云南常見馬鈴薯品種對馬鈴薯金線蟲的抗性及其與抗性基因H1的相關性

摘要

為明確云南省常見馬鈴薯品種對馬鈴薯金線蟲Globodera"rostochiensis抗性的差異，選擇云南省常見或生產上主要推廣的馬鈴薯品種25個，參考Koroleva的評價方法，結合抗性分子標記N146、N195、57R、TG432、Gro141和抗性基因H1的相對表達量，評價馬鈴薯品種對金線蟲的抗性，分析抗性與抗性基因H1表達量的相關性。結果顯示：供試的25個品種中，有7個品種根系上馬鈴薯金線蟲的孢囊或雌蟲≤5個，表現抗性，其他品種根系上的孢囊或雌蟲大于5個，表現為易感;抗性分子標記檢測發現，有10個品種含有抗馬鈴薯金線蟲基因H1;對這10個品種的H1基因相對表達量的檢測結果顯示，接種馬鈴薯金線蟲后‘V7’‘黃金薯’‘會薯19號’‘宣薯5號’‘云薯202’‘云薯304’‘云薯505’"7個品種的H1基因較未接種時上調表達，而‘P14187’‘會薯15號’‘希森3號’3個品種的H1基因下調表達，攜帶H1基因的馬鈴薯品種是否對金線蟲有抗性與抗性基因H1表達量呈正相關。研究結果為抗金線蟲馬鈴薯品種選育與應用及進一步闡明馬鈴薯抗金線蟲的分子機制奠定了基礎。

關鍵詞

馬鈴薯品種;"馬鈴薯金線蟲;"H1基因;"抗性

中圖分類號：

S"435.32

文獻標識碼："A

DOI："10.16688/j.zwbh.2024175

The"correlations"between"the"resistance"of"common"potato"varieties"to"Globodera"rostochiensis"and"the"H1"gene"in"Yunnan"province

DUAN"Jinfeng，"YANG"Yanmei，"LIU"Yuzhu，"LI"Qiankun，"HU"Xianqi*

（State"Key"Laboratory"for"the"Conservation"and"Utilization"of"Biological"Resources"in"Yunnan，"

College"of"Plant"Protection，"Yunnan"Agricultural"University，"Kunming"650201，"China）

Abstract

To"identify"the"differences"in"resistance"among"common"potato"varieties"to"Globodera"rostochiensis"in"Yunnan"province，"25"varieties，"including"both"common"and"widely"cultivated"ones，"were"selected"for"evaluation"using"Koroleva’s"method."In"this"study"the"molecular"markers"N146，"N195，"57R，"TG432，"Gro141，"and"the"H1"resistance"gene"were"employed"to"evaluate"resistance"levels"and"analyze"the"correlation"between"resistance"and"H1"gene"expression."The"results"showed"that"among"the"25"varieties"tested，"seven"varieties"exhibited"resistance，"with"less"than"five"cysts"or"females"of"G.rostochiensis"on"their"root"systems，"while"the"remaining"varieties，"with"more"than"five"cysts"or"females，"were"susceptible."Molecular"marker"analysis"revealed"that"ten"varieties"containing"the"G.rostochiensis"resistance"gene"H1."Further"investigation"into"the"relative"expression"of"the"H1"gene"after"inoculation"with"G.rostochiensis"showed"that"in"seven"varieties，"namely"‘V7’"‘Huangjinshu’"‘Huishu"19’"‘Xuanshu"5’"‘Yunshu"202’"‘Yunshu"304’，"and"‘Yunshu"505’，"the"H1"gene"expression"was"upregulated"compared"to"uninoculated"controls."However，"in"three"varieties"‘P14187’"‘Huishu"15’"and"‘Xisen"3’，"the"H1"gene"expression"was"downregulated."The"study"concluded"that"the"resistance"of"potato"varieties"carrying"the"H1"gene"were"positively"correlated"with"H1"gene"expression."These"findings"provide"foundation"for"selecting"and"applying"potato"varieties"resistant"to"G.rostochiensis"and"for"further"elucidating"the"molecular"mechanisms"underlying"potato"resistance"to"G.rostochiensis.

