腐爛莖線蟲經羊消化道后的活性檢測與分子鑒定

楊藝煒1，"馮瑞瑞2，"古永昌3，"方玉川2，"張春燕2，"彭"煥4，彭德良4，"陳志杰1，"李英梅1*，"常"青1*

（1."陜西省生物農業研究所，陜西省植物線蟲學重點實驗室，"西安"710043;"2."陜西省榆林市農業科學院，"

榆林"719000;"3."陜西學前師范學院，"西安"710100;"4."中國農業科學院植物保護研究所，"

植物病蟲害綜合治理全國重點實驗室，"北京"100193）

摘要

腐爛莖線蟲是嚴重威脅我國馬鈴薯、甘薯等產業發展的重要植物病原線蟲，而目前對其傳播機制仍不清楚。本研究收集田間感染馬鈴薯腐爛莖線蟲的病薯飼喂山羊，結果在羊糞中檢測到了腐爛莖線蟲蟲卵。分子鑒定結果表明，相關病原線蟲為B型腐爛莖線蟲。通過孵化試驗與室內接種試驗進一步證明了羊糞中的腐爛莖線蟲蟲卵可以孵化成幼蟲為害馬鈴薯。相關研究首次證實了糞肥對腐爛莖線蟲的傳播作用，揭示了榆林地區常年連作玉米的田塊在種植馬鈴薯后腐爛莖線蟲病突然暴發的潛在原因，對于今后指導種植戶及時清理、集中銷毀田間病爛薯，以及杜絕使用未腐熟羊糞作為肥料的粗放管理模式提供了重要理論依據。

關鍵詞

腐爛莖線蟲;"糞肥傳播;"分子鑒定

中圖分類號：

S"43532

文獻標識碼："A

DOI："10.16688/j.zwbh.2024193

Detection"and"molecular"identification"of"Ditylenchus"destructor"in"goat"feces

YANG"Yiwei1，"FENG"Ruirui2，"GU"Yongchang3，"FANG"Yuchuan2，"ZHANG"Chunyan2，"PENG"Huan4，PENG"Deliang4，"CHEN"Zhijie1，"LI"Yingmei1*，"CHANG"Qing1*

（1."Shaanxi"Key"Laboratory"of"Plant"Nematology，"BioAgriculture"Institute"of"Shaanxi，"Xi’an"710043，"China;"

2."Yulin"Academy"of"Agricultural"Sciences"of"Shaanxi"Province，"Yulin"719000，"China;"3."Shaanxi"Xueqian"

Normal"University，"Xi’an"710100，"China;"4."State"Key"Laboratory"for"Biology"of"Plant"Diseases"and"

Insect"Pests，"Institute"of"Plant"Protection，"Chinese"Academy"of"Agricultural"Sciences，"Beijing"100193，"China）

Abstract

Ditylenchus"destructor，"a"significant"plant"parasitic"nematode，"poses"a"severe"threat"to"potato"and"sweet"potato"industries"in"China，"yet"its"transmission"mechanism"remains"elusive."In"this"study，"diseased"potatoes"infected"with"D.destructor"collected"from"fields"were"used"to"feed"goats."Consequently，"D.destructor"eggs"were"detected"in"the"goats’"feces."Molecular"identification"confirmed"that"the"pathogenic"nematodes"from"the"diseased"potatoes"belonged"to"haplotype"B"of"D.destructor."Incubation"and"inoculation"tests"demonstrated"that"D.destructor"eggs"present"in"goat"manure"were"capable"of"hatching"into"larvae"and"infecting"potatoes."This"study"revealed"for"the"first"time"that"D.destructor"can"be"transmitted"through"goat"feces，"uncovering"a"potential"cause"for"sudden"outbreaks"of"D.destructor"disease"in"potato"fields"following"perennial"continuous"corn"crops"in"the"Yulin"area."These"findings"provide"crucial"theoretical"support"for"future"recommendations，"including"the"prompt"removal"of"diseased"and"rotten"potatoes"from"fields，"centralized"disposal，"and"the"strict"avoidance"of"using"uncomposted"goat"feces"as"fertilizer.

