凍融循環對土壤細菌群落結構和代謝功能的影響

摘要［目的］探究凍融循環對土壤細菌群落多樣性、組成以及潛在代謝功能的影響。［方法］將采集的土壤進行不同凍融循環處理，通過高通量測序技術和Tax4Fun功能預測分析細菌群落多樣性和潛在代謝功能的變化。［結果］凍融處理后，土壤理化性質與對照組差異明顯，土壤細菌群落多樣性隨著凍融次數的增加逐漸降低；所有處理組中放線菌門（Actinobacteria）占主導地位，其次是變形菌門（Proteobacteria）和酸桿菌門（Acidobacteria）；試驗土壤中總共發現了277種功能途徑，關于新陳代謝的功能途徑占所有功能的64.60%～65.20%，占主要地位。凍融循環次數增加不僅會改變細菌群落結構，還會影響其代謝過程。［結論］該研究為探究北方季節性凍融極端環境下土壤微生物群落代謝能力提供理論基礎。

關鍵詞凍融循環；高通量測序；微生物；群落結構；代謝功能

中圖分類號Q89"文獻標識碼A"文章編號0517-6611（2024）24-0062-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.24.015

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

EffectsofFreeze-thawCyclesonSoilBacterialCommunityStructureandMetabolicFunction

YANGTong，DUANYao-ting，LIUYong-qietal

（SchoolofEnergyandEnvironment，InnerMongoliaUniversityofScienceandTechnology，Baotou，InnerMongolia014010）

Abstract［Objective］Toexploretheeffectsoffreeze-thawcyclesonthediversity，compositionandpotentialmetabolicfunctionofsoilbacterialcommunity.［Method］Thecollectedsoilwastreatedwithdifferentfreeze-thawcycles，weusedhigh-throughputsequencingtechniquesandTax4Funfunctionalpredictiontoanalyzechangesinbacterialcommunitydiversityandpotentialmetabolicfunction.［Result］Afterfreeze-thawtreatment，soilphysicalandchemicalpropertiesweresignificantlydifferentfromcontrolgroup（Plt;0.05），thesoilbacterialcommunitydiversitydecreasedgraduallywiththeincreaseoffreeze-thawtimes，andthefreeze-thaw8cycles（C3）treatmentdecreasedby2.54%;Actinobacteriadominated（30.91%，32.75%and33.89%），followedbyProteobacteriaandAcidobacteria.Atotalof277functionalpathwayswerefoundintheexperimentalsoil，andthefunctionalpathwaysrelatedtometabolismaccountedfor64.60%-65.20%ofallfunctions，accountingforthemainposition.Theincreaseoffreeze-thawcyclesnotonlychangedthebacterialcommunitystructure，butalsoaffecteditsmetabolicprocess.［Conclusion］ItprovidedatheoreticalbasisforstudyingthemetaboliccapacityofsoilmicrobialcommunitiesinextremeseasonalfreezingandthawingenvironmentsinnorthernChina.

KeywordsFreeze-thawcycle;High-throughputsequencing;Microorganisms;Communitystructure;Metabolicfunctions

土壤環境中的微生物群落是多樣化的，它們不斷地推動著土壤生態系統進程^［1］，在土壤物質循環過程中起著不可代替的作用^［2］。凍融作用是一種由季節或晝夜溫度變化所造成的土壤凍結和解凍的反復過程，是高緯度地區的一種常見現象^［3-4］。凍融作用可以使土壤結構和物質發生明顯的變化^［5］，例如，凍融作用可以降低土壤團聚體的穩定性^［6］，土壤孔隙度也會增大^［7-8］，同時也會促使重金屬形態變化^［9］。21世紀初，美國五大湖地區根據全球194個國家氣象站的數據總結發現，1951—2000年，由于全球變暖導致冬季積雪減少，平均氣溫升高了1.5 ℃^［10］，土壤溫度也降低。積雪減少導致的積雪隔熱性的降低，會降低土壤溫度改變凍融循環的頻率和強度^［11-12］，并改變土壤每年被凍結的天數^［13-15］。土壤微生物群落結構和活動均受生物和非生物因素所控制^［16］，全球凍融格局的變化勢必會使土壤微生物群落結構和功能發生變化^［17］。然而目前關于凍融循環作用對土壤細菌群落代謝功能影響的研究比較匱乏。

