雙酚A 對子宮內膜間充質干/基質細胞干性的影響及人臍帶間充質干細胞源性上清對細胞損傷的改善作用

［摘 要］ 目的：探討雙酚A（BPA）對子宮內膜間充質干/基質細胞（eMSCs）增殖活性和干性特征的影響，闡明人臍帶間充質干細胞源性上清（hUCMSC-Sup）對細胞損傷的改善作用。方法：體外培養eMSCs，以0、200、250、300、350、400 μmol·L－1 BPA 處理。將eMSCs 分為對照組（僅培養液培養）、BPA 組（含200 μmol·L－1 BPA 的等體積培養液培養）、BPA+hUCMSC-Sup 組（含200 μmol·L－1 BPA 及50% 體積比hUCMSC-Sup 的等體積培養液培養） 和BPA+CHIR-99021 組（含200 μmol·L－1 BPA 及10 μmol·L－1 CHIR-99021 的等體積培養液培養），使用干細胞成球培養液培養eMSCs 干細胞球，其余細胞均使用DMEM/F12 完全培養基培養。噻唑藍（MTT） 法檢測各組eMSCs 存活率，球體形成實驗檢測各組eMSCs干細胞球數和直徑，CCK-8法檢測各組eMSCs干細胞球中細胞增殖活性，流式細胞術檢測各組eMSCs中CD73+細胞百分率，實時熒光定量PCR（RT-qPCR）法檢測各組eMSCs中性別決定區Y框蛋白2（Sox2）、八聚體結合轉錄因子4 （Oct4） 和Nanog mRNA 表達水平，Western blotting 法檢測各組eMSCs中β-連環蛋白（β-catenin）蛋白表達水平。結果：MTT法檢測，BPA作用24和48 h，與0 μmo·l L－1 BPA 組比較，200、250、300、350 和400 μmol·L－1 BPA 組eMSCs 存活率均明顯降低（Plt;0. 01）。藥物作用24 h時，與對照組比較，BPA組eMSCs存活率明顯降低（Plt;0. 01）；藥物作用48 h時，與對照組比較，BPA 組eMSCs 存活率明顯降低（Plt;0. 01）；與BPA 組比較，BPA+hUCMSC-Sup 組eMSCs 存活率明顯升高（Plt;0. 05）。球體形成實驗檢測，與培養3 d 組比較，培養4 和5 d 組eMSCs 干細胞球數和直徑均明顯增加（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）；與對照組比較，培養48 h 時BPA 組eMSCs 干細胞球數和直徑均明顯減少（Plt;0. 05或Plt;0. 01）。CCK-8法檢測，處理24和48 h時，與對照組比較，BPA 組eMSCs 干細胞球中細胞增殖活性均明顯降低（Plt;0. 01）；與BPA組比較，BPA+hUCMSC-Sup組eMSCs干細胞球中細胞增殖活性均明顯升高（Plt;0. 01）。流式細胞術檢測，與對照組比較，BPA 組eMSCs中CD73+細胞百分率明顯降低（Plt;0. 01）；與BPA 組比較，BPA+hUCMSC-Sup組eMSCs中CD73+細胞百分率明顯升高（Plt;0. 01）。RT-qPCR法檢測，與對照組比較，BPA組eMSCs中Sox2、Oct4和Nanog mRNA表達水平均明顯降低（Plt;0. 01）；與BPA 組比較，BPA+hUCMSC-Sup組和BPA+CHIR-99021組eMSCs中Sox2、Oct4及NanogmRNA 表達水平均明顯升高（Plt;0. 01）。Western blotting 法檢測，與對照組比較，BPA 組eMSCs 中β-catenin 蛋白表達水平明顯降低（Plt;0. 01）；與BPA 組比較，BPA+hUCMSC-Sup 組和BPA+CHIR-99021 組 eMSCs 中 β -catenin蛋白表達水平均明顯升高（Plt;0. 01）。結論：BPA能夠抑制eMSCs的干性特征，損傷子宮內膜的自我更新及修復作用，其機制可能與下調細胞中Wnt/β-catenin 信號通路活性有關。hUCMSC-Sup 可以促進受損eMSCs 的增殖，并對BPA 誘導的eMSCs 干性損傷起到改善作用。

