相生和相克間作作物對豌豆根際微生物群落的影響

關鍵詞： 豌豆；香蔥；番茄；相生相克；微生物；間作

豌豆（Pisum sativum L.） 是世界第三大豆類作物，為豆科豌豆屬一年生攀援草本植物，不僅營養價值高，而且具有抗菌、抗氧化、抗癌、降血壓、降血糖、免疫調節等生理活性[1?2]。豌豆原產于亞洲西部和地中海沿岸地區，種植史至少要追溯到6000年以前[3]。豌豆工業化生產主要集中在淀粉與蛋白質加工[4?5]，市場對豌豆產量、品質、經濟價值的要求也越來越高。間作是在同一土地上同時種植兩種或多種作物[6]，對維持和提高土壤質量十分重要[7]，具有提高土壤肥力和資源利用率[8]、增加產量[9?10]、減少病蟲害和雜草密度[11?12]、提高根際微生物多樣性等作用[13]。間作不僅有助于提高豌豆產量、品質和降低生產成本，而且有助于提高經濟價值。然而，作物之間的相互影響不是既定的，有“相生”作用也有“相克”作用[14]。“相生”是指間作作物之間產生相互有益的作用，如減少病蟲害等；“相克”是指作物之間產生相互有害的作用，作物生長受到抑制、病害發生加重等[15?17]。研究發現，豆科和茄科作物間作可以相互促進生長[18?20]，主要是由茄科作物根系分泌物（抗菌酚類物質） 直接抑制或間接改變根際微生物組的組成來控制病原體，富集有益微生物[21?23]； 豆科和蔥屬作物則會相互抑制[24?26]，主要是因為蔥屬作物分泌物中化感物質顯著抑制豆科種子萌發生長，并對土壤中真菌和細菌有較強的抑制作用[27?28]。

植物相生相克也叫化感作用，是指植物通過釋放化學物質到環境中，進而影響自身或其他有機體的生長發育，它是植物長期進化中為適應自然競爭而產生的一種機制[29]，而產生化感作用的化學物質被稱為化感物質[30]。化感物質影響植物整個生長發育過程，包括光合與呼吸作用、水分與營養物質吸收代謝等生理生化過程[16]。土壤微生物在化感物質的遷移轉化過程中起著至關重要的作用，其群落組成和結構也受化感物質影響[31]。研究表明，從樟屬植物的葉片、樹枝中提取的樟腦、芳樟醇、桉葉油素和萜類化合物等對農作物、雜草或微生物的生長產生明顯的化感作用[32]。鐮孢菌（Fusarium） 是引起百合枯萎病發生的典型病原真菌，而烏頭酸對尖鐮孢菌（F.oxysporum Schltdl.） 存在低促高抑的化感抑制效應[33]。目前關于植物化感作用的研究較多，但基于相生相克化感作用對土壤微生物群落結構的影響仍鮮見報道。孔垂華等[15]的植物化感作用研究中，提出植物主要通過根系分泌物和凋落物兩種途徑，改變土壤理化性質、養分狀態和微生物群落結構，從而造成土壤正或負的反饋作用。但是微生物群落結構的變化誘導植物發生化感現象的作用機制尚未清晰。為此，探究不同間作體系中豌豆發生相生相克現象的微生物學機制，為開發利用有益微生物、構建豌豆生態種植模式提供理論依據與技術支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

主栽豌豆品種為‘奇珍76 豌豆’，香蔥品種為‘上海四季小蔥819’，番茄品種為‘芳萱麗粉’番茄，均采購于廣西壯族自治區南寧市蔬菜種子市場。

試驗于廣西大學農學院蔬菜基地（108°17′25″E，22°51′02″N） 進行。試驗地耕層土壤理化性質如下：pH 5.68，有機質8.92 g/kg，全氮0.55 g/kg，全磷0.67 g/kg，全鉀7.51 g/kg，堿解氮15.27 mg/kg，速效磷0.67 mg/kg，速效鉀82.8 mg/kg。

