過(guò)表達(dá)SLC7A5 基因?qū)Υ笫舐殉差w粒細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制

［摘 要］ 目的：探討過(guò)表達(dá)溶質(zhì)載體家族7成員5（SLC7A5） 基因?qū)Υ笫舐殉差w粒細(xì)胞凋亡的影響，并闡明其相關(guān)機(jī)制。方法：4只3周齡SPF級(jí)SD雌性大鼠，提取原代大鼠卵巢顆粒細(xì)胞，分為陰性對(duì)照組（NC 組） 和促卵泡激素受體（FSHR） 染色組（FSHR 組）。免疫熒光染色法觀察大鼠卵巢顆粒細(xì)胞中FSHR 蛋白表達(dá)情況，鑒定原代大鼠卵巢顆粒細(xì)胞是否成功分離。將大鼠卵巢顆粒細(xì)胞分為對(duì)照組（轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒） 和OE-SLC7A5 組（轉(zhuǎn)染SLC7A5 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒）， 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR （RT-qPCR） 法和Western blotting 法驗(yàn)證細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)2 組卵巢顆粒細(xì)胞凋亡率，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)2 組不同細(xì)胞周期卵巢顆粒細(xì)胞百分率，RT-qPCR 法檢測(cè)2 組卵巢顆粒細(xì)胞中SLC7A5、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶（Caspase）-3、Caspase-8 和腫瘤壞死因子α （TNF-α） mRNA 表達(dá)水平，Western blotting法檢測(cè)2組卵巢顆粒細(xì)胞中SLC7A5、Caspase-3、cleaved Caspase-3、Caspase-8、cleaved Caspase-8和 TNF-α蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：熒光顯微鏡下卵巢顆粒細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形或者不規(guī)則形，特異性表達(dá)FSHR，NC 組未見(jiàn)FSHR 綠色熒光表達(dá)，F(xiàn)SHR 組可見(jiàn)FSHR 綠色熒光表達(dá)，提示大鼠原代卵巢顆粒細(xì)胞成功分離。與對(duì)照組比較，OE-SLC7A5 組卵巢顆粒細(xì)胞中SLC7A5 mRNA 和蛋白表達(dá)水平均明顯升高（Plt;0. 05），提示SLC7A5 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染卵巢顆粒細(xì)胞。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，與對(duì)照組比較，OE-SLC7A5 組細(xì)胞凋亡率明顯升高（Plt;0. 05）。與對(duì)照組比較，OE-SLC7A5 組S 期卵巢顆粒細(xì)胞百分率明顯降低（Plt;0. 05）。RT-qPCR 法檢測(cè)，與對(duì)照組比較，OE-SLC7A5 組卵巢顆粒細(xì)胞中TNF- α、Caspase-3 和Caspase-8 mRNA 表達(dá)水平均明顯升高（Plt;0. 05）。Westernblotting 法檢測(cè)，與對(duì)照組比較，OE-SLC7A5 組卵巢顆粒細(xì)胞中TNF-α、Caspase-8、cleaved Caspase-8、Caspase-3、cleaved Caspase-3和SLC7A5蛋白表達(dá)水平均明顯升高 （Plt;0. 05）。結(jié)論：SLC7A5蛋白表達(dá)增加能夠通過(guò)上調(diào)TNF-α、Caspase-8 和Caspase-3 凋亡通路表達(dá)，促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡。

［關(guān)鍵詞］ 溶質(zhì)載體家族7 成員5； 大鼠卵巢顆粒細(xì)胞； 細(xì)胞凋亡； 腫瘤壞死因子α； 含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶3； 含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶8

［中圖分類(lèi)號(hào)］ R711. 75 ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A

