食品中常用益生菌的檢測和鑒定技術研究進展

摘 要：隨著益生菌和人體共生關系研究的深入，菌種的快速發現、分離和篩選，以及益生菌產品質量的高效管控都有賴于檢測及鑒定技術的進步。本文綜述了表型、基因型等鑒定技術以及常用的定量檢測技術的研究進展。近年來，研究者們逐步將多種檢測技術結合應用，提供多維度的檢測方案，并進行相互驗證，推動了檢測技術向系統化、精準化、高效化以及低成本化的方向發展。本文為益生菌的日常檢測研究提供了參考和借鑒。

關鍵詞：益生菌；鑒定；定量檢測

Research Progress on Detection and Identification Technology of Commonly Used Probiotics in Food

Abstract： With the deepening of research on the symbiotic relationship between probiotics and the human body， the rapid discovery， isolation and screening of bacterial species， as well as the efficient control of the quality of probiotic products， all rely on the progress of detection and identification technologies. This article reviews the research progress of phenotypic and genotypic identification technologies and commonly used quantitative detection technologies. In recent years， researchers have gradually combined and applied a variety of detection technologies， provided multi-dimensional detection schemes， and conducted mutual verification， which has promoted the development of detection technology towards systematization， precision， efficiency and low cost. This article provides a reference for the daily detection research of probiotics.

Keywords： probiotic; identification; quantitative detection

1 益生菌的研究現狀

益生菌是對人體有益的微生物群體，能夠通過改善腸道菌群結構、增強免疫功能、降低血清膽固醇、改善肥胖、延緩衰老和抗腫瘤等方式對人體健康發揮積極作用[1]。近年來，隨著檢測技術的不斷更新，益生菌與人體健康的關系及其作用機制得到了深入研究。例如，“腸-腦軸”和“腸-肝軸”等作用機制[2]的研究表明，由腸道細菌產生的小分子代謝物進入大腦后，能改變腦細胞功能，從而影響人的情緒和認知。因此，新技術的發展為益生菌和宿主的關系及相互影響機制的研究提供了新的可能。目前，益生菌類產品多以復合益生菌及益生菌+益生元等形式出現[3-5]，菌種多樣性和基質復雜性成為益生菌檢測和鑒定面臨的新挑戰。

2 益生菌鑒定技術

細菌鑒定技術可用于食品中菌種的定性和溯源，對食品中益生菌質量控制和監管起重要作用。益生菌鑒定分為表型微生物鑒定方法和以基因組序列為基礎的基因型微生物鑒定法[6]。

2.1 表型微生物鑒定方法

傳統鑒定方法培養周期長，要用到很多生化試劑，且過程煩瑣，難以滿足快速檢測的需要。對于復合菌株而言，傳統鑒定方法難以鑒定相似種及亞種的菌株。傳統鑒定方法的優點是成本低，僅需要簡單的顯微鏡等基本設備即可完成檢測和鑒定，因此大多數鑒定方法都要基于平板培養的方法對菌株進行初步分離、培養和收集[7-9]。

從手工操作的生化鑒定系統（如梅里埃的API微生物鑒定系統），到各種自動化生物鑒定設備的出現（如Biolog公司設計的Biolog微生物鑒定系統），再到與質譜技術結合的基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜儀（Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF MS）技術的應用，檢測速度和效率較人工鑒定方法獲得了大幅度提升。例如，許再元[7]用生化鑒定系統鑒定雙歧桿菌發現，API鑒定系統只能在屬的水平上進行鑒定，在種水平上的鑒定則存在一定的局限，推測可能與雙歧桿菌生化反應的多變性有關。Biolog微生物鑒定系統6.01版的厭氧數據庫已收錄雙歧桿菌屬的29個標準菌種，占該屬總數的91%[10]，但對于相似菌株的鑒定還有待提升。

MALDI-TOF MS通過檢測微生物中能穩定表達的蛋白（如核糖體中的蛋白）來繪制特征指紋圖譜，將繪制出的特征指紋圖譜與數據庫中已知指紋圖譜進行比對，從而實現快速鑒定。范鐵男等[11]研究發現，對單一菌株進行MALDI-TOF MS鑒定僅需不到15 min，對實驗中的79株菌株進行鑒定則僅需約5 h，說明該技術適用于益生菌的高通量鑒定及篩選。