Key"words

Ditylenchus"destructor;"fecalsource"transmission;"molecular"identification

腐爛莖線蟲Ditylenchus"destructor"Thorne，"1945又稱馬鈴薯腐爛莖線蟲、甘薯腐爛莖線蟲、甘薯莖線蟲等，隸屬于線蟲門Nematoda色矛綱Chromadorea小桿目Rhabditida粒科Anguinidae莖線蟲屬Ditylenchus，可以危害馬鈴薯、甘薯、大蒜、當歸、胡蘿卜等100余種植物［12］。在我國，腐爛莖線蟲對甘薯與馬鈴薯的危害尤為嚴重，通常可以造成減產10%～30%，重者減產50%～80%，甚至絕收［3］。此外，腐爛莖線蟲的入侵還會在薯塊表皮制造傷口，有利于真菌、細菌、蝸類、螨類等病原物的二次侵染，最終形成復合侵染，對薯類作物造成更大的產量損失［47］。

近年來，大量研究主要集中在腐爛莖線蟲種群分化及檢測鑒定方面，Subbotin等根據腐爛莖線蟲rDNAITS區序列特征將腐爛莖線蟲劃分為A～G共7個不同基因型［8］。中國農業科學院植物保護研究所和甘肅農業大學的科研團隊又分別在我國發現了H～N和M～P等9個新的腐爛莖線蟲基因型群體［910］。劉晨等研究表明，陜西省馬鈴薯腐爛莖線蟲群體為B型［11］。此外，腐爛莖線蟲在發生風險評估［1214］、侵染規律［1516］、藥劑篩選［1721］等方面也取得了一定的研究進展，但是目前對腐爛莖線蟲的傳播機制尚不十分明確。學界普遍認為種薯（苗）和土壤是腐爛莖線蟲傳播的主要途徑，此外，田間遺留的病殘薯、糞肥、流水和農具等也都有可能是其傳播媒介［2，"2223］。但截至目前，尚無直接證據證明腐爛莖線蟲可以隨糞肥傳播擴散。本團隊在前期調查中發現，榆林地區長期單一種植玉米的田塊在種植馬鈴薯，特別是無病馬鈴薯種薯后，田間腐爛莖線蟲病暴發，相關田塊內腐爛莖線蟲的來源問題成謎。本團隊通過田間調查與走訪得知當地農戶為解決飼料短缺問題，用馬鈴薯腐爛莖線蟲病發病薯塊喂食羊的現象十分普遍，且普遍存在將未腐熟羊糞直接投入大田的習慣。針對這一生產問題，本研究通過使用腐爛莖線蟲病發病馬鈴薯喂羊，收集羊糞進行檢測鑒定，以期證實腐爛莖線蟲可通過糞肥傳播，并探明常年種植玉米的地塊改種馬鈴薯時腐爛莖線蟲病暴發的原因。

1"材料與方法

1.1"飼喂方法及蟲卵種群密度調查

在榆林市榆陽區某家庭農場選擇3只健康的白絨山羊在消毒后的圈舍內單獨飼養。本研究將田間采集到的經分離鑒定確定感染B型馬鈴薯腐爛莖線蟲的薯塊［11］與飼草按1∶5的比例混合飼喂山羊，每日早中晚飼喂3次，每次1"kg，自由飲水（飼草與水經檢測不含腐爛莖線蟲）。取100"g切碎混勻的發病馬鈴薯薯塊，利用蔗糖梯度離心法［24］分離發病薯塊中的腐爛莖線蟲蟲卵，根據鏡檢結果估算發病薯塊中腐爛莖線蟲蟲卵的種群密度。