溶質(zhì)載體家族7 成員5 （solute carrier family 7member 5，SLC7A5） 基因定位于人16 號(hào)染色體，其編碼產(chǎn)物為L(zhǎng) 型氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1 （L-type aminoacid transporter 1， LAT1）， 主要功能是轉(zhuǎn)運(yùn)特定氨基酸，為細(xì)胞的生長(zhǎng)提供原料［1-2］。不同組織和細(xì)胞中SLC7A5 蛋白表達(dá)水平不同，如在大腦、睪丸、卵巢和胎盤(pán)等組織中SLC7A5 蛋白高表達(dá)，而在肺、心臟和肝臟等組織中SLC7A5 蛋白表達(dá)水平較低［3］。研究［4］ 顯示： SLC7A5 蛋白在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，提示其對(duì)腫瘤的快速生長(zhǎng)和增殖可能起著重要的作用， 包括乳腺癌［5］、卵巢癌［6］ 和子宮內(nèi)膜癌［7］ 等女性常見(jiàn)的癌癥。SLC7A5 不僅與癌癥的預(yù)后不良有關(guān)， 還與化療耐藥有密切關(guān)聯(lián)。此外，SLC7A5 在胰島素抵抗、炎癥反應(yīng)和神經(jīng)系統(tǒng)疾病中也發(fā)揮重要作用［8］。本課題組前期研究［9］ 結(jié)果顯示： 來(lái)曲唑誘導(dǎo)的多囊卵巢綜合征（polycystic ovary syndrome，PCOS） 模型大鼠卵巢組織中SLC7A5 mRNA 表達(dá)水平明顯升高， 提示SLC7A5 可能在PCOS 的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮一定的作用。但SLC7A5 在卵巢組織中的功能尚未完全闡明。卵巢顆粒細(xì)胞作為卵巢內(nèi)重要的類(lèi)固醇激素合成細(xì)胞，在卵泡的發(fā)育及成熟過(guò)程中發(fā)揮重要作用［10］。SLC7A5 在顆粒細(xì)胞中的功能尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究探討SLC7A5 對(duì)大鼠卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的影響，并闡明其具體的作用機(jī)制，為研究SLC7A5 在PCOS中的病理機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器 4只3周齡SPF級(jí)SD 雌性大鼠，體質(zhì)量約50 g，購(gòu)于遼寧長(zhǎng)生生物有限公司，飼養(yǎng)于吉林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)： SYXK （吉） 2018-0001。血促性素購(gòu)于寧波第二激素廠， DMEM/F12 培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline， PBS） 和胎牛血清（fetal bovine serum， FBS） 均購(gòu)于美國(guó)Hyclone 公 司，兔 抗 促 卵 泡 激 素 受 體（folliclestimulatinghormone receptor， FSHR） 多克隆抗體、異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanateisomer，F(xiàn)ITC） 標(biāo)記山羊抗兔抗體、鼠抗甘油醛-3- 磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH） 抗體、羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗、兔抗含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白酶（cysteinyl aspartate specific proteinase， Caspase）-3抗體和兔抗Caspase-8 抗體購(gòu)于上海Bioworld 分公司，pcDNA3. 1 質(zhì)粒、SLC7A5 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒和大腸桿菌菌株DH5A 購(gòu)于生工生物工程（上海） 股份有限公司，無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒購(gòu)于北京天根生化科技有限公司，F(xiàn)uGENE HD 轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)于瑞士Roche 公司， 細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒和Annexin Ⅴ-FITC 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)股份有限公司，兔抗SLC7A5抗體購(gòu)于美國(guó)INVITROGEN 公司， 兔抗cleaved Caspase-8抗體購(gòu)于美國(guó)Affinity Biosciences 公司， 兔抗cleaved Caspase-3 抗 體 購(gòu) 于 美 國(guó) Cell SignalingTechnology 公 司。 3500P 實(shí) 時(shí) 熒 光 定 量 PCR（real-time fluorescence quantitative PCR， RT-qPCR）儀（型號(hào)：MX3005P） 購(gòu)于美國(guó)安捷倫科技有限公司， 微量紫外分光光度儀（型號(hào)： NANODROP2000） 購(gòu)于美國(guó)Thermo 公司， 酶標(biāo)儀（型號(hào)：EON） 購(gòu)于美國(guó)BIOTEX 公司， 流式細(xì)胞分析儀（型號(hào)： CYTOFLEX LX） 購(gòu)于美國(guó)BECKMAN公司。

