海南省哈密瓜根結線蟲病原種類鑒定

摘要

為明確海南省哈密瓜根結線蟲病的發生情況及病原種類，2023年4月在海南哈密瓜主產區進行隨機調查采樣，并通過形態學和分子生物學技術對病原線蟲種類進行鑒定。結果表明，哈密瓜根結線蟲病在海南4個市縣的11個調查點均有發生，其中東方好瑞村41采樣點植株發病最嚴重，根結等級為5級。通過2齡幼蟲形態測量和雌蟲會陰花紋形態比對，結合線蟲28S"rDNA"D2D3區段序列和SCAR特異性引物鑒定，最終鑒定出南方根結線蟲Meloidogyne"incognita、花生根結線蟲M.arenaria和象耳豆根結線蟲M.enterolobii，其中南方根結線蟲在8個調查點有檢出，個別點位出現南方根結線蟲混合象耳豆根結線蟲或花生根結線蟲的情況。南方根結線蟲為海南省哈密瓜上的主要病原線蟲種類。

關鍵詞

哈密瓜;"根結線蟲;"種群鑒定;"海南省

中圖分類號：

S"432.45

文獻標識碼："A

DOI："10.16688/j.zwbh.2023605

Species"identification"of"rootknot"nematodes"infecting"Cucumis"melo"var."saccharinus"in"Hainan"province

WANG"Mengping1，2，"ZHAO"Jing1，2*，"XU"Huanru1，2，"DING"Xiaofan1，"LIU"Tong1，2

（1."Key"Laboratory"of"Green"Prevention"and"Control"ofnbsp;Tropical"Diseases"and"Pests，"Ministry"of"Education，"

School"of"Tropical"Agriculture"and"Forestry，"Hainan"University，"Haikou"570228，"China;"2."Sanya"Institute"

of"Breeding"and"Multiplication，"Hainan"University，"Sanya"572025，"China）

Abstract

In"order"to"explore"the"occurrence"of"the"rootknot"nematode"disease"of"Cucumis"melo"var."saccharinus"and"understand"the"species"of"nematode"in"Hainan"province，"the"disease"occurrence"was"investigated"and"the"pathogens"from"samples"randomly"collected"from"the"main"producing"area"in"Hainan"in"April，"2023"were"identified"using"morphology"and"molecular"biology"methods."The"results"showed"that"the"rootknot"nematode"disease"occurred"in"all"the"11"investigated"places，"and"nematode"disease"was"most"severe"at"sampling"point"41"in"Haorui"village，"Dongfang"city，"with"rootknot"grade"of"five."Meloidogyne"incognita，"M.arenaria"and"M.enterolobii"were"identified"based"on"morphological"characteristics"of"secondstage"juveniles"and"female"perineal"pattern"in"combination"with"28S"rDNA"D2D3"and"SCAR"sequences."M.incognita"was"the"most"widespread"and"was"detected"at"eight"sampling"sites."Mixed"populations"of"M.incognita"and"M.enterolobii"or"M.incognita"and"M.arenaria"were"happened."The"above"results"indicate"that"M.incognita"is"the"dominant"population"of"rootknot"nematode，"which"will"provide"a"theoretical"basis"for"the"effective"control"of"rootknot"nematodes"on"Cucumis"melo"var."saccharinus"in"Hainan"province.

Key"words

Cucumis"melo"var."saccharinus;"rootknot"nematode;"species"identification;"Hainan"province

哈密瓜Cucumis"melo"var."saccharinus（Hami"cantaloupe）是甜瓜的一個變種，素有“瓜中之王”的美譽。海南光熱資源豐富，冬春季節尤為適宜哈密瓜的種植，哈密瓜也成為反季瓜菜中重要的經濟作物之一。據海南省農業廳統計，2017年-2018年海南哈密瓜種植面積達10"005"hm2，產量不斷增長，經濟效益日益增加，已經成為增加農民經濟收入的重要來源［1］。

在所有植物寄生線蟲中，根結線蟲Meloidogyne"spp.是對作物造成經濟損失最嚴重的一類［2］。首先，它的寄主范圍非常廣，可侵染蔬菜、糧食作物、果樹和經濟作物等3"000多種植物，每年在全球范圍內造成的經濟損失高達數十億美元［3］。其次，根結線蟲病原種類豐富，目前已報道的有100余種，其中南方根結線蟲M.incognita、爪哇根結線蟲M.javanica、花生根結線蟲M.arenaria和北方根結線蟲M.hapla是最重要的4種根結線蟲，發生范圍最為廣泛，對經濟的影響也最大［4］。北方根結線蟲主要分布在寒溫帶地區，在我國北方地區有報道發生［56］。近年來，象耳豆根結線蟲M.enterolobii病害的發生逐年攀升，已經逐漸成為海南省、廣東省、福建省等華南地區根結線蟲的主要類群。2015年龍海波等［7］對海南省18個市縣的根結線蟲進行鑒定后發現象耳豆根結線蟲已經在海南省的蔬菜、番石榴、哈密瓜和棗樹等作物上廣泛發生。陸秀紅等［6］在廣西賀州的梔子上也分離獲得象耳豆根結線蟲，楊芳等［8］從遼寧、吉林、黑龍江和寧夏的水稻樣本中均分離獲得象耳豆根結線蟲，說明象耳豆根結線蟲的發生正在北移，發病面積也在逐漸擴大。