1.2 試驗設計

盆栽試驗設置4個處理，1） PP：碗豆單作；2） PT：豌豆/番茄間作（相生）；3） PA：豌豆/香蔥間作（相克）；4） CK：不種植作物，每個處理重復5 次。盆的直徑、高度分別為60 cm、45 cm，裝土20 kg。間作處理為每種作物各2 株，4 株作物呈正方形， 在對角線方向栽培同種作物， 植株間距20 cm，植株與盆邊緣距離20 cm （圖1）；其中， 單作處理僅種植豌豆。豌豆水肥管理以及除草、病蟲害防治等各項管理措施均按照常規方法管理[34]。施用磷肥時混施農家有機肥，生長初期追施氮肥。開花期防止水分過多造成徒長或過于干旱造成落花落莢。齊苗后淺松土1 次，1 周后再次中耕。豌豆株高30 cm 左右時支架。

1.3樣品采集與處理

作物定植50天后，選取不同處理條件下的優良植株進行采樣。采用抖根法[35]采集附著在植株根系上的土壤。具體操作如下：首先，使用75% 乙醇對工具消毒，使用鐵鍬松動植株周圍土壤，緊握植株基部緩慢拔出植株根系，輕抖植株去除非根際土壤，然后采集根際土壤樣品裝入無菌袋帶回實驗室，過2 mm 篩備用。

1.4 微生物測序

土壤細菌高通量測序由上海美吉生物醫藥科技有限公司完成。按照FastDNA? Spin Kit for Soil 試劑盒（MP Biomedicals，U.S.） 說明書提取總DNA，使用NanoDrop2000 分光光度計（Thermo FisherScientific，U.S.） 檢測DNA 濃度和純度。在ABIGeneAmp?9700 上進行PCR 擴增。利用AxyPrepDNA Gel Extraction Kit （Axygen Biosciences， UnionCity，CA，USA） 進行純化，混合后使用2% 瓊脂糖凝膠進行電泳檢測及回收，并利用Quantus?Fluorometer （Promega，USA） 對回收產物進行檢測定量。使用NEXTFLEX? Rapid DNA-Seq Kit 進行建庫，利用Illumina 公司MiseqPE250 平臺進行測序并且進行文庫構建。

1.5 土壤微生物生物量分析

土壤樣品經氯仿熏蒸浸提后，分別用容量分析法、茚三酮比色法、鉬藍比色法測定土壤微生物生物量碳（MBC）、氮（MBN）、磷（MBP）[36]。

1.6 數據處理

試驗數據采用Excel 2019 和IBM SPSS Statis-tics21 統計分析，利用上海美吉生物醫藥科技有限公司的I-sanger 云數據分析平臺進行在線數據分析。

2 結果與分析

2.1 土壤微生物生物量

由表1可知，4個處理的MBC 和MBN 含量均無顯著差異，相生間作豌豆（PT） 根際土壤MBP 顯著高于相克間作（PA） 和碗豆單作（PP），PA 與PP 之間的MBP 含量差異不顯著。由此可知，相生（豌豆/番茄，PT） 間作體系根際土壤中較高的微生物生物量磷，有助于保障土壤磷的供應。

2.2 土壤細菌多樣性

由表2可知，97%水平下進行聚類分析，共檢出45 門、146 綱、360 目、589 科、1114 屬、2221種、5619 個OTU，相生或相克間作體系不同程度地提高了豌豆根際土壤細菌門分類水平以外的各級分類水平數量。

由圖2可知，相生、相克、單作和空白土壤（CK）4個處理共有的細菌OTU數量為2787個，特有的細菌OTU 數量分別為234、226、181、289個；表明間作其它作物誘導豌豆根際土壤富集了更為多樣的細菌。

由表3可知，覆蓋率達到96% 以上，表明測序結果能夠客觀反映出土壤細菌群落多樣性。與相克（豌豆/香蔥，PA） 組合相比，相生（豌豆/番茄，PT）組合豌豆根際土壤細菌多樣性和豐富度均顯著降低。