Key"words

potato"varieties;"Globodera"rostochiensis;"H1"gene;"resistance

馬鈴薯Solanum"tuberosum是重要的糧食作物之一，在云南省種植面積僅次于玉米和水稻，云南省馬鈴薯在全國面積和總產量均居前4名，是中國馬鈴薯的主要生產地之一［12］。

馬鈴薯孢囊線蟲（potato"cyst"nematode，PCN）是為害馬鈴薯等茄科植物的病原線蟲［3］，主要包括馬鈴薯金線蟲Globodera"rostochiensis和馬鈴薯白線蟲G.pallida，分別在全世界79個和55個國家有發生和分布，100多個國家將其列為重要的對外檢疫性有害生物，也是我國重要的進境檢疫性有害生物［47］，它們的為害可以造成馬鈴薯產量損失19%～80%［8］。2018年-2020年調查發現，在中國貴州省、四川省和云南省7縣（區）的局部馬鈴薯產區發現了馬鈴薯金線蟲［913］。

PCN的卵可以在孢囊內休眠存活很多年，且它們的天敵很少見，這意味著一旦傳入、定殖就很難根除。面對PCN的為害，當前的防控方法主要是植物檢疫、非寄主植物輪作、種植抗性品種、生物防治、化學防治等，種植抗性品種被認為是保護馬鈴薯等茄科作物免受PCN侵害最經濟、環保和有效的方法［14］。

研究表明，對于馬鈴薯金線蟲致病型Ro1～Ro5，最常見的是引入單一顯性基因H1控制［1516］，H1基因座位于馬鈴薯Ⅴ號染色體長臂末端，通過激活馬鈴薯的過敏反應使其對馬鈴薯金線蟲致病型Ro1和Ro4表現出抗性［1718］。Solanum"spegazzinii"Ⅶ號染色體上的Gro1基因對G.rostochiensis有廣譜抗性［19］，從S.spegazzinii的Ⅹ、Ⅺ和Ⅲ號染色體上鑒定到3個數量性狀基因座（quantitative"trait"loci，"QTL）Gro1.2、Gro1.3和Gro1.4也參與了對馬鈴薯金線蟲的抗性［20］，位于Ⅴ號染色體的短臂上QTL"Grp1對馬鈴薯金線蟲和馬鈴薯白線蟲均具有抗性［21］。

本研究選用云南省生產上主要推廣的馬鈴薯品種25個，在溫室接種進行抗馬鈴薯金線蟲病評價，開展相關抗性基因分子檢測，并以篩選出的具有H1抗性基因的馬鈴薯品種為研究材料，采用qPCR技術，檢測受到馬鈴薯金線蟲侵染后，馬鈴薯品種中H1基因的表達情況及其對金線蟲的抗性與抗性基因H1表達量的相關性。旨在為抗金線蟲馬鈴薯品種選育、進一步解析馬鈴薯抗金線蟲的分子機制、應用抗病品種防治馬鈴薯金線蟲病提供科學依據。

1"材料與方法

1.1"供試材料

供試馬鈴薯金線蟲的孢囊分離自云南省昭通市昭陽區靖安鎮（27.59°N，103.69°E）采集的病土。

供試25個馬鈴薯品種收集于相關種薯生產基地，分別為：‘C米’‘P14187’‘V7’‘合作88’‘荷蘭15號’‘黃金薯’‘會薯2號’‘會薯15號’‘會薯16號’‘會薯19號’‘麗薯6號’‘青薯9號’‘希森3號’‘宣薯4號’‘宣薯5號’‘宣薯6號’‘宣薯8號’‘云薯108’‘云薯202’‘云薯304’‘云薯505’‘云薯901’‘云薯902’‘昭薯6號’‘專心烏’。