海南省哈密瓜每年種植三造，長期大面積連作導致病蟲害發生嚴重，其中根結線蟲的危害較為突出。沿海地區的土壤松軟透氣，結合海南省潮濕溫暖的氣候條件使線蟲的發生呈現逐年加重的局面。目前還沒有海南省哈密瓜根結線蟲種群鑒定的相關研究，因此本研究對海南省部分哈密瓜種植區進行發病情況調查和樣品采集，主要通過形態學和分子生物學手段對其種群進行鑒定，以期為哈密瓜根結線蟲的高效防控提供理論依據，為哈密瓜產業的健康發展保駕護航。

1"材料與方法

1.1"哈密瓜根結線蟲病調查

2023年4月對海南省東方市、昌江黎族自治縣、樂東黎族自治縣和陵水黎族自治縣幾個哈密瓜主要種植區的11個種植大棚進行發病情況調查，每個點調查10株，觀察植株地上部癥狀，挖開表層土觀察根部是否有根結，將有發病癥狀的植株根系拔出，查看根系發病情況，根據劉順曉［9］對根結的分級標準統計發病情況，0級：所有須根無根結;1級：少數須根有根結，根結百分率小于11%;2級：少數根結相互連接，根結百分率11%～30%;3級：須根有較多根結，1/2以下根結相互連接，根結百分率31%～50%;4級：1/2以上根結相互連接，根結百分率51%～75%;5級：根結互相連接成須根團，根結百分率76%～100%。

1.2"樣品采集

挖取發病植株根部裝入自封袋中，帶回實驗室備用，共帶回樣本45份。

1.3"形態學鑒定

挑取根上卵囊置于盛有無菌蒸餾水的培養皿中，于25℃恒溫培養箱中孵化2～3"d，獲得大量2齡幼蟲。每個采樣點挑取2齡幼蟲20條，置于盛有蒸餾水的載玻片上，用酒精燈外焰加熱，每2～3"s觀察蟲體是否死亡，對死亡的線蟲進行形態學觀察，分別測量體長、口針長度、尾長等形態參數并拍照。用鑷子從根系中分離成熟雌蟲放置于清水中，會陰花紋制作參照張紹升［10］的方法進行，之后置于光學顯微鏡下觀察并拍照。

1.4"分子生物學鑒定

1.4.1"線蟲DNA提取

每個采樣點選取10條2齡幼蟲進行分子生物學鑒定。參照萬新龍等［11］的方法略作修改，挑取新孵化的單條2齡幼蟲至無菌水中清洗2～3次。離心沉淀后置于液氮中速凍30"s，立刻轉入37℃水浴加熱30"s，整套操作重復3次。繼續加入8"μL"10×PCR"buffer（TaKaRa，Mg2+"free）和2"μL"蛋白酶K"（20"mg/mL），輕彈混勻后在PCR儀中65℃溫育90"min，95℃保溫10"min，得到DNA粗提液用于PCR擴增或置于－20℃冰箱保存備用。

1.4.2"目的片段PCR擴增

先用28S"rDNA"D2D3區段通用引物D2A：5′ACAAGTACCGTGAGGGAAAGTTG3′;D3B：5′TCGGAAGGAACCAGCTAC3′（退火溫度55℃）［12］擴增。之后再利用根結線蟲特征序列擴增區域（SCAR）標記進行鑒定。南方根結線蟲MiF：5′GTGAGGATTCAGCTCCCCAG3′和MiR：5′ACGAGGAACATACTTCTCCGTCC3′（退火溫度62℃）［13］;象耳豆根結線蟲MK7F：5′GATCAGAGGCGGGCG

CATTGCGA3′和MK7R：5′CGAACTCGCTCG

AACTCGAC3′（退火溫度62℃）［14］;花生根結線蟲Far：5′TCGGCGATAGAGGTAAATGAC3′和Rar：5′TCGGCGATAGACACTACAACT3′（退火溫度52℃）［15］;以及爪哇根結線蟲Fjav：5′GGTGCGCG

