豐水期長蕩湖水質評價與微生物群落結構特征研究

關鍵詞：豐水期；長蕩湖；水質評價；微生物群落

中圖分類號：X171.4 文獻標志碼：B

前言

微生物是水生態系統的重要組成部分，在維持水生態系統的功能和健康中起著重要作用，同時微生物也是反映水環境健康的重要指標。張建波等認為后生浮游動物可作為湖泊水環境變化的指示性生物。由于微生物能將對生態環境造成威脅的有機物和有毒物質轉化為可以維護生態平衡的無機物。如枯草芽孢桿菌是一類革蘭氏陽性菌，其分泌的多種高活性胞外酶，能快速分解并吸收水環境中的有機物，以達到改善水質的效果。因此全面調查長蕩湖微生物群落組成是極有必要的。

長蕩湖位于江蘇省常州市。長蕩湖南北長約15.5km，東西寬約9km，湖泊總面積85.31km²，平均水深1.1m。隨著長蕩湖周邊農業、漁業的快速發展以及過度城鎮化，導致湖泊水體嚴重富營養化，水質日漸惡化。

目前有關長蕩湖的研究主要聚焦于藻類、動物的群落結構特征以及沉積物污染風險等方面，但鮮有全面研究長蕩湖微生物群落結構組成。鑒于豐水期雨量充沛，水樣采集方便且豐水期長蕩湖的水體污染更為嚴重。因此此研究基于2021年6月長蕩湖采樣數據，采用2種水質評價方法綜合評價豐水期長蕩湖水質現狀，并運用高通量測序技術分析長蕩湖微生物群落結構特征，為控制長蕩湖水體污染和生態修復提供理論依據。

1材料與方法

1.1采樣點設置與采樣時間

根據長蕩湖地形輪廓，在長蕩湖南部、中部、東部和北部共設置4個采樣點。4個采樣點編號依次為W156、W158、W160、W163，于2021年6月（豐水期）進行水體樣品采集。采樣點的分布見圖1。

1.2水樣采集與測定方法

使用有機玻璃采水器采集長蕩湖表層水，每個采樣點采集1L水樣，保存于已消毒滅菌并用樣本底水充分清洗的聚乙烯取樣瓶中，并在4℃條件下運回實驗室。其中500 mL水樣用于理化因子測定，500 mL在實驗室無菌環境下使用0.45μm濾膜過濾后，將濾膜放入10mL凍存管并保存于-80℃冰箱，用于后續DNA測序。

此次測定理化指標包括總有機碳（TOC）、總氮（TN）、總磷（TP）、水溫（WT）、pH值及溶解氧（DO）。TOC采用燃燒氧化-非分散紅外吸收法；TN采用堿性過硫酸鉀-紫外分光光度法；TP采用鉬酸銨分光光度法；采用YSI多參數水質分析儀（YSI PR01020，USA）現場測定WT、pH和DO。

1.3微生物群落測序分析方法

先在無菌環境中將濾膜剪成碎片，然后使用PowerWater DNA（MOBIO，USA）試劑盒提取基因組DNA。通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的基因組DNA。使用正向引物341F（5’-CCTAYGGGRBG-CASCAG -3’）和反向引物806R（5’-GGACTAC-NNGGGTATCTAAT-3’）對V3-V4可變區進行PCR擴增。使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR產物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosci-ences，Union City，CA，USA）進行純化，Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測。測序采用IlluminaMiSeq PE300高通量測序平臺進行測序。PCR及測序均由上海凌恩生物科技公司完成。

1.4數據處理與分析

水質評價方法分別采用水污染指標法和內梅羅指數法2種評價方法。

1.4.1水污染指數法

水污染指數法以單因子指數法為基礎，內插計算出各污染指標的WPI值，選取WPI值的最高值來判定水體污染等級。選取的環境參數為總氮、總磷、DO，每個參數的WPI值計算公式如式（1）：

基于Microsoft Excel處理的原始實驗數據；微生物多樣性指數使用QIIME軟件（1.7.0版）計算，使用Origin 2018軟件繪制物種豐度柱狀圖。依托微信在線平臺繪制Circos圖分析各片區門分類水平下微生物群落結構特征。