1.2"試驗方法

1.2.1"馬鈴薯對馬鈴薯金線蟲病的抗性鑒定

從云南省昭通市靖安鎮松杉村西魁坪子采集病土，采用漂浮法［22］分離馬鈴薯金線蟲孢囊，在體視顯微鏡下將豐滿的孢囊挑出，用0.5%"NaClO表面消毒3～5"min，再用無菌水沖洗3～4次，放入4℃冰箱里保濕放置8～10周。

將馬鈴薯種植在體積為1"L的塑料盆中，每盆接種馬鈴薯金線蟲孢囊約100個，合計每100"mL土壤接種2齡幼蟲（the"second"stage"juvenile，J2）和卵3"000～3"500個。接種量測算方法：隨機挑選50個孢囊，切開計數孢囊中有效卵和J2的數量，得出每個孢囊有效卵和J2的平均值為304.4。待接種馬鈴薯金線蟲孢囊后75"d（馬鈴薯出苗后約2個半月），拔出馬鈴薯并輕輕抖落根上的土壤，觀察附著在根上馬鈴薯金線蟲孢囊或雌蟲的數量，參考Koroleva［23］的評價方法調查發病情況：根上有0～5個孢囊或雌蟲為抗性;根上有6個及更多孢囊或雌蟲為易感。

1.2.2"抗病基因的分子檢測

馬鈴薯出苗后15"d，采集馬鈴薯葉片，使用廣譜植物基因組DNA快速提取試劑盒（購自北京博邁德生物技術有限公司）提取各品種葉片基因組DNA，置于-20℃保存備用。抗病基因H1、Gro1、Grp1等相關引物［24］（表1）由昆明擎科生物有限公司合成。PCR反應體系（15"μL）：2×Taq"PCR"Master"Mix"7.5"μL，10"μmol/L上、下游引物各0.25"μL，模板DNA"1"μL，超純水補足至15"μL。PCR擴增程序見表2。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測"PCR擴增產物并在凝膠成像系統中觀察并拍照。

1.2.3"實時熒光定量PCR檢測H1基因的相對表達量

在"NCBI"數據庫下載馬鈴薯的actin基因（內參基因）和H1基因標記57R的等位基因57R887［26］的序列，根據抗病基因CDS序列，使用Primer"3"Plus設計特異性引物（表3），引物序列通過昆明擎科生物有限公司合成。

根據1.2.2的結果，選擇攜帶H1基因的馬鈴薯品種為供試材料，

待馬鈴薯出苗后65"d，采集各品種馬鈴薯的根系，DEPC處理后用于提取馬鈴薯根系總RNA。

采用AG"RNAex"Pro"RNA提取試劑（湖南艾克瑞生物工程有限公司）提取馬鈴薯根系總RNA。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，核酸質量分析儀對RNA的A260/A280、A260/A230以及濃度進行測定。按照Evo"MMLV"RT"Mix"Kit"with"gDNA"Clean"for"qPCR"Ver.2"（湖南艾克瑞生物工程有限公司）的兩步法，先去除gDNA，再將ＲNA反轉錄合成第1鏈cDNA，產物于-20℃保存備用。

采用SYBR"Green"Supermix"Pro"Taq"HS"qPCR"Kit（湖南艾克瑞生物工程有限公司）進行實時熒光定量PCR。反應體系為10"μL：2×SYBR"Green"Pro"Taq"HS"Supermix"5"μL，ROX"reference"Dye"0.2"μL，10"μmol/L"正、反向引物各0.4"μL，cDNA模板0.5"μL，RNase"free"water"3.5"μL，混勻離心后進行qPCR反應。反應程序為：95℃預變性2"min;95℃變性45"s，60℃退火30"s，72℃延伸1"min，40個循環。根據各樣品的熔解曲線驗證引物擴增的特異性，每個樣品重復3次，以未接種金線蟲的品種中H1基因的表達量為對照。