1. 2 大鼠卵巢原代顆粒細(xì)胞分離和培養(yǎng) 4只3周齡SPF 級(jí)SD 雌性大鼠，體質(zhì)量約50 g，適應(yīng)性喂養(yǎng)2 d，腹腔注射血促性素50 IU，48 h 后處死。采用75% 乙醇溶液徹底消毒， 后置于超凈臺(tái)， 逐層剪開(kāi)大鼠腹部皮膚和腹膜，找到雙側(cè)卵巢，分離卵巢表面被覆筋膜及脂肪組織， PBS 緩沖液沖洗3 次，后置入DMEM/F12 培養(yǎng)基中。在顯微鏡下，使用1 mL 注射器針頭充分刺破卵泡， 加入適量0. 25% 胰蛋白酶，置入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中徹底消化，間隔10 min 從培養(yǎng)箱取出，用移液槍反復(fù)吹打。20 min 后利用顯微鏡觀察顆粒細(xì)胞形成單個(gè)細(xì)胞時(shí)， 加入含F(xiàn)BS 的培養(yǎng)液終止消化。將上述組織細(xì)胞液通過(guò)100 μm 細(xì)胞篩過(guò)濾收集細(xì)胞懸液，離心后棄上清。加入含10% FBS 和1% 雙抗的DMEM/F12 培養(yǎng)基，顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞后接種于相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)板中［11］，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1. 3 免疫熒光染色法觀察大鼠卵巢顆粒細(xì)胞中FSHR蛋白表達(dá)情況 取大鼠卵巢顆粒細(xì)胞，分為陰性對(duì)照組（NC 組）和FSHR 染色組（FSHR 組）。將卵巢顆粒細(xì)胞接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，于細(xì)胞生長(zhǎng)密度為70%～80% 時(shí)，PBS 緩沖液洗滌3 次，每次5 min。預(yù)冷的冰甲醇室溫固定20 min，PBS 緩沖液洗滌3 次，隨后加入0. 1% TritonX-100，室溫放置10 min，PBS 緩沖液洗滌3 次。加入1% BSA， 室溫放置10 min， 棄去封閉液， 加入FSHR 一抗，4 ℃孵育過(guò)夜。次日，棄去一抗，PBS 緩沖液洗滌3 次；加入FITC 標(biāo)記山羊抗兔二抗，室溫避光孵育2 h；棄去二抗，PBS 緩沖液洗滌3 次；加入PI 避光放置10 min，PBS 緩沖液洗滌3 次；95% 甘油封片后，顯微鏡下觀察2 組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞中FSHR蛋白表達(dá)情況并拍照。FSHR 蛋白為顆粒細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白，F(xiàn)SHR 陽(yáng)性染色定位于細(xì)胞質(zhì)，呈綠色熒光，細(xì)胞核呈紅色熒光。顯微鏡下見(jiàn)FSHR 綠色熒光即成功分離大鼠原代卵巢顆粒細(xì)胞［12］。

1. 4 SLC7A5過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增 載體質(zhì)粒擴(kuò)增：取1. 5 mL EP 管，加入30 mg·L－1質(zhì)粒2 μL，再加入50 μL 菌株，混勻置于冰上30 min。后置于42 ℃ 環(huán)境中90 s， 之后立即取出置于冰上2 min。加入1 mL LB 液體培養(yǎng)基，37 ℃、200 r·min－1 震蕩1～2 h。10 000 g 離心5 min，棄上清，留約200 μL，吹打細(xì)菌，于超凈臺(tái)內(nèi)涂板，37 ℃正置培養(yǎng)1 h 后倒置過(guò)夜。次日，挑取單克隆菌落，放入5 mL 液體培養(yǎng)基中搖菌，之后再轉(zhuǎn)移至200 mL 培養(yǎng)基中搖菌過(guò)夜。