［關鍵詞］ 雙酚A； 子宮內膜間充質干/基質細胞； 人臍帶間充質干細胞； 干細胞球

［中圖分類號］ Q254 ［文獻標志碼］ A

子宮內膜間充質干/基質細胞（endometrialmesenchymal stem/stromal cells， eMSCs） 具有多向分化和高增殖的潛能，受激素嚴格調控，在子宮內膜周期性再生中發揮重要作用［1］。eMSCs 受損后會發生子宮內膜功能障礙，最終導致胚胎著床失敗和早期流產，是女性不孕的主要原因之一［2］。當eMSCs 聚集成三維球狀體時， 其整體功能增強，如參與組織再生的關鍵因子血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF） 和前列腺素E2 （prostaglandin E2，PGE2） 分泌增加，多能基因Nanog 和性別決定區Y 框蛋白2 （sex determiningregion Y-box 2，Sox2） mRNA 表達上調［3］。

雙酚A （bisphenol A，BPA） 的結構與雌激素類似，可與雌激素受體或其他激素受體結合干擾細胞的正常生理進程， 是最常見的內分泌干擾物（endocrine disrupting chemicals，EDCs）［4］。研究［5］顯示： BPA 暴露與多種疾病的發生發展有關， 包括生育能力受損、乳腺癌、糖尿病、肥胖、認知障礙和心血管疾病。HARNETT 等［6］ 發現：BPA 及其類似物對大鼠和人類干細胞有細胞毒性并能夠誘導細胞凋亡。目前， BPA 對子宮內膜干細胞的影響尚未完全闡明。WANG 等［7］ 研究表明：人臍帶間充質干細胞（human umbilical cord mesenchymalstem cells，hUCMSCs） 與受損的人子宮內膜基質細胞（human endometrial stromal cells，hEndoSCs）在體外共培養后，受損的hEndoSCs 增殖率明顯升高。本研究以BPA 作用eMSCs， 探討BPA 對eMSCs 干性的影響， 闡明hUCMSCs 源性上清（hUCMSC-derived supernatunt， hUCMSC-Sup）對細胞損傷的改善作用。

1 材料與方法

1. 1 細胞、主要試劑和儀器 eMSCs和hUCMSCs為吉林省人民醫院中心實驗室傳代保存。BPA （貨號：#K2116009） 購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，CCK-8 試劑盒（貨號：C0039） 購自上海碧云天生物技術有限公司，DMEM/F12 基礎培養基（貨號：SH30023. 01） 購自美國HyClone 公司，胎牛血清（fetal bovine serum，FBS） （貨號： FB15015）購自美國Clark 生物公司，磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffer saline，PBS）（ 貨號：FG701-01）、1% 青-鏈霉素（ 貨號：FG101）、含EDTA的胰蛋白酶（貨號：#FG301-01）、RNA 提取試劑盒和逆轉錄試劑盒均購自北京全式金生物技術有限公司，選擇性糖原合酶激酶3 （glucogen synthase kinase-3， GSK-3）抑制劑CHIR-99021 購自美國MCE 公司，實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR） 反應體系SYBR Green 試劑盒購自美國Bio-Rad 公司，RT-qPCR 引物序列由蘇州金唯智生物科技公司合成， β 連環蛋白（β -catenin） 抗體（貨號：#8480S） 購自美國Cell Signaling Technology公司，CD73 抗體（貨號：#560847） 購自美國BD公司。電泳儀購自美國Wealtec 公司，酶標儀購自美國Thermo 公司，流式細胞儀購自美國BD 公司，CO2 恒溫培養箱購自美國賽默飛世爾科技公司，倒置熒光顯微鏡購自日本Olympus 公司， RT-qPCR儀購自美國Applied Biosystems 公司。

1. 2 細胞培養、分組和處理 采用含 10% FBS和1% 青-鏈霉素的DME/F12 完全培養基，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養eMSCs，采用含EDTA 的胰蛋白酶消化傳代。培養P3～P5 代hUCMSCs， 收集細胞對數生長期培養液，3 000 g 離心15 min，清除細胞和細胞碎片， 制備為hUCMSC-Sup， 分裝后-80 ℃保存備用。不含血清的DMEM/F12 培養基中添加10 μg·L-1 EGF、10 μg·L-1 bFGF 和2% B27 （50×），配制干細胞成球培養液。將eMSCs分為對照組（僅培養液培養）、BPA 組（含200 μmol·L－1 BPA 的等體積培養液培養）、BPA+hUCMSC-Sup 組（含200 μmol·L-1 BPA 及50% 體積比hUCMSC-Sup 的等體積培養液培養）和BPA+CHIR-99021 組（含200 μmol·L-1 BPA 及10 μmol·L-1 CHIR-99021 的等體積培養液培養），使用干細胞成球培養液培養eMSCs 干細胞球， 其余細胞均使用DMEM/F12 完全培養基培養。