組成生物體的各種分子基團因其化學結構的不同，分子振動頻率也有所差異，從而導致吸收光譜和折射率譜不同。紅外光譜（Fourier Transform Infrared Spectrometer，FT-IR）技術和太赫茲時域光譜技術（Terahertz Time-Domain Spectroscopy，THz-TDS）[12]能夠在不損傷微生物的情況下，反映菌種DNA、RNA、多糖蛋白等分子的結構差異。這些技術可作為菌種鑒定的輔助方法，但目前在益生菌菌種鑒定中的應用較為少見。

酶聯免疫吸附測定（Enzyme-Linked ImmunoSorbent"Assay，ELISA）是一種免疫學和分子生物學中廣泛使用的實驗室技術。該技術基于抗原-抗體相互作用的原理，通過酶標記抗原并產生顯色反應，從而實現目標分子的定量檢測，主要用于檢測生物樣品中的特定蛋白質、肽、抗體或抗原。目前，該方法多用在臨床檢測[13-14]，在益生菌檢測方面的應用較少[15]。

2.2 基因型微生物鑒定法

2.2.1 聚合酶鏈式反應鑒定方法

聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）是在DNA聚合酶和引物的參與下，根據堿基互補配對原則進行DNA擴增的技術。對DNA進行擴增可得到高濃度的DNA分子，結合凝膠電泳和熒光信號等技術，如PCR-脈沖場凝膠電泳（PCR Pulsed Field Gel Electrophoresis，PCR-PFGE）、PCR-變形梯度凝膠電泳（PCR Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，PCR-DGGE）、熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR，qPCR）等，可對擴增的基因進行分離、鑒定和定量分析。

DNA的磷酸基團長度與電荷數相關，PCR-PFGE技術正是利用這一原理，將PCR擴增后的DNA分子置于電場加持下的無活性介質凝膠中，使含有不同電荷數的DNA分子因移動速度的不同而得到分離。對于10 kb以上的大分子DNA片段，PCR-PFGE技術也能進行有效分離。例如，在雙歧桿菌的鑒定中，DURANTI等[16]結合多種方法和PCR-PFGE技術，成功地區分了各個種屬的雙歧桿菌；?R?TKOVá等[17]研究發現，利用PFGE方法可以提高菌種的鑒定正確率。

PCR-DGGE技術是在PCR-PFGE技術的基礎上，在電泳過程中梯度增加DNA解鏈變性劑，使DNA分子上不同位點的堿基對逐漸解鏈，變成長短不等的DNA分子，進而因攜帶電荷數不同在凝膠板上進一步分離。因此，PCR-DGGE可以把同樣長度但序列不同的DNA片段區分開來。REQUENA等[18]對16S rDNA序列的保守區域進行了PCR擴增，并結合PCR-DGGE技術對糞便樣品中的雙歧桿菌進行了分離鑒定。

2.2.2 基因測序技術鑒定方法

基因測序技術以分子雜交技術為基礎，根據測序的位點，可以分為16S rRNA基因擴增子測序（16S rRNA技術）、多位點序列分析（Multilocus Sequence Analysis，MLSA）、全基因組測序等。根據測序效率，基因測序技術可分為第一代的Sanger測序技術和下一代的高通量測序技術。

16S rRNA是一種細菌和古菌中都具有的核糖體RNA片段，因此常用于細菌系統發育樹研究和分類鑒定[19]。16S rRNA基因不僅包含了菌種間基因表達相同的保守區，也包含了菌種間基因表達特異的高變區。16S rRNA的保守區可用于設計通用型引物；高變區常用于高通量測序以設計特異性擴增引物，通過與數據庫中已知序列進行比對，可將雙歧桿菌準確鑒定到種的水平，菌種的鑒定匹配率為99%～100%。段文鋒等[9]從市場中常見的19例益生菌乳粉中分離得到28株雙歧桿菌，利用16S rRNA技術對28株雙歧桿菌進行了菌株鑒定，建立了基于雙歧桿菌基因組序列的分子鑒定方法。然而，16S rRNA技術對于親緣關系比較近的菌種分辨率不高[20]。