2結果與討論

2.1長蕩湖水質現狀

長蕩湖理化因子濃度與空間分布有一定關聯。如表1所示，長蕩湖3個理化因子呈現從南到北濃度逐步降低的趨勢。其中TN濃度從1.14 mg/L降至0.68 mg/L；TP濃度從0.1 mg/L降至0.03 mg/L；TOC含量從5.4 mg/L降至3.8 mg/L。這是因為豐水期降雨量大，且人湖河流在長蕩湖北部的輸水量更多，因此造成了長蕩湖南部污染物濃度高于北部。長蕩湖各片區的WT、pH差距不大，長蕩湖南部片區和北部片區DO濃度低于中部和東部片區。整體而言，除南部片區，長蕩湖其他片區的理化指標均達到地表Ⅲ類水標準。

運用水污染指數法、內梅羅指數法分別對豐水期長蕩湖進行水質評價。2種水質評價方法結果顯示：長蕩湖南部片區比其他3個片區水質現狀嚴重，超標因子為TN、TP。但采用水污染指數法評價的水質現狀普遍低于內梅羅指數法。因為水污染指數法是基于單因子指數法，即采用“最差規則”來確定水質等級，雖然對單項指標有較好的評價意義，但缺乏對水體環境綜合考慮。總體而言，長蕩湖南部片區的部分水質指標（TN、TP）超標，但長蕩湖整體水質達標。

2.2長蕩湖微生物群落分布特征

2.2.1微生物群落Alpha多樣性指數分析

長蕩湖微生物群落Alpha多樣性指數分析結果見表2。

長蕩湖4個采樣點的Coverage指數均在97%以上，說明此次測序結果可靠。Ace、Chaol指數代表微生物豐富度。北部片區Ace指數最高，達5 462；中部片區最低，為2 590。相同地，北部片區Chaol指數最高（5248），而中部片區最低（2528）。Shannon、Simpson指數表示微生物群落的多樣性。Shannon指數最高的是北部片區，其次為東部片區、南部片區、中部片區。Simpson指數與Shannon指數反映結論一致。總體而言，長蕩湖微生物群落的豐富度與多樣性呈現出北部片區gt;東部片區gt;南部片區gt;中部片區的規律。

2.2.2門分類水平微生物群落結構

長蕩湖微生物群落在門分類水平上具有較高的多樣性。4個采樣點中共檢測出32種已知微生物菌門，長蕩湖微生物在門分類水平上組成如圖2（a）所示，其中相對豐度排在10名之后的菌門和其他未知物種歸為其它（ others）。長蕩湖相對豐度大于10_10的主要菌門有放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、藍細菌門（Cyanobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、酸桿菌門（Acidobacteriota）。

不同片區優勢菌門的種類相似。如放線菌門（Actinobacteria）為長蕩湖各片區占比最高的優勢菌門，據報道放線菌門（ Actinobacteria）是濕地、湖泊及海洋等各種水環境細菌群落中的優勢門類。相比其他細菌，放線菌能更好地躲避原生動物的捕食，死亡率相對較低；在氮、磷等營養物質元素充足的湖泊中，碳源常會限制細菌生長繁殖，而放線菌在利用碳源方面具有更強的競爭力，所以水中放線菌門（Actinobacteria）的占比相對較高。但不同片區優勢菌門的相對豐度卻有所差別。藍細菌門（Cyanobac-teria）在長蕩湖北部片區和東部片區的相對豐度分別為13.27%和5.86%，高于長蕩湖中部片區（2.93%）和南部片區（0.81%）。研究表明藍細菌門（Cyanobacteria）繁殖過多則會引發水華、使水體富營養化且藍藻生長潛力由營養物質濃度決定。但此研究中北部、東部片區的氮磷濃度低于南部和中部片區，猜測是人湖河流含有大量的藍細菌，進而導致北部、東部片區藍細菌門（Cyanobacteria）的豐度急劇上升。長蕩湖南部片區和中部片區厚壁菌門（Firmicutes）的相對豐度為16.86%、20.92%，遠高于東部（0.25%）和北部片區（0.35%）。這與李建松等研究結論一致。研究發現厚壁菌門（Firmi-cutes）是藍藻水華降解末期的最優勢菌門。原因可能是藍藻降解末期水體中溶解氧幾乎耗盡，引起了嗜陽菌屬（Heliophilum）的大量增殖，進而導致厚壁菌門（Firmicutes）在水體中的比例上升。