1. 3 噻唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法檢測不同濃度BPA組eMSCs存活率 取對數生長期的eMSCs， 以每孔1×104 個細胞的密度接種于96 孔細胞培養板，待細胞生長至約70% 后，分別加入0、 200、 250、 300、 350 和400 μmol·L－1 BPA。并于加藥處理后的24 和48 h， 每孔加入10 μLMTT 試劑， 4 h 后采用酶標儀檢測波長492 nm 處吸光度（A） 值，計算細胞存活率。細胞存活率=（實驗孔A 值－空白孔A 值） / （對照孔A 值－空白孔A 值） ×100%。單層培養細胞存活率檢測：球體形成實驗培養1 周后收集細胞球，吹打分散為單細胞懸浮液后再次接種于96 孔細胞培養板，待細胞生長至約70%后，分別加入培養液（對照組）、含BPA 的培養液（BPA 組） 和含BPA 及hUCMSC-Sup 的培養液（BPA+hUCMSC-Sup 組）， 于加藥處理后24 和48 h 每孔加入10 μL MTT 試劑，4 h 后采用酶標儀檢測波長492 nm 處A 值，計算細胞存活率。細胞存活率= （實驗孔A 值－ 空白孔A 值） / （對照孔A 值－空白孔A 值） ×100%。每組實驗重復4 次。

1. 4 球體形成實驗檢測各組eMSCs干細胞球體形態表現 eMSCs經胰酶消化后懸浮于干細胞成球培養液中，以每孔1×104個細胞的密度接種于低黏附6 孔細胞培養板中培養5 d，于培養第3、4 和5 天拍照并記錄eMSCs 干細胞球數和直徑變化。干細胞球培養至3 d 時按上述eMSCs 干細胞球體分組處理，于加藥24 和48 h 后拍照并計數eMSCs 干細胞球數和直徑。采用Image J 軟件測量eMSCs 干細胞球直徑，球體直徑≥50 μm 則為1 個球體。

1. 5 CCK-8法檢測各組eMSCs干細胞球中細胞增殖活性 將 eMSCs以每孔 5×103個細胞的密度接種于低黏附24 孔細胞培養板， 干細胞成球培養液培養3 d，按上述干細胞球體分組，于加藥處理后0、24 和48 h， 每孔加入100 μL CCK-8 試劑， 4 h后采用酶標儀檢測波長450 nm 處A 值，以僅加入培養液的空白孔為對照孔調零。以A 值代表各組eMSCs 干細胞球中細胞增殖活性。

1. 6 流式細胞術檢測各組eMSCs中CD73+細胞百分率 將eMSCs接種于6孔細胞培養板，按照上述eMSCs 分組處理24 h 后， 加入APC-A 標記的CD73 抗體，避光冰上孵育30 min 后PBS 緩沖液洗滌3 次。采用流式細胞儀和FlowJo 軟件檢測各組eMSCs 中CD73+細胞百分率。

1. 7 RT-qPCR 法檢測各組 eMSCs 中 Sox2、八聚體結合轉錄因子 4（octamer-binding transcriptionfactor 4，Oct4）和 Nanog mRNA 表 達 水 平 將eMSCs 鋪于6 孔細胞培養板，并按照上述細胞分組處理24 h 后，采用TRIzol 試劑提取總RNA，反轉錄試劑盒合成cDNA， 以cDNA 作為模板， 使用SYBR Green qPCR Master Mix 進行RT-qPCR 擴增， 檢測各組細胞中Sox2、Oct4 和Nanog mRNA表達水平。引物序列： GAPDH F 5'-TCAGGCGTCTGTAGAGGCTT-3'， R 5'-ATGCACATCCTTCGATAAGACTG-3'； Sox2 F 5'-GCCGAGTGGAAACTTTTGTCG-3'， R 5'-GCAGCGTGTACTTATCCTTCTT-3'； Oct4 F 5'-AAGCGATCAAGCAGCGACTA-3'， R 5'-CAGAGTGGTGACGGAGACAG-3'； Nanog F 5'-CCCCAGCCTTTACTCTTCCTA-3'， R 5'-CCAGGTTGAATTGTTCCAGGTC-3'。反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，循環40 次； 72 ℃ 終延10 min， 4 ℃ 保存。使用GAPDH 進行歸一化處理， 采用2?ΔΔCt 法計算目的基因表達水平。

