1，V∶V）對樣品中β-胡蘿卜素的提取效率最高，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative Standard Deviation，RSD）也較小。

2.1.2 提取溫度選擇

由表2可知，試樣中的β-胡蘿卜素含量隨著溫度的升高而降低，當(dāng)溫度為25 ℃時，萃取效果最佳，因此選擇25 ℃為實驗提取溫度。

2.1.3 萃取次數(shù)的選擇

由表3可知，與萃取1次相比，萃取次數(shù)為3次、4次、5次時，試樣中β-胡蘿卜素的含量明顯提升，考慮到實驗時間，選擇萃取次數(shù)為3次進(jìn)行樣品前處理測定。

2.1.4 氫氧化鉀溶液濃度的影響

由表4可知，隨著氫氧化鉀體積分?jǐn)?shù)的增加，試樣中β-胡蘿卜素的含量會逐漸降低，當(dāng)添加70%體積分?jǐn)?shù)的氫氧化鉀溶液時，胡蘿卜素含量大幅下降，而不添加氫氧化鉀溶液時，試樣中的β-胡蘿卜素的含量最高。因此，選擇實驗過程不添加氫氧化鉀溶液，省去皂化步驟。

2.2 兩種不同前處理方法對β-胡蘿卜素檢測結(jié)果的影響

分別采用1.2.2（省去皂化步驟）與1.2.3（包含皂化步驟）進(jìn)行樣品前處理，選用相同萃取溶劑（石油醚-丙酮體積比為1∶1），對固體飲料、壓片糖果和軟糖進(jìn)行檢測。由表5可知，兩種前處理方法的穩(wěn)定性均良好，RSD均小于5%。雖然添加了抗壞血酸，但皂化的強(qiáng)堿性條件和55 ℃的皂化溫度使抗壞血酸加速氧化，抗氧化能力降低，從而造成皂化的檢測結(jié)果與回收率均低于不皂化的檢測結(jié)果。因此，針對固體飲料、壓片糖果、軟糖等類型β-胡蘿卜素主要來源于食品添加劑的樣品，不皂化的前處理方式優(yōu)于現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中的皂化處理方式。

2.3 檢測方法建立

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性及線性范圍

以β-胡蘿卜素標(biāo)液濃度（x）作為橫坐標(biāo)，以峰面積（y）作為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=1.000 1x-0.080 6，相關(guān)系數(shù)為0.999 5，結(jié)果表明β-胡蘿卜素在0.5～10.0 μg·mL-1時，線性關(guān)系良好。

2.3.2 方法精密度實驗

采用1.2.2步驟前處理方式處理樣品，平行測定6次，結(jié)果見表6。平行測定結(jié)果RSD均符合《合格評定 化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗證指南》（GB/T 27417—2017）中的精密度要求，表明方法精密度良好。

2.3.3 方法準(zhǔn)確度實驗

根據(jù)樣品中β-胡蘿卜素的含量，按0.5倍、1.0倍和2.0倍的量加入β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用不皂化前處理方法平行測定6次，計算回收率?；厥章式Y(jié)果見表7，結(jié)果顯示β-胡蘿卜素的平均加標(biāo)回收率在91.9%～99.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.14%～3.59%，滿足《合格評定 化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗證指南》（GB/T 27417—2017）中的對方法回收率偏差范圍的要求，說明方法的準(zhǔn)確度良好。

3 結(jié)論

對于β-胡蘿卜素以游離態(tài)存在的樣品，如固體飲料、糖果等，皂化處理不僅會造成樣品中β-胡蘿卜素含量的損失，還會延長實驗時間。本文考察了不同萃取劑、不同提取溫度、不同氫氧化鉀濃度、不同萃取次數(shù)對測試樣品中β-胡蘿卜素的影響，確定了加水分散溶解、石油醚-丙酮（體積比為1∶1）萃取、水洗、濃縮后復(fù)溶用高效液相色譜法測定β-胡蘿卜素的含量的方法，該方法樣品加標(biāo)平均回收率在91.9%～99.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.14%～3.59%。該方法相較于現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中胡蘿卜素的測定》（GB 5009.83—2016），更快速簡便，提取效率高，結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠，可用于固體飲料、糖果中β-胡蘿卜素的檢測。

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