MLSA是將基因序列進行串聯，增加有效信息位點數量，對難以區分的相似菌群進行鑒定的技術[21-22]。該技術常被用來研究物種間的遺傳和變異關系。江建平等[23]挑選12株可用于食品的雙歧桿菌，對7種管家基因的序列進行系統發育樹分析，結果顯示，采用MLSA技術得到的串聯系統發育樹與16S rDNA系統發育樹結果一致，由于部分管家基因相比保守的16s rRNA有更高的分化程度，MLSA具有更高的分辨率。

高通量測序技術（Next Generation Sequencing，NGS）是在Sanger測序技術[24]基礎上發展起來的新一代基因測序技術，能同時測定大量核酸分子的序列，彌補了Sanger測序技術在檢測效率方面的不足[25]。例如，多位點序列分型技術（Multilocus Sequence"Typing，MLST）依賴于物種全基因組序列數據庫和多位點序列分型數據庫的豐富物種信息[26]，而NGS可快速豐富相關基因數據庫的信息。再如，在益生菌鑒定中，NGS技術通過DNA提取、片段化、擴增等操作實現全基因組測序，提高了物種特異性引物的設計效率[27-28]。因此，NGS可廣泛應用于生物種群的分類研究[28-29]、特異性引物的制備及益生菌產品的合規性判斷[30]。陳衛等[31]提出了一種基于高通量測序的雙歧桿菌快速檢測方法，該方法以groEL基因為篩選標記，采用NGS技術1 d內可快速批量處理菌株信息，無須用傳統的生化分析法即可在亞種水平上對復雜樣品中的雙歧桿菌進行全面鑒定，分辨率高于16S rRNA技術，對菌種和亞種的鑒定準確率達100%。

3 益生菌的定量檢測方法

益生菌的傳統定量檢測方法有平板計數法和流式細胞計數法，目前新型的檢測方法多為基因層面的分子生物學檢測方法，如PCR方法及其衍生出的相關方法。

3.1 平板計數法

在采用平板計數法定量檢測乳酸菌和雙歧桿菌時，培養基的選擇是影響菌種鑒定及準確定量的重要因素。《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》（GB 4789.35—2023）中提到，乳酸菌主要為乳桿菌屬、雙歧桿菌屬和嗜熱鏈球菌。對于嗜熱鏈球菌的計數，國際標準和相關文獻多推薦采用M17培養基來代替國家標準中的MC培養基[32-33]。ISO 7889：2003[34]中規定，用酸化MRS培養基對德氏乳桿菌保加利亞亞種進行分離計數，但該方法僅適用于發酵乳中只含有嗜熱鏈球菌和德氏乳桿菌保加利亞亞種的樣本，不具有普遍性。平板計數法只能在屬的層面進行計數，對于復合益生菌的分別計數具有局限性。

3.2 流式細胞計數法

流式細胞術利用氣壓使含有核酸熒光染料的細胞溶液從噴嘴噴出，形成單列細胞的液柱，同時利用激光技術讀取熒光值，最后采用數字處理系統自動計數[35-36]。熒光染料只能穿過破損的細胞膜，不能進入完整的細胞膜，因此流式細胞術可對活細胞和死細胞分別計數[37-38]。與平板計數法相比，流式細胞術在計數的基礎上多了篩選活細胞這一優勢，但是仍然做不到對復合菌株的分開計數。近年來，流式細胞計數法在益生菌定量檢測領域應用的研究較少，可能是因為對不同菌種甚至菌株篩選特異性染料的難度較大。

3.3 PCR及其衍生技術

PCR是一種常用的基因片段指數擴增方法，先借基因測序技術獲得高特異性和可靠的引物和探針，可對不同菌株分開計數。目前，PCR定量檢測技術是發展和應用的重點。

3.3.1 熒光定量PCR

熒光定量PCR（Quantitative Real-time，qPCR）技術是在PCR反應體系中加入熒光基團，根據擴增產物發出的熒光強度與擴增次數的關系曲線，來計算原溶液中目標菌株的含量。DESFOSSéS-FOUCAULT等[39]用qPCR法定量檢測奶酪中復合益生菌的含量，研究發現在6個稀釋度的范圍內，所有菌種的qPCR引物的擴增效率均在99.4%～101.9%，菌種標準曲線R2值均大于0.99。