ATTGAACTGAGC3′和Rjav：5′CAGGCCCTTC

AGTGGAACTATAC3′（退火溫度60℃）［15］。反應體系：線蟲基因組DNA模板2"μL，上、下游引物（10"μmol/L）各1"μL，2×Taq"Master"Mix"12.5"μL，雙蒸水8.5"μL。PCR擴增條件為：95℃預變性4"min;95℃變性30"s，退火溫度退火30"s，72℃延伸30"s，共35個循環;72℃延伸5"min。以無菌水替換DNA的模板為陰性對照。PCR產物經過1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測之后，送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，所獲得的序列與GenBank數據庫中根結線蟲的序列進行比對。

2"結果與分析

2.1"哈密瓜根結線蟲病發生情況

哈密瓜被根結線蟲侵染后，地上部分表現為明顯的黃化、萎蔫，類似肥水不足，發病嚴重的甚至整株枯死（圖1a，b）。受害根系生長受抑制，根部有明顯結節（圖1c，d），根結形狀大小不一，嚴重的形成念珠狀，整個根系腫大（圖1c），后期變為褐色，嚴重時出現腐爛。從棚中找到地上部具有明顯黃化、萎蔫癥狀的植株，再拔出根系檢查根結等級，其中東方板橋鎮好瑞村的24號調查地發病最為嚴重，根結等級最高為5級，其次為東方板橋鎮好瑞村的23號調查地，根結等級最高為4級（表1）。

2.2"線蟲的形態學特征

對各取樣點孵化的2齡幼蟲和雌蟲會陰花紋進行形態學觀察。來自東方21和22的2齡幼蟲為蠕蟲形，頭冠較平，口針基球圓形、縊縮，口針中等寬（圖2a）。體長（396.06±5.81）"μm（331.26～438.26"μm），口針長（11.11±0.28）"μm（8.71～14.46"μm），尾長（50.42±1.31）"μm（41.49～60.41"μm）。會陰花紋背弓較高，線紋清楚，由粗到細，與南方根結線蟲會陰花紋相似（圖2d）。從昌江海尾鎮五大村采樣點12分離得到的2齡幼蟲頭冠明顯，前端平，口針基球圓形、縊縮，口針纖細（圖2b）。體長（404.89±4.34）"μm（356.61～426.14"μm），口針長（11.35±0.27）"μm（9.23～13.47"μm），尾長（53.33±1.01）"μm（47.83～62.00"μm）。會陰花紋橢圓形，背弓較高，線紋緊密，為細密的波浪形，未見側線，與象耳豆根結線蟲較為相似（圖2e）。來自陵水42和44采樣點的2齡幼蟲蠕蟲形，頭冠平，體長明顯大于南方根結線蟲，口針錐部和桿部較寬（圖2c）。體長（418.30±4.64）"μm（378.38～476.01"μm），口針長（11.3±0.26）"μm（9.54～14.13"μm），尾長（55.29±1.24）"μm（45.99～66.44"μm）。會陰花紋背弓中等高度，無側線，有短、不規則線紋構成的刻痕，無明顯紋渦，與花生根結線蟲形態特征相似（圖2f）。

2.3"分子生物學鑒定結果

通過提取單條2齡幼蟲DNA，采用通用引物及特異性引物進行擴增，從所采樣品中鑒定得到南方根結線蟲、象耳豆根結線蟲和花生根結線蟲3種根結線蟲。經過通用引物D2A/D3B擴增出長度為762"bp的單一條帶后再進行特異性引物擴增。用南方根結線蟲特異引物擴增，從昌江11，東方21、22、23、24，樂東31，陵水41、43中擴增得到長度為950"bp的單一條帶（圖3a）;用花生根結線蟲特異性引物從昌江11，陵水42、44擴增得到長度為420"bp的單一條帶（圖3a）;用象耳豆根結線蟲的特異性引物擴增，從昌江12，東方23、24中擴增得到長度為520"bp的單一條帶（圖3b）。用爪哇根結線蟲特異性引物擴增，所有種群均無條帶出現。結果表明，東方21、22、樂東31、陵水41和43為南方根結線蟲;昌江12為象耳豆根結線蟲;陵水42和44為花生根結線蟲;昌江11為南方根結線蟲和花生根結線蟲混合種群;東方23和24為南方根結線蟲和象耳豆根結線蟲混合種群（表1）。共檢測線蟲樣本110份，其中南方根結線蟲的檢出率為59.1%，花生根結線蟲檢出率為20.9%，象耳豆根結線蟲檢出率為20.0%。

3"結論與討論

本研究結合形態學和分子生物學的方法對海南省4個市縣11個采樣點的哈密瓜根結線蟲進行鑒定，結果發現南方根結線蟲檢出的頻率最高，為哈密瓜上主要種群。此外還檢測出象耳豆根結線蟲和花生根結線蟲，尚未檢測出爪哇根結線蟲。