1.2"羊糞采集

分別在開始飼喂后的第3、5、7、10天收集新鮮羊糞，并用干凈自封袋及時封裝，置于4℃冰箱保存待檢。

1.3"羊糞中線蟲卵的分離

采用改良的飽和食鹽水漂浮法檢測羊糞中線蟲蟲卵［2527］。用電子天平稱取5"g新鮮羊糞置于小燒杯中，加入10"mL飽和食鹽水，用玻璃棒將糞便攪碎后持續攪拌至均勻，再加入50"mL飽和食鹽水充分攪拌后過60目網篩。待濾液靜置15"min后，用膠頭滴管從濾液頂部吸取100"μL液體，置于載玻片上，在顯微鏡下進行觀察拍照，并計數。

1.4"羊糞中腐爛莖線蟲的分子生物學鑒定

參照宛菲等的方法進行線蟲"DNA提取［28］。在顯微鏡下收集羊糞中100粒左右疑似腐爛莖線蟲蟲卵。分別轉移至滅菌后的PCR管中，用滅菌水離心洗滌6次后盡量棄除上清液，再向PCR管內加入14"μL"10×ExTaq"Buffer（TaKaRa），6"μL"蛋白酶K（2"mg/mL）及20"μL"ddH2O，于-80℃冰箱內靜置2"h以上，取出后在液氮中用玻璃棒反復研磨3次以上。研磨后將PCR管置于PCR儀內，運行程序：65℃"90"min，85℃"10"min。待程序運行結束后，即得到線蟲DNA提取液。

參考付博等的方法［29］，以線蟲DNA提取液為模板，分別使用通用引物（rDNA1/rDNA2："5′TTGATTACGTCCCTGCCCTTT3′/5′TTTCACTC

GCCGTTACTAAGG3′）與特異性引物（DdS1/DdS2："5′TCGTAGATCGATGAAGAACGC3′/

5′ATTATCTCGAGTGGGAGCGC3′;"DdL1/DdL2：

5′TTGTGTTTGCTGGTGCGCTTGT3′/5′GAG

TGAGAGCGATGTCAACATTG3′）進行PCR擴增。PCR擴增體系為：Taq"PCR"Master"Mix（Tiangen）"125"μL，上、下游引物各1"μL，DNA提取液"2"μL，ddH2O"85"μL。PCR擴增條件為：95℃預變性4"min;95℃變性30"s，50℃退火30"s，72℃延伸1"min，循環35次;72℃延伸10"min。待反應結束后，取8"μL"PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像儀中進行觀察拍照。對通用引物擴增得到的PCR產物進行回收，連接至pMD"18T"載體（TaKaRa），送北京擎科生物科技股份有限公司進行測序。

1.5"腐爛莖線蟲的系統發育分析

將測序得到的rDNAITS區序列在NCBI網站上進行BLAST分析，從GenBank中下載與本序列相似度最高的相關序列進行Clustal比對，以Ditylenchus"myceliophagus"（DQ151458、AM232236）為外群。使用MEGA"60軟件按照鄰接法構建系統發育樹，bootstrap設置為1"000。

1.6"羊糞中腐爛莖線蟲蟲卵孵化

在顯微鏡下收集100粒左右從羊糞中分離的腐爛莖線蟲蟲卵，轉移至滅菌后的EP管中，用滅菌水離心洗滌6次，充分去除鹽水溶液后，將卵保存于ddH2O中。將EP管放入28℃培養箱內靜置，以實驗室培養收集的蟲卵為對照，分別在靜置后第3、5、7、10天吸取20"μL膠頭滴管吹打混勻的線蟲溶液在顯微鏡下鏡檢，計算蟲卵孵化率，每個處理重復3次。

卵孵化率=2齡幼蟲數量蟲卵數量+2齡幼蟲數量×100%。

1.7"腐爛莖線蟲蟲卵室內接種

收集500粒左右腐爛莖線蟲蟲卵，制備成50"μL線蟲卵懸液，按照宮衛波等［30］的方法室內接種至健康‘冀張薯"12號’薯塊上，于27℃，相對濕度50%的培養箱內遮光培養35"d。將馬鈴薯從中間切開，觀察馬鈴薯發病情況，試驗設3個重復。