（1）TaqMAN探針熒光定量PCR。TaqMAN探針是一種同時攜帶熒光基團和猝滅集團的特異性寡核苷酸，在PCR反應體系中用于與目標DNA序列的互補配對。隨著反應的進行，與目標DNA配對的TaqMAN探針會釋放出熒光信號，根據探針濃度與熒光信號的強弱關系，可對目標基因進行定量檢測。TaqMAN-qPCR技術可以在同一反應體系內完成對多種目標基因的檢測。在益生菌的定量檢測方面，趙一蘋等[40]使用TaqMan-小溝結合物探針（Minor Groove Binder，MGB）結合熒光定量PCR對酸奶制品中動物雙歧桿菌BB-12進行定量檢測，靈敏度低至0.05 pg·mL-1。王虹等[41]采用TaqMAN-qPCR對腸道菌群樣品中3類細菌數量和細菌總量分別進行了計數。雖然TaqMAN-qPCR僅能在科和屬的層面進行定量，但該技術能同時定量檢測多種益生菌，對食品行業日常檢測效率的提升具有參考意義。

（2）疊氮溴化丙錠（Propidium Monoazide，PMA）熒光定量PCR。PMA是一種與DNA有高親和力的染料，能進入死亡或外膜嚴重損傷的細胞內，在可見光的參與下，與DNA發生交聯反應產生熒光信號，并抑制死細胞中DNA參與PCR擴增。因此，PMA-qPCR不僅可以判斷細胞膜受損的死菌的濃度，還可以結合qPCR測出活菌的濃度。韓之皓等[42]研究發現，PMA質量濃度為40 μg·mL-1，暗孵育時間為10 min，曝光時間為20 min時，PMA既不影響活菌DNA的PCR擴增，又能滲透進入細胞膜受損的死菌并抑制其PCR擴增，最低檢測限為103 CFU·mL-1。DESFOSSéS-FOUCAULT等[39]研究發現，與傳統平板計數法相比，PMA-qPCR的定量檢測結果更準確。

3.3.2 數字PCR

數字PCR（Digital PCR，dPCR）技術被認為是第3代核酸擴增技術，通過將一個樣本分成幾十到幾萬份，并分配到不同的反應單元，每個單元DNA分子的數量為1或0，基于單分子PCR實現核酸的絕對定量。與qPCR相比，dPCR不需要標準曲線，準確度更高。

微滴式數字PCR（Droplet Digital PCR，ddPCR）是將稀釋到一定濃度的DNA分子分配到10 000～20 000個微滴中，通過PCR擴增和陽性信號的累積，讀取陽性反應單元數和陰陽性單元的比例，根據泊松分布計算出樣本中的DNA分子數。李恩靜等[43]應用ddPCR技術準確定量了7種雙歧桿菌菌株，計數過程沒有被10種近源乳桿菌及嗜熱鏈球菌干擾。該方法與平板計數的結果相差不超過0.5 lgCFU·g-1，偏差小于10%，方法定量限為10-6 CFU·g-1，實驗樣品檢出值為106 CFU·g-1，可滿足日常菌種含量測試的要求。

3.3.3 環介導等溫擴增

環介導等溫擴增（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）是一種類似于PCR的目標基因擴增方法，一般用于定性檢測。通過實時濁度檢測儀檢測LAMP反應過程中產生的焦磷酸鎂沉淀的濁度，結合標準曲線可實現定量檢測。范一靈等[44]采用該方法在60 min內完成了雙歧桿菌屬細菌的DNA檢測，檢測限為（16.1±8.2）pg·μL-1，對雙歧桿菌屬細菌菌體的檢測限為0.1 CFU·mL-1。然而，LAMP一次只能檢測一種基因，因此在物種準確鑒定、目標基因制備成本控制、標準曲線準確度提升等方面仍需改進，以便更廣泛地應用于日常檢測。

4 結語

綜上所述，明確各種鑒定技術的特點和優勢，結合多種檢測技術，提供多維度的檢測方案并進行相互驗證，可推動檢測技術向系統化、精準化、高效化和低成本化方向發展。隨著技術的進步，益生菌檢測時面臨的菌種多樣性和基質復雜性等問題，有望得到靈活有效的解決。

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