BPS對金鯽魚中腎抗氧化指標的影響

摘 要：為研究作為雙酚A替代物的雙酚S（BPS）對金鯽魚中腎抗氧化指標的影響，將提前馴養適應1周的金鯽魚隨機分為5組，每組10尾魚。在安全濃度的基礎上，設置1個對照組和以等對數濃度差設置1、10、100、1 000 μg/L 4個BPS質量濃度組，進行為期15 d的急性暴露。試驗結束后分別從每組取3尾魚進行采樣，測定金鯽魚中腎中總超氧化物歧化酶（T-SOD）、丙二醛（MDA）及過氧化氫酶（CAT）含量，分析不同BPS濃度對于金鯽魚中腎抗氧化指標的影響。經試驗得出，在安全濃度的基礎上，隨著BPS濃度的升高，金鯽魚中腎中的CAT活力與總SOD活力顯著降低；MDA含量明顯增加。

關鍵詞：BPS；金鯽魚；中腎；抗氧化指標

魚類是水生態環境中重要的組成部分，處于水生生態系統食物鏈的頂端。近十幾年由于雙酚A在環氧樹脂與聚碳酸塑料工業生產中被大量使用，其通過多種途徑進入環境并造成污染。雙酚A具有潛在毒性，尤其對機體的內分泌系統的干擾作用已經被大量研究證實，而其對免疫系統和神經內分泌系統的毒性也日益明朗。BPA進入水環境中對人類的生存、繁衍造成了巨大威脅[1]。因此，在世界范圍內的大部分國家包括中國，生產嬰兒奶瓶及部分嬰兒用品的原材料中已經明確禁用BPA[2-3]。為了滿足日益增長的對塑料制品的需求，生產商開始需求更穩定，更安全以及更具經濟價值的BPA替代品。

雙酚S（BPS）是一類典型的BPA替代物。雙酚S為白色針狀結晶，堆積密度0.5～0.6 g/cm3，熔點240～241 ℃，易溶于脂肪烴，溶于乙醇、異丙醇、2-乙基已醇、乙腈、丙酮，微溶于芳烴，稍溶于醋酸乙酯、甲異丁酮，不溶于甲苯、水[4-5]。由于BPS中含兩個羥基和一個吸電子很強的砜基，故酸性比其他酚類強，但其化學性質卻比BPA更加穩定。根據2015年Kinch等[6]的最新研究報道，相比于BPA，BPS具有更加明顯的神經內分泌干擾作用，在極低的濃度（0.000 68 ug/L）已經能夠顯著影響斑馬魚的神經元的發育。水體中BPS富集易引發各種疾病。抗氧化的作用是魚體從根本上預防疾病，其特征之一是當體內活性氧自由基增加時，相應的抗氧化酶的活性和抗氧化劑的合成量會受到影響，據此可以作為機體受到氧化脅迫的指示[7]。目前相關報道主要集中在水生植物或水生動物的神經元、肝臟中，對于魚類中腎的研究相對較少，因此研究BPS對魚類中腎抗氧化指標的影響是很有意義的[8]。

本文以金鯽魚為材料，通過不同濃度的BPS急性暴露（15 d）來研究BPS對于金鯽魚中腎抗氧化系統的影響并探討其致毒機理，從而為評價該化合物提供更多的生物監測指標。研究結果可為魚類水環境健康養殖提供依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料和儀器

金鯽魚（體長4.5～5.2 cm，體質量10.5～12.2 g/尾）、BPS試劑、電子天平、酸度計、200 W加熱棒、溫度計、總超氧化物歧化酶（T-SOD）測定試劑盒、丙二醛（MDA）測試盒、總蛋白定量測試盒、過氧化氫酶（CAT）測定試劑盒、37 ℃恒溫水浴鍋、離心機、微量移液槍、冰醋酸、無水乙醇、酶標儀等。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗準備 將試驗所用到的材料（抄網、溫度計、加熱棒等）放入配好的含氯消毒水中浸泡消毒，將消毒后的材料進行組裝。養殖用水為充分曝氣24 h的自來水，用恒溫加熱棒控制水溫保持在（25.0±1.0）℃，增氧機控制溶氧在8.5 mg/L以上，pH值7.5±0.5。采購金鯽魚若干，在實驗室水質控制條件下，于水溫25 ℃下馴養適應1周待用。

1.2.2 試驗設計 試驗設置1個對照組和4個BPS質量濃度組，分別為1、10 、100、1 000 μg/L，進行為期15 d的BPS暴露試驗。每缸10尾魚，每天換水1次，早晚定時投食2次，虹吸法清除殘餌及糞便。暴露試驗結束后分別從各缸取3尾魚，用紗布擦干魚體表面，稱量其體重，記錄數據。然后采集中腎器官于凍存管中并置于液氮中冷藏，取樣結束后放置于-80 ℃冰箱中冷藏備用。