目前常見的高通量測序技術是探究微生物群落系統發育和結構組成的有力工具，但無法對微生物群落代謝潛力進行分析。Langille等^［18］使用PICRUSt預測16S rRNA基因序列的微生物群落KEGG Ortholog功能譜，這種算法通過16S rRNA基因序列將操作分類單元（OTU）與基因含量聯系起來，在腸道菌群功能預測方面有一定優勢；但是當微生物群落中含有未充分表征的分類時，這種分析方法可能會出現問題。Tax4Fun是一種基于16S的細菌群落功能預測分析工具。與PICRUSt相比，Tax4Fun的功能預測與宏基因組圖譜具有更高的相關性^［19］。因此，該研究將微生物群落測序技術和Tax4Fun功能預測方法結合，分析了凍融循環次數對土壤細菌群落多樣性和潛在代謝功能的影響，為研究北方季節性凍融極端條件下土壤細菌群落的變化提供理論基礎。

1材料與方法

1.1樣品采集與凍融試驗

試驗土壤是校園內（36°37′16″N、109°49′17″E）采集的土壤，土層深度為0～20cm。使用2mm篩去除樣本中的植物和大石塊，然后進行室內凍融試驗。將土壤樣品置于-25°C冷凍24h，隨后在5°C解凍24h，此為一個凍融周期。對試驗土壤進行不同凍融處理：對照組（CK），5°C保存；處理1（C1），2個凍融周期；處理2（C2），6個凍融周期；處理3（C3），8個凍融周期。各凍融周期結束后取出部分試驗土壤保存于-80°C冰箱中用于后續微生物試驗測試。另一部分試驗土壤待完全風干后過200目篩，用于后續的土壤理化分析。

1.2土壤理化性質測定

土壤pH采用電位法（HJ962—2018）測定，烘干法測定土壤含水率，通過灼燒減量法測定土壤有機質（OM）含量。

1.3IlluminaMiseq測序

在該研究中，根據E.Z.N.A.soilDNAkit（OmegaBio-tek，Norcross，GA，U.S.）指導書從0.5g土壤中提取DNA。隨后，采用引物338F/806R進行了PCR擴增。該試驗在Illumina公司的MiseqPE300平臺上完成了所有的測序過程。

1.4數據處理

將16SrRNA基因序列通過R語言的Tax4Fun程序包，計算KEGG中的代謝循環和途徑。試驗中所有樣品均平行重復測試3次。試驗數據作圖使用Orgin2021。采用SPSS16進行單因素方差分析（ANOVA）來確定不同處理組之間的顯著性差異。

2結果與分析

2.1土壤理化性質

經過不同處理的土壤基本理化性質如表1所示。各處理組的含水率均顯著高于CK組，C1、C2、C3處理組較CK組分別提高了9.41%、17.43%和20.88%，C3組含水率最高。CK樣本的pH最大，經過凍融循環后土壤的pH有所降低，C1、C2、C3處理組分別降低了0.06、0.07和015。凍融循環對土壤有機質含量的影響最大，土壤有機質含量明顯提高，C1、C2、C3處理組較CK組分別提高了8277%、23.84%和13.93%，C1組有機質含量最高。

2.2土壤細菌群落多樣性

維恩圖可以清晰地看出不同凍融循環次數下土壤細菌群落組成的相似性及重疊情況（圖1）。從圖1可以看出，所有處理中共有的OTU種類為1385種，占總OTU數的87.40%。對照組CK中有2種獨特的OTU，而C1、C2、C3中分別有2、1、3種特有的OTU種類。此外，4個處理中，C2含有最多的OTU種類（1513個），C3中最少（1511個）。

同時該研究進行了不同凍融循環次數下土壤細菌群落Alpha多樣性指數分析，結果發現（表2），所有處理組別土壤細菌的覆蓋度均在99%以上。CK中Shannon-Wiener指數最高，經過8次凍融循環（C3）后Shannon-Wiener指數最低，Simpson指數隨著凍融循環次數的增加而增加，這表明隨著凍融循環次數的增加土壤細菌群落多樣性逐漸降低。

2.3土壤細菌群落結構組成

不同凍融循環次數下門水平的土壤細菌群落組成結構如圖2所示。4個組別中物種豐富度最高的菌門是放線菌門（Actinobacteria），它在CK、C1、C2、C3處理中占比分別為30.71%、30.91%、32.75%和33.89%，隨著凍融次數增加在土壤中的占比增大。第二大優勢門類是變形菌門（Proteobacteria），經過2次凍融循環（C1）相對豐度達到最低，隨后逐漸增加，經過8次凍融循環（C3）土壤中變形菌的占比達到最高，較C1組占比增加了11.13%。酸桿菌門（Acidobacteria）是第三大優勢菌門，經過2次凍融循環（C1）相對豐度達到最高，隨后逐漸降低。其他優勢細菌門包括綠彎菌門（Chloroflexi，8.87%～11.06%）、擬桿菌門（Bacteroidetes，4.45%～5.33%）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes，190%～2.40%）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae，1.66%～200%）、浮霉菌門（Planctomycetes，0.95%～1.31%）和厚壁菌門（Firmicutes，0.81%～1.08%）。其中擬桿菌門、芽單胞菌門、硝化螺旋菌門和厚壁菌門的相對豐度在凍融循環過程中呈先減后增的趨勢。此外，浮霉菌門相對豐度的變化趨勢則隨著凍融循環次數的增加呈下降趨勢，在C3中相對豐度最低。