海南省適宜的氣候條件和特殊的栽培制度造成根結線蟲病害的發生越來越嚴重。2012年賈本凱等［16］對海南島茄果類根結線蟲種群進行鑒定，從茄子、辣椒、番茄等茄果檢測到南方根結線蟲和象耳豆根結線蟲的頻率相當。2020年李周容等［4］對海南省蔬菜根結線蟲種群分布進行研究，發現18個市縣的蔬菜種植區都有根結線蟲的發生，其中檢測頻率最高的為象耳豆根結線蟲，其次為南方根結線蟲和爪哇根結線蟲。這些研究說明象耳豆根結線蟲的種群數量正在慢慢增加，將逐漸代替南方根結線蟲成為海南主要根結線蟲類群。在哈密瓜和甜瓜上也都曾經檢測到象耳豆根結線蟲［7，"17］，為了明確目前哈密瓜根結線蟲的主要類群，我們對海南省4個市縣11個哈密瓜瓜棚中根結線蟲進行鑒定，結合雌蟲會陰花紋特征和特異性引物擴增情況，最終檢測出南方根結線蟲、象耳豆根結線蟲和花生根結線蟲，其中南方根結線蟲占據主要類群。與南方根結線蟲相比，象耳豆根結線蟲可以突破植株的抗病性，所以風險指數更高［18］，針對象耳豆根結線蟲侵染面積逐漸擴大的問題需要引起更多的關注。

哈密瓜是海南省重要的經濟作物之一，產值較高，甜瓜根系較發達，主根與大量側根向土壤周圍蔓延，但根系的再生能力較差，因此一旦根系受損會顯著影響植株的生長甚至死亡，根結線蟲主要危害植株根部，造成地上部分生長緩慢，果實小質量差，對經濟收入的影響較大。在線蟲的防治方面，針對南方根結線蟲的研究較為深入，對象耳豆根結線蟲的研究相對較少。目前，化學防治依然是田間生產中最為普遍的防治手段，使用較多的藥劑為氟吡菌酰胺、阿維菌素和噻唑膦等。張伯虎等［19］對西瓜上的南方根結線蟲進行殺線蟲藥劑篩選，發現阿維菌素b2的防效優于噻唑膦。楊雪婷等［20］測定了3種常用藥劑對海南省象耳豆根結線蟲2齡幼蟲和卵的抑殺活性，結果表明，3%阿維菌素微乳劑對2齡幼蟲觸殺作用最強，對卵孵化的抑制率也最高;其次為41.7%氟吡菌酰胺懸浮劑以及20%噻唑膦水乳劑。李周容等［17］發現對海南省香瓜上的象耳豆根結線蟲觸殺活性最高的是95%阿維菌素原藥，而95%氟吡菌酰胺原藥活性最低。黃垂雄［21］的藥劑篩選結果表明，20%噻唑膦水乳劑和10%阿維菌素懸浮劑對海南省哈密瓜根結線蟲的防效最高，其次為41.7%氟吡菌酰胺懸浮劑。無論針對南方根結線蟲還是象耳豆根結線蟲，阿維菌素的防效在化學藥劑中均位居前列，說明海南省根結線蟲對阿維菌素較為敏感，尚未產生抗藥性，因此防治甜瓜根結線蟲病害可選用阿維菌素。

瓜農通常在播種前對土壤進行藥劑處理，在種植過程中一旦發現有根結出現就會立刻混合施用多種藥劑［22］，由于部分瓜農對線蟲相關知識了解匱乏，認為只要根上有根結就是線蟲沒有防治成功，會選擇繼續加大藥量。因此，化學藥劑的長期、不合理使用造成環境污染嚴重，果實藥劑殘留問題增加，土壤環境健康受損，線蟲抗藥性增強，防治越發困難。將生防菌劑和化學藥劑復合使用，可以在保證防效的前提下減少化學藥劑的使用。黑雅婭等［23］將婁徹氏鏈霉菌Streptomyces"rochei"ZZ9發酵液與阿維菌素復配，當二者體積比為3∶1時對南方根結線蟲2齡幼蟲殺線蟲活性最佳，將阿維菌素藥量減少75%，且活性與單一使用阿維菌素相比提高了23.84%。將3%甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽（甲維鹽）微乳劑與線蟲寄生真菌淡紫紫孢菌Purpureocillium"lilacinum（PLHN）復配使用，其中0.6"mg/L甲維鹽（減量25%）+50%PLHN復配組合對象耳豆根結線蟲盆栽防效最佳，防治效果與全量甲維鹽相當，還能促進番茄植株的生長［24］。因此未來可繼續篩選與阿維菌素具有良好復配效果的生防菌劑，從而達到減藥不減效的良好效果。

因此，針對海南省哈密瓜根結線蟲發生嚴重的問題，除了繼續挖掘高效、環保的生防藥劑與阿維菌素進行復合混配之外，還需要對瓜農進行農技培訓，規范藥劑使用，在減少化學農藥使用的同時還可以減輕病害發生。

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