質(zhì)粒提取： 按照無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。向吸附柱中加入2. 5 mL 平衡液，8 000 r·min－1 離心2 min，棄濾液。取200 mL 菌液于無(wú)菌的離心管中，4 ℃、8 000 r·min－1離心20 min，去上清。加入10 mL P1溶液，震蕩離心。加入10 mLP2 溶液，輕柔翻轉(zhuǎn)6～8 次，靜置5 min。加入10 mLP4 溶液， 翻轉(zhuǎn)6～8 次， 靜置10 min 后， 4 ℃ 、8 000 r·min－1 離心15 min。倒入過(guò)濾器中。50 mL離心管收集濾液，加入0. 3 倍體積的異丙醇，混勻后轉(zhuǎn)移到平衡后的吸附柱中。4 ℃、8 000 r·min-1多 次 離 心，每 次 2 min。加 入 10 mL 漂 洗 液，4 ℃ 、8 000 r·min-1離心2 min，棄濾液，重復(fù)1 次加入3 mL的無(wú)水乙醇，4 ℃、8 000 r·min-1離心2 min。棄濾液，將吸附柱放回收集管中，4 ℃、8 000 r·min-1離心5 min。吸附柱開(kāi)蓋放置5 min。將吸附柱置于新的收集管中，加入1 mL ddH2O。室溫放置5 min，4 ℃、8 000 r·min-1 離心5 min，收集質(zhì)粒，檢測(cè)質(zhì)粒測(cè)濃度和純度，適量分裝，-20 ℃保存。

1. 5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組 實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組 （轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒） 和SLC7A5 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒組（OESLC7A5組， 轉(zhuǎn)染SLC7A5 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒）。將顆粒細(xì)胞接種至適量完全培養(yǎng)基的6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，使轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞密度為50%～60%。每孔取120 μL的opti-MEM 培養(yǎng)基， 加入3 μg 質(zhì)粒， 輕輕混勻；向上述液體中加入每孔6 μL FuGENE 轉(zhuǎn)染試劑，輕輕吹打混勻，室溫靜置孵育10 min；再將上述混合液加入每孔含1 874 μL 無(wú)抗生素培養(yǎng)基的6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，輕輕混勻。將細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h。細(xì)胞轉(zhuǎn)染24～48 h 后，采用RT-qPCR 法和Western blotting 法驗(yàn)證細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率。

1. 6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 2 組卵巢顆粒細(xì)胞凋亡率 按照Annexin Ⅴ-FITC 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。細(xì)胞接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，處理后， PBS 緩沖液沖洗細(xì)胞， 加入胰酶， 觀察細(xì)胞為單個(gè)細(xì)胞后終止消化。細(xì)胞懸液收集至離心管中，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，加入PBS 緩沖液重懸細(xì)胞；1 000 r·min-1離心5 min，棄上清；加入195 μL Annexin Ⅴ-FITC 結(jié)合液、5 μL Annexin Ⅴ-FITC 和10 μL 碘化丙啶（propidium iodide，PI） 染色液， 輕輕混勻； 室溫避光孵育15 min；隨后冰浴避光存放，1 h 內(nèi)放入流式細(xì)胞儀中檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。FITC （+） 和PI （-） 為早期凋亡細(xì)胞；FITC （+） 和PI （+） 為晚期凋亡細(xì)胞。細(xì)胞凋亡率= （早期凋亡細(xì)胞數(shù)+晚期凋亡細(xì)胞數(shù)） /細(xì)胞總數(shù)×100%。

1. 7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 2 組不同細(xì)胞周期卵巢顆粒細(xì)胞百分率 根據(jù)細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。卵巢顆粒細(xì)胞接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。處理后，PBS 緩沖液沖洗細(xì)胞，放入適量的胰酶，觀察細(xì)胞成單個(gè)細(xì)胞后終止消化，細(xì)胞懸液收集到離心管中，1 000 r·min-1 離心5 min，棄上清，加入PBS 緩沖液重懸細(xì)胞，重復(fù)1 次；加入預(yù)冷的70% 乙醇溶液吹打混勻， 4 ℃ 放置12～24 h ；1 000 r·min-1 離心5 min， 棄上清， 加入PBS 緩沖液重懸細(xì)胞， 重復(fù)1 次； 每管細(xì)胞中加入0. 5 mLPI 染色液，重懸細(xì)胞，37 ℃避光溫浴30 min。隨后冰浴避光存放。24 h 內(nèi)放入流式細(xì)胞儀中檢測(cè)2 組不同細(xì)胞周期卵巢顆粒細(xì)胞百分率。