基于Bray-Curtis相似性指數的層次聚類熱圖顯示了4個不同處理樣品的前10個細菌屬之間的層次關系（圖3）。結果表明，CK與C1相關，C2與C3相關。這說明多次凍融循環使得土壤細菌群落結構發生了變化。4個處理（CK、C1、C2、C3）中最具代表性的菌屬是Subgroup_6，相對豐度

分別為7.31%、9.46%、7.99%和6.03%；其次是假節桿菌屬（Pseudarthrobacter），相對豐度分別為5.56%、5.81%、6.35%和6.88%。其他優勢菌屬分別是芽球菌屬（Blastococcus）、斯科曼氏球菌屬（Skermanella）、KD4-96、冢村氏菌屬（Nakamurella）、小月菌屬（Microlunatus）、硝化螺菌屬（Nitrospira）和類諾卡氏菌屬（Nocardioides）。

2.4土壤菌群功能的預測

通過對不同處理土壤樣品中的細菌功能進行預測，結果發現（圖4），試驗土壤中總共發現了277種功能途徑，關于新陳代謝（Metabolism）的功能途徑占所有功能的64.60%～65.20%，關于細胞進程（Cellularprocesses）、人類疾病（Humandiseases）和環境信息處理（Environmentalinformationprocessing）方面的基因豐度隨著凍融次數的增多而降低；能量代謝（Energymetabolism）基因豐度先降低后增加；新陳代謝功能中最豐富的類別是碳水化合物代謝（Carbohydratemetabolism）。經過8次凍融循環后，土壤細菌群落的能量代謝功能（Energymetabolism）、糖合成和代謝功能（Glycanbiosynthesisandmetabolism）明顯降低，其中細菌群落能量代謝功能變化更為顯著，凍融后的3個處理組分別較CK組降低了0.67%、0.40%和0.27%。有關于次生代謝物的生物合成功能（Biosyntheticfunctionofothersecondarymetabolites）變化不明顯，而其余代謝功能相對豐度均有所提高，包括氨基酸代謝（Aminoacidmetabolism）和脂類代謝（Lipidmetabolism）等，其中，異源物質生物降解和代謝功能（Xenobioticsbiodegradationandmetabolism）C1、C2、C3處理組較CK組分別提高了2.43%、2.03%和1.01%。

2.5土壤細菌群落結構與環境因子冗余分析

土壤理化性質與土壤菌群結構在門水平上的冗余分析（圖5）顯示，pH對細菌群落結構的影響最大。第一優勢菌門放線菌門（Actinobacteria）與土壤的pH和有機質含量呈正相關，但與含水率呈負相關。然而，變形菌門（Proteobacteria）與pH和有機質含量呈負相關，與含水率呈正相關。此外，酸桿菌門（Acidobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）與土壤的pH和含水率呈正相關，與有機質含量呈負相關。

3討論

3.1凍融循環次數對土壤理化性質的影響

在經過不同凍融循環處理后，樣品的pH、含水率和有機質含量均發生了不同程度的變化。凍融循環的一個關鍵特征是溫度的變化而導致土壤水分的相位變化。各試驗組樣品的含水率均顯著高于對照組，并隨著凍融循環次數的增加而上升，這是因為凍融循環會促進土壤水分向上遷移而使表層土壤水分增加^［20］。導致pH降低的主要原因是土壤水分的增加，這會導致土壤透氣性下降形成一個缺氧的環境，從而增強土壤硝化作用^［21］；另一個原因是凍融循環會促進溶解性有機酸的釋放^［22］。凍融循環2個周期（C1）中有機質含量顯著高于對照組，這可能是溶解性有機質含量增加的緣故^［23］。在凍融作用下土壤團聚體遭受擠壓而破裂，從而釋放出易于微生物接觸和利用的有機物質包括碳水化合物、脂肪酸和固醇類等物質，在微生物的作用下這類有機質被降解成溶解性有機質。此外凍融作用還會導致耐寒性差的微生物死亡，然后釋放大量的活性有機質（包括多糖和氨基酸）^［24-25］。然而土壤有機質含量隨凍融次數的增加出現降低的趨勢，這可能是因為存活的微生物對環境適應性和代謝活動增強，從而降低了凍融作用導致的微生物死亡量，微生物裂解產生的溶解性有機質含量降低，同時土壤中溶解性有機碳被存活微生物持續分解以供給自身需求，因此隨凍融次數的增加土壤有機質含量開始持續降低。通過冗余分析發現，對于凍融條件下的土壤細菌群落，pH是最關鍵的影響因素，而土壤水分和有機質作為微生物發育繁殖所必需的物質，對細菌群落組成也有很大的影響。隨著凍融循環次數的增加，土壤的物理、化學性質相繼發生改變，進而對土壤的細菌群落結構產生了顯著性影響。