由圖3可知，間作相生或相克作物，豌豆根際土壤細菌群落分別分布在不同象限中，組間相對距離較大，無交集；這表明間作誘導豌豆植株根際土壤細菌群落組成發生顯著變化（r=0.7747，P=0.0010）。

屬水平，相生間作體系（PT） 豌豆植株根際土壤中，檢測出14個優勢細菌屬（相對豐度占比gt;1%），相克（PA） 間作體系、單作（PP） 體系、空白（CK） 土壤分別檢出19、16、20 個優勢細菌屬（圖4）。相克（豌豆/香蔥，PA） 和豌豆單作（PP） 體系豌豆根際土壤的特有優勢細菌屬類糖單孢菌屬（Saccharomonospora）、交替紅桿菌屬 （ Alterery throbacter ）、硫桿菌屬（Thiobacillus）、unclassified_f_Sphingomonadaceae、norank_f_Roseiflexaceae 屬等，在相生（豌豆/番茄，PT） 間作體系豌豆植株根際土壤中缺失。

2.3 土壤真菌多樣性

由表4 可知，97% 水平下對豌豆植株根際土壤樣品序列進行聚類分析，共檢測出15 門、44 綱、105 目、222 科、426 屬、686 種、1699 OTUs。與豌豆單作相比，相生或相克組合間作均提高了豌豆植株根際土壤真菌各分類水平的數量。

由圖5 可知，相生（PT）、相克（PA）、單作（PP）豌豆根際土壤和空白土壤（CK） 共有的真菌OTU 數量為422，特有的土壤真菌OTU 數目分別為155、163、110、244 個。

由表5 可知，測序覆蓋率達99% 以上，這表明測序結果能夠客觀反映土壤真菌群落結構的多樣性及豐富度。相生（豌豆/番茄，PT） 和相克（豌豆/香蔥，PA） 組合之間豌豆植株根際土壤中，表征土壤真菌多樣性的Shannon 和Simpson 指數，以及表征豐富度的Ace 和Chao 1 指數均無顯著差異，表明無論豌豆間作相生抑或相克作物，均未導致豌豆植株根際土壤真菌多樣性和豐富度發生顯著變化。

OTU 分類水平上，相生和相克間作體系中，豌豆根際土壤真菌組間相對距離較小，有交集，但與豌豆單作（PP） 組間相對距離較大，無交集（圖6）。這表明，間作顯著改變了豌豆根際土壤中真菌群落組成（r=0.6667，P=0.0010），且顯著程度受間作的作物種類影響。

在屬水平，相生（PT）、相克（PA）、單作（PP） 豌豆根際土壤以及空白（CK） 土壤中監測到的優勢真菌屬數量（相對豐度gt;1%） 分別為20、17、14和18 個（圖7）。由圖7 可知，小脆柄菇屬（Psathyrella） 和油壺菌屬（Olpidium） 真菌是PT 組合間作體系中特有的優勢真菌屬，而Albifimbria 屬和鐮刀菌屬（Fusarium）真菌是PA 間作體系中的優勢真菌屬。

3 討論

土壤微生物對化感物質的轉化發揮著決定性的作用，土壤微生物不僅能夠降解化感物質，對釋放土壤吸附滯留的化感物質亦發揮重要影響[14]。本研究結果顯示，豌豆間作相生作物（番茄）、間作相克作物（香蔥） 豌豆植株根際土壤微生物群落結構發生顯著變化。本研究與黃子粵[37]研究發現的合理間作能夠改變土壤微生物群落結構，減少病原微生物數量，增加有益微生物數量的結果類似。此外，Singh 等[38]研究表明，土壤微生物生物量是土壤有機質中最活躍的組分，其流動周轉效率高，在土壤養分轉化和供應過程中發揮重要作用，同樣也是評價土壤質量的重要指標。其中，土壤微生物生物量碳作為土壤中重要的碳源，體現微生物利用土壤碳源的能力[39]。