2"結果與分析

2.1"馬鈴薯薯塊中腐爛莖線蟲蟲卵種群密度與羊糞中腐爛莖線蟲蟲卵檢出數量

喂食羊的每克馬鈴薯薯塊中檢出腐爛莖線蟲蟲卵數為（26±51）個（19～31個），在第3、5、7、10天收集的羊糞中，均觀察到疑似腐爛莖線蟲的蟲卵。卵的形態呈橢圓形，表面光滑，長（7434±460）"μm"（6837～8126"μm），寬（2830±365）"μm（2442～3339"μm），卵殼薄，內含卵細胞或卷曲的幼蟲（圖1a）。蟲卵檢出個數如圖1b所示，每克羊糞中腐爛莖線蟲蟲卵在第3天含量最少，為11個左右，第5天含量較多，為15個左右。

2.2"羊糞中蟲卵的PCR檢測結果

以收集到的蟲卵DNA為模板，利用ITS區通用引物rDNA1/rDNA2和特異性引物DdL1/DdL2、DdS1/DdS2分別進行擴增，結果顯示，rDNA1/rDNA2"和DdL1/DdL2"2對引物均可擴增出條帶，大小分別為1"100"bp和485"bp，"DdS1/DdS2則未擴增到條帶（圖2）。這一結果初步證實了從羊糞中收集到的卵為腐爛莖線蟲蟲卵，且基因型為B型。

2.3"腐爛莖線蟲的系統發育分析

將測序所得蟲卵rDNAITS區序列與NCBI上已公開的A型（OK330377、OK330383、EF210364、OK330266、EF418002、OK330273）、B型（OK348892、OK415022、FJ911551、EF208212、OK348890）與C型（MN173005、OK348876、OK348871、MZ345883、MK979365）腐爛莖線蟲相關基因片段序列進行比對分析，以Ditylenchus"myceliophagus"（DQ151458、AM232236）為外群，構建系統發育樹。結果顯示，本研究中鑒定到的腐爛莖線蟲蟲卵rDNAITS區序列與B型腐爛莖線蟲OK415022序列的相似度最高，達99%以上，親緣關系最近（圖3）。這一結果表明，本研究從羊糞中分離到的蟲卵為B型腐爛莖線蟲蟲卵。

2.4"羊糞中腐爛莖線蟲蟲卵的孵化

將收集到的B型腐爛莖線蟲蟲卵在28℃培養箱內進行孵化。結果如圖4所示，從羊糞中分離的蟲卵可以孵化為2齡幼蟲。與對照組相比，羊糞中腐爛莖線蟲蟲卵的孵化率相對較低，對照組蟲卵孵化率在73%左右（圖5）。羊糞中收集的蟲卵在第3天時的孵化率僅有18%，孵化率隨時間延長有所增加，到第7、10天達到最高，為41%。較低的孵化率或許與蟲卵經過羊的腸道這一特殊環境有關。盡管孵化率較低，但仍說明羊糞中分離所得腐爛莖線蟲蟲卵能孵化為幼蟲，保存了生物學活性。

2.5"腐爛莖線蟲蟲卵室內接種

將接種線蟲卵懸液35"d后的馬鈴薯切開，如圖6所示，薯塊有典型的腐爛莖線蟲病為害癥狀，表現為干腐。說明經過了羊消化道后的腐爛莖線蟲仍然能夠為害馬鈴薯。

3"結論與討論

本研究結合陜西省榆林市馬鈴薯種植與羊養殖的種養一體化生產實踐，收集田間感染腐爛莖線蟲的馬鈴薯病薯飼喂山羊，在羊糞中成功檢測到了可以孵化并具有侵染致病能力的腐爛莖線蟲蟲卵，證明了腐爛莖線蟲蟲卵可以經過羊的消化道而不死亡。這一結果表明，羊糞可能作為腐爛莖線蟲蟲卵的傳播介質。同時，研究發現從羊糞中鑒定到的腐爛莖線蟲蟲卵為B型腐爛莖線蟲，與在陜西省榆林市危害馬鈴薯生產安全的主要病原腐爛莖線蟲種類一致［11］。相關研究首次為糞肥傳播腐爛莖線蟲的這一科學猜想提供了理論基礎，為進一步證實除種薯（苗）和土壤外，糞肥也是腐爛莖線蟲的主要傳播途徑提供了有力的支撐依據。