3.2凍融循環次數對土壤細菌群落的多樣性及組成的影響

結合Alpha多樣性指數可以看出，凍融循環8個周期（C3）樣品中OTU種類和Shannon-Wiener指數最低，這說明凍融循環次數越多，細菌群落多樣性越低，這與Lim等^［26］的研究結果一致。熱圖顯示CK群落結構與C1相似，而與凍融循環6個周期（C2）和C3樣本有一定差異。這表明在經過了多次凍融循環后，土壤的細菌群落結構已經出現了明顯的改變。放線菌門（Actinobacteria）在細菌群落中占主導地位。已有研究表明，放線菌門在低溫條件下有很強的代謝能力并能降解復雜的有機物質^［27］，所以隨著凍融循環次數的增加，放線菌門相對豐度呈上升趨勢。變形菌門（Proteobacteria）種類繁多，有著很強的代謝活性^［28］和耐低溫能力，在永久凍土層的細菌群落中占主導地位^［29］。而酸桿菌門（Acidobacteria）可以在低溫條件下降解纖維素，具有降解復雜化合物的能力^［30］。綠彎菌門（Chloroflexi）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）和浮霉菌門（Planctomycetes）有很強的環境適應能力，在世界上大多數土壤環境中都能生存^［31］。假節桿菌屬（Pseudarthrobacter）屬于放線菌門，降解能力很強，其在修復復合重金屬污染領域受到廣泛關注^［32］。Subgroup_6菌屬與假節桿菌屬功能相似，所以這2種細菌相對豐度很高。以上說明能降解復雜有機物質功能且具有較高代謝活性的細菌可以適應極端的凍融環境。細菌群落優勢物種的相對豐度經過數次凍融后發生變化，但是種類沒有改變。這說明這些優勢物種是大自然篩選出來的已經適應北方季節性凍融氣候的物種，凍融循環次數增加不會影響細菌群落的種類，而對細菌群落結構的影響主要體現在優勢物種的豐度變化。

3.3凍融循環次數對細菌群落代謝功能的影響

Tax4Fun分析作為高通量測序分析的一種補充，對試驗樣本進行了潛在代謝功能的預測。該試驗所取樣本中共發現了277種功能途徑，其中處于主導地位的是新陳代謝功能途徑。有關于細胞進程、人類疾病和環境信息處理方面的基因豐度隨著凍融次數的增多而降低，說明凍融環境對細菌細胞活動有抑制作用。能量代謝基因豐度先降低后增加的趨勢解釋了變形菌門（Proteobacteria）豐度的變化規律。據報道，變形菌是能量代謝中最主要的細菌^［33］。該研究觀察到，在生理代謝功能方面，比如碳水化合物代謝、氨基酸代謝和脂類代謝等方面表現出了明顯提高，這是因為部分微生物細胞為了克服凍融作用所帶來的抑制DNA和蛋白質的合成表達的危害，啟動了其他的基因表達方式來增強極端環境的適應能力^［34］。生物降解和代謝功能的提高使得這些經過數次凍融循環存活下來的細菌能夠通過降解死亡細胞中的營養物質來增強自己的活性。

4結論

pH是影響凍融條件下土壤細菌群落最關鍵的因素，凍融循環次數的增加促使土壤理化性質發生改變，細菌群落多樣性逐漸降低。細菌群落的優勢物種的相對豐度隨著凍融循環次數增加會發生變化，但優勢物種類別不發生變化。除此之外，凍融環境對細菌細胞活動有遏制作用，凍融循環次數增加不僅會改變細菌群落結構，還會影響其代謝過程，其中凍融后的3個處理組（C1、C2、C3）細菌群落能量代謝功能分別降低了0.67%、0.40%和0.27%，異源物質生物降解和代謝功能分別提高了2.43%、2.03%和1.01%。該研究為探究北方季節性凍融極端環境下土壤微生物群落代謝能力提供理論基礎。

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