土壤微生物生物量氮是土壤中最活躍的組分，能夠反映土壤供氮能力[40]；土壤微生物生物量磷是土壤中磷素養分轉換和循環的重要參數[41]。土壤微生物生物量越多，土壤供給植物有效養分的能力就越強[42]。本研究發現，相生（豌豆/番茄，PT） 組合間作體系中，土壤微生物生物量磷顯著高于其它間作組合，表明相生（豌豆/番茄） 組合間作具有提高土壤磷供給能力的作用。

另一方面，謝慶玲等[43]研究表明，豌豆和青稞可能對青刺尖油枯中揮發性物質的化感反應機制有差異，并在生長過程中表現出明顯的區別，這與本研究中相克作物（豌豆/香蔥） 間作產生相克現象類似。Kaur 等[44]研究亦表明，化感作用是植物化感物質與其根際土壤微生物綜合作用的結果。尤其根際環境中，根系分泌物對某些微生物具有富集效應，具有趨化性的細菌或真菌能夠在根際中大量聚集和繁殖。本研究中，糖單孢菌屬（Saccharomonospora）和硫桿菌屬（Thiobacillus） 細菌是豌豆相克（豌豆/香蔥，PA） 間作體系中，豌豆植株根際土壤中特有的優勢細菌屬。由于糖單孢菌屬（Saccharomonospora）細菌能夠分泌生物堿類、大環內酯類、肽類、角環素等多種化感物質[45]，其中可能存在抑制豌豆生長的物質；而硫桿菌屬（Thiobacillus） 細菌則是一種土壤中常見的無色硫細菌，無氧條件下會產生傷害植物根部的化學物質[46]。由此推測，豌豆相克間作體系中，糖單孢菌屬和硫桿菌屬細菌的大量富集可能是導致作物相克的重要機制之一。

Lakshmanan 等[47]研究還發現，番茄葉片受到病原菌侵染后，可通過調節根系分泌物組分與含量，如增加根系蘋果酸分泌釋放量，使更多的蘋果酸進入根際，從而招募更多的有益菌向根際聚集。本研究發現，與相克作物（豌豆/香蔥） 間作體系相比，油壺菌屬（Olpidiom） 真菌是相生（豌豆/番茄，PT） 間作體系豌豆植株根際土壤中特有的優勢真菌屬；而鐮刀菌屬（Fusarium） 真菌是相克作物（豌豆/香蔥） 間作體系中豌豆植株根際土壤中的優勢菌屬。研究已證實，油壺菌屬真菌相對豐度與速效磷含量呈正相關[48]；而鐮刀菌屬真菌是引起植物根腐病的主要病源菌，其能夠分泌毒素[49?50]。本研究發現，豌豆相生（豌豆/番茄，PT） 間作降低了鐮刀菌屬等有害真菌的豐度占比；與之相比，豌豆相克（豌豆/香蔥，PA） 間作則提高了鐮刀菌屬真菌等有害真菌的豐度占比，這一現象可能是豌豆間作不同作物產生相生相克現象的重要機制之一。

本研究闡明了豌豆間作相生和相克作物對豌豆植株根際土壤微生物群落結構的影響，可為今后人為組裝作物根際有益微生物群落提供參考，為提高作物產量和改善作物品質奠定了理論基礎。

4結論

與間作相克作物（香蔥） 相比，間作相生作物（番茄） 豌豆根際土壤細菌和真菌的多樣性與豐富度沒有顯著變化，但土壤細菌和真菌群落組成發生了顯著變化。相生（豌豆/番茄，PT） 間作體系下，豌豆根際土壤富集油壺菌屬（Olpidiom） 真菌，且鐮刀菌屬（Fusarium） 真菌豐度占比下降；而相克（豌豆/香蔥，PA）間作體系下豌豆根際土壤富集了具有分泌抑制豌豆生長化感物質潛力的糖單孢菌屬（Saccharomonospora）和硫桿菌屬（Thiobacillus） 細菌，以及作為病原微生物的鐮刀菌屬（Fusarium） 真菌。與相生作物（番茄） 間作，有助于豌豆根際富集具有促生功能的有益微生物種屬，與相克作物（香蔥） 間作則趨向于富集病原微生物。