由于未經充分腐熟的羊糞是當地玉米種植過程中極為普遍的重要農田投入品，且當地存在長期連作玉米的田塊在初種馬鈴薯無病種薯后，突然暴發馬鈴薯腐爛莖線蟲病的現象，因此本研究的結果也為玉米田腐爛莖線蟲來源提供了科學依據。本研究中每只羊每天馬鈴薯薯塊攝入量為05"kg，蟲卵攝入量約為13"000個，每只羊每天糞便量為05"kg左右，糞便中蟲卵含量約為6"000個左右，有效孵化率按照30%計算，有效傳播率為138%左右。盡管有效傳播率較低，但長期使用未腐熟的羊糞作為肥料的粗放田間管理模式仍存在極大的腐爛莖線蟲傳播風險。今后相關種植戶在使用羊糞作為肥料前，應積極采取高溫等措施對羊糞進行充分腐熟等無害化處理，并在馬鈴薯收獲后徹底清理田間病爛薯，集中銷毀，以避免放養羊只取食田間遺留的病爛薯，對腐爛莖線蟲造成進一步的傳播。

參考文獻

［1］"STURHAN"D，"BRZESKI"M"W."Stem"and"bulb"nematodes，"Ditylenchus"spp，"manual"of"agricultural"nematology"［M］."NICKLE"W"R."Manual"of"agricultural"nematology."New"York："CRC"Press，"1991："423464.

［2］"趙洪海，"梁晨，"張浴，"等."腐爛莖線蟲（Ditylenchus"destructor"Thorne，1945）生物學研究進展［J］."生物技術通報，"2021，"37（7）："4555.

［3］"周忠，"馬代夫."甘薯莖線蟲病的研究現狀和展望［J］."雜糧作物，"2003（5）："288290.

［4］"BAKER"A"D，"BROWN"G"L，"JAMES"A"B."Relationships"of"fungi，"mites，"and"the"potatorot"nematode"［J］."Science，"1954，"119（3081）："9293.

［5］"段玉璽."植物線蟲學［M］."北京："科學出版社，"2011："172173.

［6］"章淑玲，"張紹升."甘薯莖線蟲與鐮孢菌對甘薯的復合侵染［J］."福建農林大學學報（自然科學版），"2007，"36（4）："361364.

［7］"王祥會，"焦玉霞，"孔德生，"等."腐爛莖線蟲在我國的風險評估和防控建議［J］."中國植保導刊，"2018，"38（10）："7780.

［8］"SUBBOTIN"S，"DEIMI"A"M，"ZHENG"Jingwu，"et"al."Length"variation"and"repetitive"sequences"of"internal"transcribednbsp;spacer"of"ribosomal"RNA"gene，"diagnostics"and"relationships"of"populations"of"potato"rot"nematode"Ditylenchus"destructor"Thorne，1945"（Tylenchida："Anguinidae）"［J］."Nematology，"2011，"13（7）："773785.

［9］"NI"Chunhui，"HAN"Bian，"LIU"Yonggang，"et"al，"Diagnosis"and"characterization"of"the"ribosomal"DNAITS"of"potato"rot"nematode"（Ditylenchus"destructor）"populations"from"Chinese"medicinal"herbs"［J］."Journal"of"Integrative"Agriculture，"2023，"22（6）："17631781.

［10］LI"Yunqing，"HUANG"Liqiang，"JIANG"Ru，"et"al."Molecular"characterization"of"internal"transcribed"spacer"（ITS）"of"ribosomal"RNA"gene，"haplotypes"and"pathogenicity"of"potato"rot"nematode"Ditylenchus"destructor"in"China"［J/OL］."Phytopathology"Research，"2022，"4："22."DOI："101186/s4248302200127z.