1. 8 RT-qPCR 法 檢 測(cè) 2 組 卵 巢 顆 粒 細(xì) 胞 中SLC7A5、Caspase-3、Caspase-8 和腫瘤壞死因子 α（tumor necrosis factor-α，TNF-α） mRNA表達(dá)水平 棄去原有培養(yǎng)液，加入TRIzol 裂解液，吹打后靜置5 min；細(xì)胞裂解液收集至RNases Free EP 管中，加入三氯甲烷充分振蕩，靜置2 min，12 000 g 離心3 min；收集上層的溶液至新的EP 管中，加入等體積96% 乙醇溶液， 混勻； 轉(zhuǎn)移至核酸吸附柱中，12 000 g 離心1 min； 棄濾液， 加入0. 4 mL 3M 乙酸鈉， 12 000 g 離心1 min； 棄濾液， 加入0. 4 mL75% 乙醇， 12 000 g 離心1 min ； 重復(fù)上步操作1 次；棄濾液，12 000 g 離心2 min；棄濾液，開(kāi)蓋室溫干燥2 min；將核酸吸附柱放入新的RNases FreeEP 管 中，加 入30～50 μL DEPC 水，靜 置 2 min；12 000 g 離心2 min。采用微量紫外分光光度儀檢測(cè)RNA 濃度和純度。采用5X All-In-One RTMaster Mix 反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并檢測(cè)其濃度和完整性。RT-qPCR 反應(yīng)體系：SYBR Mix 10 μL， 10 μmol·L-1 上游引物0. 5 μL，10 μmol·L-1 下游引物0. 5 μL， RNase-Free H2O5 μL， cDNA 4 μL。置入熒光定量PCR 儀中， 按步驟設(shè)置程序。引物序列： GAPDH F 5'-CAAGTTCAACGGCACA-3'， GAPDH R 5'-CAGTAGACTCCACGACAT-3'； SLC7A5 F 5'-CTCTGCGTGCTACTACTC-3'， SLC7A5 R 5'-TTGTCCTATGTCCTTTCCC-3'； Caspase-3 F 5'-GCGATGACTCAGCACCTCCATG-3'， Caspase-3 R 5'-GCGATGACTCAGCACCTCCATG-3'； Caspase-8F 5'-ACTCGGCGACAGGTTACAGC-3'， Caspase-8R 5'-AGGGCAGCCAGTTCTTCGTT-3'； TNF- αF 5'-CCACCACGCTCTTCTGTCTACTG-3'，TNF- α R 5'-GGGCTACGGGCTTG TCACTC-3'。以GAPDH 為內(nèi)參， 采用2—ΔΔCt 法計(jì)算目的基因表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1. 9 Western blotting法檢測(cè) 2組卵巢顆粒細(xì)胞中SLC7A5、Caspase-3、cleaved Caspase-3、Caspase-8、cleaved Caspase-8 和 TNF-α 蛋白表達(dá)水平 去除原有細(xì)胞培養(yǎng)基，加入胰酶消化，收集至EP 管中，2 000 r·min-1 離心5 min。棄上清， 加入細(xì)胞裂解液，振蕩混勻。4 ℃、靜置5 min，取出振蕩，重復(fù)3 次。4 ℃、12 000 g 離心15 min。采用BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。蛋白樣品95 ℃變性10 min。加入SDS-PAGE 膠加樣孔內(nèi)。電泳時(shí)，60 V 恒壓電泳40 min 后， 120 V、1. 5 h。采用半干轉(zhuǎn)膜儀恒壓轉(zhuǎn)膜，放入5% BSA 封閉液中，室溫封閉60～120 min 。分別采用抗TNF- α 抗體（1∶ 1 000）、抗Caspase-3 抗體（1∶ 2 000）、抗cleaved Caspase-3 抗體（1∶ 500）、抗Caspase-8 抗體（1∶ 2 000）、抗cleaved Caspase-8 （1∶ 1 000）和抗GAPDH 抗體（1∶ 5 000） 于4 ℃ 孵育過(guò)夜。TBST 溶液洗滌8 min，重復(fù)4 次。加入HRP 標(biāo)記的羊抗兔或羊抗鼠抗體（1∶2 000） 室溫避光孵育60 min。TBST 溶液洗滌8 min， 重復(fù)4 次。使用Tanon 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀進(jìn)行蛋白檢測(cè)。采用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH 作為內(nèi)參蛋白，計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參蛋白條帶灰度值。