采用2-ΔΔCT法［25］計算H1基因的相對表達量。

1.2.4"馬鈴薯金線蟲的抗性水平與H1的相對表達量的相關性分析

在IBM"SPSS"26中使用點二列相關系數，對馬鈴薯金線蟲的抗性水平與抗性基因H1的相對表達量進行相關性分析。共30個樣本（10個馬鈴薯品種3個重復）參與了相關性分析，其中一列變量為H1基因的相對表達量，另一列變量為馬鈴薯金線蟲的抗性水平（對馬鈴薯金線蟲有無抗性），對馬鈴薯金線蟲有抗性賦值1，沒有抗性賦值0;相關系數的顯著性采用t檢驗，當Plt;0.05，相關性顯著。

1.3"數據分析

使用Excel對數據進行整理和統計，Graphpad"Prism"8.0.2進行圖表繪制。

2"結果與分析

2.1"馬鈴薯品種的抗病性鑒定

接種馬鈴薯金線蟲后75"d，取樣觀察馬鈴薯根上的線蟲孢囊量。結果發現，‘V7’‘黃金薯’‘宣薯5號’‘云薯202’‘云薯304’‘云薯505’‘會薯19號’等7個馬鈴薯品種在溫室盆栽試驗中，根系上的孢囊或雌蟲≤5個，表現出對馬鈴薯金線蟲有抗性;‘希森3號’‘P14187’‘會薯15號’‘C米’‘合作88’‘荷蘭15號’‘會薯2號’‘會薯16號’‘麗薯6號’‘青薯9號’‘宣薯4號’‘宣薯6號’‘宣薯8號’‘云薯108’‘云薯901’‘云薯902’‘昭薯6號’‘專心烏’等18個馬鈴薯品種在溫室盆栽試驗中，根系上的孢囊或雌蟲gt;5個及更多，對馬鈴薯金線蟲表現為易感（表4）。

2.2"在馬鈴薯品種中抗性基因的檢測結果

利用6個分子標記對供試的25個馬鈴薯品種進行馬鈴薯金線蟲抗性基因檢測，檢測結果見表4和圖1。其中GBSS基因的分子標記GBSS13為陽性對照。H1基因的3個分子標記N146、N195和57R在‘V7’‘黃金薯’‘希森3號’‘宣薯5號’‘云薯202’‘云薯304’‘云薯505’‘P14187’‘會薯15號’‘會薯19號’等10個馬鈴薯品種中被檢測出來。Grp1基因的分子標記TG432在25個馬鈴薯品種中均被檢測到，即在所有供試馬鈴薯品種全部含有Grp1基因，但是TG432的產物片段比文獻中所描述的大，超過了2"000"bp，重復試驗得到了相同的結果。Gro1基因的分子標記Gro141在25個馬鈴薯品種中都沒有檢測到，即所有供試馬鈴薯品種均不含Gro1基因的分子標記。表明Grp1、Gro1的分子標記不適合用于馬鈴薯金線蟲病抗性篩選。

2.3"攜帶抗性基因H1的馬鈴薯品種H1基因相對表達量

10個攜帶H1基因的馬鈴薯品種‘宣薯5號’‘云薯202’‘云薯304’‘會薯19號’‘黃金薯’‘V7’‘云薯505’‘希森3號’‘會薯15號’‘P14187’接種馬鈴薯金線蟲后H1基因相對表達量分別是未接種馬鈴薯金線蟲的34.47、3.11、2.25、5.50、3.55、2.61、8.16、0.31、0.22、0.93倍，其中‘希森3號’‘會薯15號’‘P14187’3個品種的H1基因相對表達量在接種馬鈴薯金線蟲后下調表達，另外7個品種上調表達（圖2）。結合前述接種試驗抗性實際表現，H1基因相對表達量上調的品種表現抗性，而下調的品種表現易感。

2.4"馬鈴薯品種對金線蟲的抗性水平與抗性基因H1相對表達量的相關性

在IBM"SPSS"26中，采用點二列相關系數表示抗性基因H1相對表達量與馬鈴薯品種對金線蟲抗性的相關性，分析表明，攜帶H1基因的馬鈴薯品種是否對金線蟲表現抗性與抗性基因H1表達量的相關系數為0.378，呈正相關，相關性顯著（Plt;0.05）。