［11］劉晨，"楊藝煒，"王家哲，"等."陜西不同地區馬鈴薯腐爛莖線蟲的分離鑒定及同源性分析［J］."西北農業學報，"2020，"29（5）："793800.

［12］洪波，"張鋒，"李英梅，"等."馬鈴薯腐爛莖線蟲在陜西省的適生性分析［C］∥陳萬權."綠色生態可持續發展與植物保護——中國植物保護學會第十二次全國會員代表大會暨學術年會論文集."北京："中國農業科學技術出版社，"2017："7.

［13］楊帆，"趙遠征，"張曉明，"等."基于MaxEnt模型的腐爛莖線蟲在內蒙古地區適生區預測［J］."生物安全學報，"2024，"33（2）："161168.

［14］楊鵠溶，"李恩，"徐玉梅，"等."腐爛莖線蟲在山西省的適生區預測［J］."福建農林大學學報（自然科學版），"2022，"51（1）："3945.

［15］吳錦，"徐鵬剛，"劉永剛，"等."腐爛莖線蟲在馬鈴薯不同組織中的數量動態［J］."植物保護，"2023，"49（6）："253257.

［16］漆永紅，"李秀花，"馬娟，"等."馬鈴薯腐爛莖線蟲侵入甘薯部位以及在植株內的種群動態［J］."華北農學報，"2008（S1）："234237.

［17］彭靜文."防治馬鈴薯腐爛莖線蟲病的植物源藥劑及植物提取物篩選與評價［D］."呼和浩特："內蒙古農業大學，"2022.

［18］解子儀，"逯佩玉，"寧安琪，"等."兩種亞菊屬植物揮發油及其主要成分對馬鈴薯腐爛莖線蟲的觸殺活性［J］."中國生物防治學報，"2022，"38（3）："549554.

［19］馬娟，"李秀花，"高波，"等."噻唑膦與氨基寡糖素聯合應用對甘薯莖線蟲病的防治效果［J］."河北農業科學，"2022，"26（6）："5055.

［20］馬娟，"王容燕，"高波，"等."木醋液與噻唑膦聯合應用對甘薯莖線蟲病防治效果［J］."農藥，"2022，"61（9）："682686.

［21］漆永紅，"杜蕙，"曹素芳，"等."不同藥劑對甘薯莖線蟲病病原馬鈴薯腐爛莖線蟲的影響［J］."江蘇農業科學，"2011（1）："150152.

［22］王凌云，"王萌，"解曉紅，"等."甘薯莖線蟲病研究進展［J］."山西農業科學，"2018，"46（7）："12111215.

［23］江曙，"段金廒，"錢大瑋，"等."腐爛莖線蟲侵染機理及其防治技術體系的研究思路與方法［J］."江蘇農業科學，"2013，"41（11）："127130.

［24］陳立杰，"王旭，"段玉璽，"等."蔗糖離心法分離土壤線蟲的最佳條件篩選［J］."沈陽農業大學學報，"2007（6）："849851.

［25］周關發，"王樹春，"李志華，"等."伊維菌素和左旋咪唑驅除山羊消化道線蟲和體外寄生蟲的效果比較［J］."中國草食動物，"2008（1）："4849.

［26］宋敏忻，"張龍現."獸醫寄生蟲學［M］."北京："科學出版社，"2009.

［27］王寧，"李常."榆林市陜北白絨山羊消化道寄生蟲的流行病學調查［J］."農家參謀，"2020（8）："147.

［28］宛菲，"彭德良，"楊玉文，"等.馬鈴薯腐爛莖線蟲特異性分子檢測技術研究［J］."植物病理學報，"2008，"38（3）："263270.

［29］付博，"王家哲，"任平，"等."陜西榆林地區馬鈴薯腐爛莖線蟲的特異性分子鑒定［J］."陜西農業科學，"2020，"66（3）："4447.

［30］宮衛波，"蔣繼志，"王興哲."甘薯莖線蟲致病物質的初步研究［J］."華北農學報，"2008（1）："204206.

（責任編輯：楊明麗）