1. 8 Western blotting 法 檢 測 各 組 eMSCs 中β-catenin 蛋白表達水平 將 eMSCs接種于 6孔細胞培養板， 按照上述細胞分組處理24 h 后， 收集eMSCs 進行裂解獲取蛋白，經SDS-PAGE 電泳分離蛋白樣品，轉移至PVDF 膜，5% 脫脂奶粉TBST 溶液室溫封閉1 h， 分別加入抗體β-catenin（1∶1 000） 和GAPDH （1∶1 000） 4 ℃孵育過夜。洗膜3 次， 加入HRP 標記的抗小鼠或抗兔二抗（1∶2 000） 室溫孵育2 h，再次洗膜后加入ECL 發光檢測試劑使條帶顯像。采用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，計算目的蛋白表達水平，實驗重復3 次。目的蛋白表達水平= 目的蛋白條帶灰度值/GAPDH 蛋白條帶灰度值。

1. 9 統計學分析 采用 SPSS 25. 0統計軟件進行統計學分析。各組eMSCs 干細胞球數和直徑及細胞增殖活性，各組eMSCs 存活率和CD73+細胞百分率，各組eMSCs 中Sox2、Oct4 和Nanog mRNA表達水平及β-catenin 蛋白表達水平均符合正態分布，以-x±s 表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析， 組間樣本均數兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以Plt;0. 05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2. 1 各組 eMSCs 存活率 BPA 作用 24 和 48 h，與0 μ mol·L －1 BPA 組比較， 200 、250 、350 和400 μmol·L－1 BPA 組eMSCs 存活率均明顯降低（Plt;0. 01）。見表1。藥物作用24 h 時， 與對照組比較， BPA 組eMSCs 存活率明顯降低（Plt;0. 01）； 與BPA 組比較， BPA+hUCMSC-Sup 組eMSCs 存活率差異無統計學意義（Pgt;0. 05）。藥物作用48 h 時，與對照組比較，BPA 組eMSCs 存活率明顯降低（Plt;0. 01）； 與BPA 組比較，BPA+hUCMSC-Sup 組eMSCs 存活率明顯升高（Plt;0. 05）。見表2。

2. 2 各組 eMSCs 干細胞球體形態表現 與培養3 d 組比較，培養4 和5 d 組eMSCs 干細胞球數和直徑均明顯增加（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）。見圖1 和表3。與對照組比較，培養24 h時BPA組eMSCs干細胞球數和直徑差異均無統計學意義（Pgt;0. 05）， 培養48 h 時BPA 組eMSCs 干細胞球數和直徑均明顯減少（Plt;0. 05 或Plt;0. 01）。見表4。

2. 3 各組 eMSCs 干細胞球中細胞增殖活性 處理0 h 時，各組eMSCs 干細胞球中細胞增殖活性比較差異均無統計學意義（Pgt;0. 05）。處理24 和48 h時，與對照組比較， BPA 組eMSCs 干細胞球中細胞增殖活性均明顯降低（Plt;0. 01）； 與BPA 組比較，BPA+hUCMSC-Sup 組eMSCs 干細胞球中細胞增殖活性均明顯升高（Plt;0. 01）。見表5。2. 4 各組 eMSCs中 CD73+細胞百分率 與對照組（98. 20%±0. 98%） 比較，BPA 組eMSCs 中CD73+細胞百分率（44. 63%±18. 66%） 明顯降低（Plt;0. 01）；與BPA組比較，BPA+hUCMSC-Sup組eMSCs 中CD73+細胞百分率（91. 53%±7. 38%）明顯升高（Plt;0. 01）。見圖2。

2. 5 各組 eMSCs 中 Sox2、Oct4 和 Nanog mRNA表達水平 與對照組比較，BPA組eMSCs中Sox2、Oct4、Nanog mRNA 表達水平均明顯降低（Plt;0. 01）； 與BPA 組比較， BPA+hUCMSC-Sup 組和BPA+CHIR-99021 組eMSCs 中Sox2、Oct4 及Nanog mRNA 表達水平均明顯升高（Plt;0. 01）。見表6。

2. 6 各組 eMSCs 中 β-catenin 蛋白表達水平 與對照組比較， BPA 組eMSCs 中β-catenin 蛋白表達水平明顯降低（Plt;0. 01）；與BPA 組比較，BPA+hUCMSC-Sup 組和BPA+CHIR-99021 組eMSCs 中β-catenin 蛋白表達水平均明顯升高（Plt;0. 01）。見圖3。