1. 10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 23. 0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。2 組卵巢顆粒細(xì)胞凋亡率、S 期卵巢顆粒細(xì)胞百分率、卵巢顆粒細(xì)胞中細(xì)胞凋亡相關(guān)基因mRNA 表達(dá)水平和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平均符合正態(tài)分布且方差齊，以x±s 表示，2 組間樣本均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)。以Plt;0. 05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2. 1 原代大鼠卵巢顆粒細(xì)胞中 FSHR 蛋白表達(dá)情況 熒光顯微鏡下觀察，卵巢顆粒細(xì)胞鏡下呈長(zhǎng)梭形或者不規(guī)則形，特異性表達(dá)FSHR，NC 組未見(jiàn)FSHR 綠色熒光表達(dá)，F(xiàn)SHR 組可見(jiàn)FSHR 綠色熒光表達(dá)，提示大鼠原代卵巢顆粒細(xì)胞成功分離。見(jiàn)圖1。

2. 2 SLC7A5過(guò)表達(dá)質(zhì)粒細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率驗(yàn)證 與對(duì) 照 組（1. 00 ± 0. 26 和 0. 51 ± 0. 24） 比 較，OE-SLC7A5 組卵巢顆粒細(xì)胞中SLC7A5 mRNA 和蛋白表達(dá)水平（361. 81±176. 30 和2. 16±1. 26）均明顯升高（Plt;0. 05）， 提示SLC7A5 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染卵巢顆粒細(xì)胞。見(jiàn)圖2。

2. 3 2 組 卵 巢 顆 粒 細(xì) 胞 凋 亡 率 與 對(duì) 照 組（16. 59%±1. 96%） 比較， OE-SLC7A5 組細(xì)胞凋亡率（50. 07%±6. 66%） 明顯升高（Plt;0. 05）。見(jiàn)圖3。

2. 4 2組不同細(xì)胞周期卵巢顆粒細(xì)胞百分率 與對(duì)照組（11. 94%±0. 02%） 比較，OE-SLC7A5 組S 期卵巢顆粒細(xì)胞百分率（10. 17%±0. 53%） 明顯降低（Plt;0. 05）。見(jiàn)圖4。

2. 5 2 組卵巢顆粒細(xì)胞中凋亡相關(guān)基因 mRNA表 達(dá)水平 與對(duì)照組比較，OE-SLC7A5 組卵巢顆粒細(xì)胞中凋亡相關(guān)基因TNF- α、Caspase-3 和Caspase-8 mRNA 表達(dá)水平均明顯升高（Plt;0. 05）。見(jiàn)表1。

2. 6 2組卵巢顆粒細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平 與對(duì)照組比較，OE-SLC7A5 組卵巢顆粒細(xì)胞中凋 亡 相 關(guān) 蛋 白 TNF- α、 Caspase-8、 cleavedCaspase-8、Caspase-3、cleaved Caspase-3 和SLC7A5 蛋白表達(dá)水平均明顯升高（Plt;0. 05）。見(jiàn)圖5 和表2。

3 討 論

本課題組前期研究［13］ 結(jié)果顯示： 大鼠PCOS模型卵巢中SLC7A5 表達(dá)明顯增加，提示SLC7A5可能在PCOS 發(fā)生發(fā)展中具有重要作用， 然而SLC7A5 在卵巢中的相關(guān)作用尚未完全闡明。因此，本研究通過(guò)一系列體外實(shí)驗(yàn)探討過(guò)表達(dá)SLC7A5 對(duì)卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的影響。