3"結論與討論

本研究參考Koroleva的評價方法［23］評價云南常見馬鈴薯品種對馬鈴薯金線蟲的抗性，發現馬鈴薯品種是否含有抗性基因相關分子標記與對馬鈴薯金線蟲是否有抗性存在一定的關系，但是對馬鈴薯金線蟲表現出抗性的原因是復雜的，分子標記檢測結果表明，遺傳和表型數據并不總是一致的。本研究中供試的25個品種有10個攜帶抗性基因H1，其中‘V7’‘黃金薯’‘會薯19號’‘宣薯5號’‘云薯202’‘云薯304’‘云薯505’7個品種在試驗中對馬鈴薯金線蟲表現出抗性，而‘P14187’‘會薯15號’‘希森3號’3個品種含有H1基因的分子標記，卻在試驗中對馬鈴薯金線蟲易感。Koroleva等［23］研究結果顯示，在供試的50個馬鈴薯品種中有46個品種含有抗性基因的分子標記且對馬鈴薯金線蟲表現出抗性，4個品種在含有抗性基因分子標記的情況下表現出易感，本研究結果與此類似。明會等［24］利用馬鈴薯孢囊線蟲抗性分子標記對馬鈴薯種質資源進行馬鈴薯金線蟲的抗性基因檢測，篩選到含有馬鈴薯金線蟲抗性基因H1的馬鈴薯品種（種質資源），本研究篩選到的含有抗性基因H1的馬鈴薯品種結果與其一致。李艷等［27］通過溫室和田間試驗，采用根球計數法、平均增殖率法和相對敏感性評價法及酸性品紅染色計數法，綜合評價馬鈴薯品種對金線蟲的抗性，評價出抗性表現穩定的馬鈴薯品種‘宣薯5號’和‘云薯505’，本研究也得到類似結果。上述結果表明，僅僅依靠抗性基因分子標記來判定馬鈴薯品種對金線蟲的抗性，存在一定局限，結合接種金線蟲的抗性鑒定試驗結果，有利于獲得更為真實的抗性信息。

本研究測定攜帶H1基因的馬鈴薯品種的H1基因相對表達量，分析抗性基因H1相對表達量與對金線蟲抗性的相關性。發現‘V7’‘黃金薯’‘會薯19號’‘宣薯5號’‘云薯202’‘云薯304’‘云薯505’7個品種在接種了金線蟲后較未接種H1基因上調表達，對馬鈴薯金線蟲表現出抗性，而‘P14187’‘會薯15號’‘希森3號’3個品種在接種了金線蟲后較未接種H1基因下調表達，對馬鈴薯金線蟲易感;馬鈴薯品種對金線蟲的抗性與抗性基因H1相對表達量相關性顯著，呈正相關。王賢等［28］研究表明抗病基因表達量越高的番茄品種，抗病能力也越強，并表現出正相關性，陳斌等［29］通過比較不同玉米品種接種紋枯病菌前后抗病相關基因表達量的變化，來鑒定抗病性，結果表明，抗病基因ZmPR1a的表達量變化與田間抗性結果相關，抗病品種的ZmPR1a基因相對表達量高于對照，而感病品種的ZmPR1a基因相對表達量低于對照，本研究所得結果與其相似。這表明，攜帶抗性基因的品種其抗性是否表現，與受到病原物侵害時抗性基因的表達量密切相關，相對表達量高于對照可能就表現抗性，相對表達量低于對照則表現為易感，抗性基因相對表達量與品種的實際抗性表現呈正相關。

本研究將人工接種馬鈴薯金線蟲進行抗性鑒定與分子標記以及抗性基因的表達水平相結合，并分析馬鈴薯品種對金線蟲抗性與抗性基因H1的相對表達量的相關性，是一個新的抗性評價思路，下一步將擴大供試品種的數量、構建完善的評價體系。本研究結果對抗金線蟲馬鈴薯品種選育、深入揭示馬鈴薯抗金線蟲的分子機制、利用抗病品種防治馬鈴薯金線蟲病有一定指導作用。

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（責任編輯：楊明麗）