3 討 論

BPA 能夠提高塑料和合成產品的耐用性和柔韌性，被廣泛用于塑料食品、液體容器、金屬罐內襯、個人護理產品包裝、運動器材及醫療和牙科設備中［8］。因此，人類日常接觸BPA 是不可避免的。研究［9-10］ 顯示： BPA 暴露增強子宮內膜基質細胞侵襲能力，并通過WD 重復域蛋白5/甲基胞嘧啶雙加氧酶2 （WD repeat-containing protein 5/tet methylcytosine dioxygenase 2， WDR5/TET2）介導的表觀遺傳途徑上調子宮內膜中雌激素受體β（estrogen receptor beta，Erβ） 表達，從而促進子宮內膜異位癥發生發展。CASERTA 等［11］ 發現：BPA 促進核雌激素相關受體γ 易位，通過表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF） 依賴性和非EGF 依賴性途徑促進Ⅰ 級子宮內膜癌細胞增殖。此外，長期接觸BPA 嚴重損害子宮內膜基質細胞向蛻膜細胞的分化，并會損害孕酮受體及其下游靶基因通路， 對胚胎著床和妊娠產生不利影響［12］。本研究結果顯示： BPA 對eMSCs 存活率有抑制作用。

子宮內膜的再生能力與子宮內膜干細胞存在密切關聯。研究［13-14］ 證實： 人類和部分動物子宮內膜中存在基質干細胞。干細胞的“干性”包括自我更新能力和多向分化能力即多能性［15］。干細胞的特征是能夠在懸浮培養下形成球體，球體形成實驗可檢測干細胞自我更新能力。WANG 等［16］ 證實：與體外單層髓核細胞比較，髓核細胞球體表現出優秀的自我更新和細胞外基質合成能力。本研究結果顯示：BPA 干預后eMSCs 干細胞球數和直徑明顯減少，細胞增殖活性明顯降低，提示BPA 能夠抑制eMSCs 干細胞活性。

Oct4、Sox2 和Nanog 等干性相關轉錄因子在維持胚胎干細胞的多能性和自我更新能力方面也發揮著重要作用［17］。KESHAVARZ 等［18］ 研究表明：敲低長鏈非編碼RNA （long non-coding RNA，lncRNA） ES1 會下調乳腺癌細胞中Oct4 和Sox2 的表達， 抑制ES1 可能會限制癌細胞增殖和細胞周期進展，誘導細胞凋亡和細胞衰老。本研究結果顯示：與對照組比較，BPA 組 eMSCs 中 Sox2、Oct4 和Nanog mRNA 表達水平明顯降低， eMSCs中CD73+細胞百分率明顯降低，提示BPA 可抑制eMSCs 的干性。

多種信號通路參與損傷后組織再生和發育，其中Wnt/β-catenin 信號通路在維持各種干細胞類型的自我更新和分化調節中發揮重要作用。研究［19］顯示： Wnt/β-catenin 信號通路在子宮內膜干細胞群的調節中具有重要作用。DAVIDSON 等［20］ 證實： Wnt/β-catenin 信號的激活會促進干細胞表面標志物的表達。LI 等［21］ 發現： 谷氨酰胺酶1（glutaminase 1，GLS1） 通過Wnt/β-catenin 信號傳導調節細胞干性，敲除GLS1 可減少干性相關基因的表達并抑制體內肝癌干細胞致瘤性。本研究結果顯示： BPA 可明顯降低eMSCs 中β-catenin 蛋白表達水平。提示BPA 可能是通過抑制Wnt/β-catenin通路激活， 降低eMSCs 的干性， 損傷子宮內膜的周期性再生能力。

hUCMSCs 具有自我更新和多向分化的特性，可以修復受損組織， 被用于治療多種疾病［22］。CHIR-99021 作為GSK-3 抑制劑，可以使GSK-3α/β失 活， 從 而 激 活 Wnt/β -catenin 通 路。GOVARTHANAN 等［23］ 發現： CHIR-99021 處理后， 間充質干細胞（ mesenchymal stem cells， MSCs）中β-catenin 的核定位增加且MSCs 的分化潛力提高。本研究結果顯示： hUCMSC-Sup 可顯著增強被BPA 抑制的eMSCs 干細胞球中細胞增殖活性，上調CD73+ 細胞百分率。eMSCs 中干性相關因子Sox2、Oct4 和Nanog mRNA 表達水平及β-catenin蛋白表達水平明顯升高， 與CHIR-99021 處理結果相似。提示hUCMSC-Sup 具有改善eMSCs 干性的能力，可能與Wnt/β-catenin 通路激活有關。

綜上所述，BPA 能夠抑制eMSCs 的干性特征，損傷子宮內膜的自我更新及修復作用，其機制可能與下調細胞中Wnt/β -catenin 信號通路活性有關。hUCMSC-Sup 可以促進受損eMSCs 的增殖，并對BPA 誘導的eMSCs 干性損傷起到改善作用。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：王愛喬參與研究設計和論文撰寫，王琳、張文琦和鄧玲參與研究數據獲取及分析，劉磊、林秀英和付建華參與論文修改及審校，米旭光和方艷秋參與研究設計。

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