細(xì)胞凋亡不僅參與調(diào)節(jié)和選擇人類(lèi)原始卵泡池中的卵子，也被認(rèn)為是卵泡閉鎖的機(jī)制和人卵巢中卵泡周期性生長(zhǎng)及消退的基礎(chǔ)［14-15］。在卵泡發(fā)育的早期階段，閉鎖是由卵母細(xì)胞和周?chē)w粒細(xì)胞凋亡共同引起的。而成熟卵泡的閉鎖則以顆粒細(xì)胞凋亡為主［16］。研究［17-18］ 顯示：顆粒細(xì)胞的異常凋亡可能是PCOS 中卵泡異常發(fā)育的原因之一。因此，本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)過(guò)表達(dá)SLC7A5 對(duì)顆粒細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響，結(jié)果顯示：過(guò)表達(dá)SLC7A5 能夠促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡。因此，SLC7A5可能通過(guò)影響顆粒細(xì)胞的凋亡，影響卵泡發(fā)育和成熟障礙，進(jìn)而促進(jìn)PCOS 的發(fā)生。

本研究結(jié)果顯示：過(guò)表達(dá)SLC7A5 后，顆粒細(xì)胞中凋亡相關(guān)基因TNF-α、Caspase-3 和Caspase-8mRNA 及蛋白表達(dá)水平均明顯升高。研究［19-20］ 顯示： TNF-α 參與調(diào)節(jié)卵巢的多種生理過(guò)程， 對(duì)細(xì)胞增殖、分化、卵泡成熟、類(lèi)固醇生成和細(xì)胞凋亡均有一定的影響。一般情況下，細(xì)胞凋亡是通過(guò)死亡受體和線(xiàn)粒體2 種介導(dǎo)方式實(shí)現(xiàn)的［21］。研究［22-23］發(fā)現(xiàn)：TNF-α 可以通過(guò)死亡受體途徑促進(jìn)細(xì)胞凋亡。當(dāng)TNF-α 表達(dá)和生成增加時(shí)，TNF-α 受體與腫瘤壞死因子受體相關(guān)死亡域蛋白結(jié)合， 激活下游的Caspase-8， 觸發(fā)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)， 進(jìn)而激活其下游的凋亡因子Caspase-3［24-25］。激活的Caspase-3 能夠活化內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶，阻礙細(xì)胞DNA 修復(fù)并啟動(dòng)受損的DNA 降解， 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［26］。因此，顆粒細(xì)胞過(guò)表達(dá)SLC7A5 可能通過(guò)激活TNF- α/Caspase-8/Caspase-3 凋亡通路促進(jìn)顆粒細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示： cleaved Caspase-8 和 cleavedCaspase-3 蛋白表達(dá)水平均明顯升高，進(jìn)一步證實(shí)了SLC7A5 通過(guò)激活Caspase-8 和Caspase-3 促進(jìn)細(xì)胞凋亡。研究［27-28］ 顯示： Fas/Fas 配體/Caspase-8 通路在DHEA 誘導(dǎo)的PCOS 大鼠卵巢閉鎖卵泡內(nèi)的顆粒細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用。LIU 等［29］ 發(fā)現(xiàn)：PCOS患者顆粒細(xì)胞凋亡明顯增加，并伴有Caspase-3 表達(dá)增加，與本研究結(jié)果相似。

綜上所述，SLC7A5 蛋白表達(dá)增加可能通過(guò)上調(diào)TNF- α、Caspase-8 和Caspase-3 凋亡通路表達(dá)，促進(jìn)顆粒細(xì)胞的凋亡， 本研究結(jié)果為SLC7A5 在PCOS 中病理機(jī)制的探討提供了新的理論依據(jù)。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：張京順參與實(shí)驗(yàn)操作和論文撰寫(xiě)，鄒穎剛參與數(shù)據(jù)整理和分析，鄭連文參與論文審閱和修改。

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