Circos圖可以直觀展現長蕩湖不同片區的門分類水平微生物群落組成情況。如圖2（b）所示，放線菌門（Actinobacteria）和變形菌門（Proteobacteria）在不同片區生物量分布均勻。如放線菌門（Actinobac-teria）是長蕩湖各片區占比最高的菌門，其在南部片區、中部片區、東部片區及北部片區的相對豐度依次為36.6%、43.01%、39.56%、33.85%。疣微菌門（Verrucomicrobia）、藍細菌門（Cyanobacteria）相對豐度呈現由南到北逐漸遞增的趨勢。而厚壁菌門（Firmicutes）相對豐度呈現由南到北逐漸遞減的趨勢。特別是擬桿菌門（Bacteroidetes）在北部片區（13.72%）、南部片區（11.52%）、東部片區（11.85%）的相對豐度相近，但高于中部片區（3.94%）。由于人湖河流攜帶的污染物對長蕩湖水質有一定影響，猜測長蕩湖北部、南部和東部片區的擬桿菌門相對豐度的提升來源于人湖河流的輸入。可見長蕩湖微生物群落結構與空間位置、外源輸入有關。

2.2.3科分類水平微生物群落結構

豐水期長蕩湖共檢測出378種微生物菌科，如圖3所示，相對豐度前5的菌科依次為：螢光桿菌科（Ilumatobacteraceae）、魚孢菌科（Sporichthyaceae）、動球菌科（Planococcaceae）、叢毛單胞菌科（Co-mamonadaceae）。莫拉菌科（Moraxellaceae）。

不同片區的科分類水平下微生物相對豐度有一定差別。如動球菌科（Planococcaceae）在長蕩湖南部片區和中部片區的相對豐度遠高于東部和北部片區，據報道動球菌科（Planococcaceae）的生長受多種環境因素共同影響，如pH、鹽度等。推測可能是人湖河流的輸入導致東部和北部片區水體理化性質發生變化，從而造成動球菌科（Planococcaceae）含量降低。長蕩湖南部片區和中部片區莫拉菌科（Moraxellaceae）的含量同樣高于東部和北部片區。說明科分類水平下微生物與外源輸入有關。

2.2.4屬分類水平微生物群落結構

長蕩湖4個采樣點共檢測出467種微生物菌屬；但所有采樣點均有未能確定分類學地位的菌屬。如圖4所示，相對豐度排在10名之后的菌屬和其他未知物種歸為其它（others）。長蕩湖相對豐度前5的菌屬依次為：CL500-29 marine group、hgcl clade、類芽孢八疊球菌屬（Paenisporosarcina）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、Clade Ill_norank。

長蕩湖不同片區優勢菌屬種類相似，但占比不同。CL500-29 marine group是長蕩湖占比最高的菌屬，其在中部片區的占比高于其他片區。hgclclade分布情況與CL500-29 marine group一致。類芽孢八疊球菌屬（Paenisporosarcina）、不動桿菌屬（Acinetobacter）的相對豐度呈現出南部片區、中部片區高于東部片區和北部片區。研究表明不動桿菌屬（ Acinetobacter）屬于變形菌門，是一類重要的反硝化聚磷菌，其生長繁殖受營養物質影響；由于長蕩湖氮磷濃度自南到北逐步降低，因此不動桿菌屬（Acinetobacter）的相對豐度也是自南到北逐漸下降。相反地，Clade Ill_norank在東部片區、北部片區的相對豐度略高于南部片區與中部片區。可能是入湖河流輸入造成的。

3結論

兩種水質評價方法結果顯示，豐水期長蕩湖南部片區污染最為嚴重，其中超標因子為TN、TP，但整體上長蕩湖水質達標。高通量測序結果表明，長蕩湖4個采樣點共檢測出微生物群落32門378科467屬。長蕩湖各片區的微生物群落中優勢菌門、菌科、菌屬種類相似，但相對豐度卻有所差別。相對豐度前3的優勢菌門、菌科分別為放線菌門（Actinobacte-ria）、變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmi-cutes）與螢光桿菌科（Ilumatobacteraceae）、魚孢菌科（Sporichthyaceae）、動球菌科（Planococcaceae）；占比前3的優勢菌屬包含CL500-29 marine group、hgclclade、類芽孢八疊球菌屬（Paenisporosarcina）。微生物群落Alpha多樣性分析結果顯示，長蕩湖微生物群落多樣性和豐富度呈現北部片區gt;東部片區gt;南部片區gt;中部片區的規律。長蕩湖微生物群落結構與空間位置、外源輸入有關。