1.2.3 組織勻漿的制備 取事先保存于凍存管中的中腎器官，置于研缽中磨成粉末狀，準確稱取器官重量，按重量（g）∶體積（mL）=1∶9的比例，加入9倍體積的生理鹽水，冰水浴條件下制備成10%的中腎器官組織勻漿，2 500 r/min離心10 min，取上清液備用。

1.2.4 最佳取樣濃度的確定 先做三只不同取樣量的測試管。分別以說明書舉例的取樣濃度為中間值再往上濃縮一倍和往下稀釋一倍做三只樣本管及一只對照管。按操作表進行預試驗，以確定最佳取樣濃度。百分抑制率的計算：（對照管吸光度－測定管吸光度）÷對照管吸光度。最佳取樣濃度范圍：百分抑制率在15%～55%之間（此段曲線基本呈正比曲線關系）。最佳取樣濃度的選擇：取百分抑制率在45%～50%的這一管的濃度作為最佳取樣濃度[9]。測得試驗所需金鯽魚中腎的最佳取樣濃度為1%。

1.2.5 抗氧化指標的測定 取最佳取樣濃度下的組織勻漿，采用南京建成生物工程研究所總超氧化物歧化酶（T-SOD）測試盒、丙二醛（MDA）測試盒、過氧化氫酶（CAT）測試盒和總蛋白定量測試盒，按操作說明分別測定相應指標并記錄數據。

1.2.5.1 T-SOD活力的測定

總SOD活力=（對照OD值-測定OD值）/對照OD值÷50％×（V總/V樣）÷Cpr，

式中：V總：反應液總體積，mL；V樣：取樣量，mL；Cpr：勻漿液蛋白濃度，mg prot/mL（prot指蛋白）。

1.2.5.2 CAT活力的測定

組織中CAT活力=ΔA×271÷V樣÷T÷Cpr，

式中：271為斜率的倒數，常數，直接使用；V樣：取樣量，mL；T：反應時間，60 s；Cpr：勻漿液蛋白濃度，mg prot/mL（prot指蛋白）。

1.2.5.3 MDA含量的測定

組織中MDA含量=（測定OD值-對照OD值）÷（標準OD值-空白OD值）×標準品濃度÷Cpr，

式中：標準品濃度：10 nmol/mL；Cpr：勻漿液蛋白濃度，mg prot/mL（prot指蛋白）。

1.3 試驗數據處理

試驗數據用平均數及標準差表示，用SPSS軟件進行單因素方差分析和多重比較。P＜0.05表示組間比較差異具有統計學意義。

2 結果和分析

2.1 BPS對金鯽魚中腎中總超氧化物歧化酶（T-SOD）活力的影響

由圖1可知，金鯽魚中腎在受到BPS急性暴露之前，其中腎中T-SOD活力相對較高。在BPS濃度為1 μg/L急性暴露15 d后，中腎中T-SOD活力與對照組相比顯著低于對照組（Plt;0.05）；在BPS濃度為10 μg/L急性暴露15 d后，中腎中T-SOD活力較BPS濃度為1 μg/L急性暴露15 d時有所下降，且顯著低于對照組（P＜0.05）；在BPS濃度為1 000 μg/L急性暴露15 d后，中腎中T-SOD活力達到最小值。總之在整個急性攻毒階段，金鯽魚中腎中T-SOD的活力較對照組呈下降趨勢，并且在BPS濃度為0 μg/L與1 μg/L、10 μg/L與100 μg/L之間，均存在顯著性差異（P＜0.05）。

2.2 BPS對金鯽魚中腎中過氧化氫酶（CAT）活力的影響

由圖2可知，金鯽魚中腎在受到BPS急性暴露之前，其中腎中CAT活力相對較高。在BPS濃度為1 μg/L急性暴露15 d后，中腎中CAT活力與對照組相比顯著低于對照組（P＜0.05）；在BPS濃度為10 μg/L急性暴露15 d后，中腎中CAT活力較BPS濃度為1 μg/L急性暴露15 d時有所下降，且顯著低于對照組（P＜0.05）；在BPS濃度為100 μg/L急性暴露15 d后，中腎中CAT活力較BPS濃度為10 μg/L急性暴露15d時有所下降，且顯著低于對照組（P＜0.05）;在BPS濃度為1 000 μg/L急性暴露15 d后，中腎中CAT活力達到最小值。總之在整個急性攻毒階段，金鯽魚中腎中CAT的活力較對照組呈下降趨勢，并且在BPS濃度為0 μg/L與1 μg/L、100 μg/L與1 000 μg/L之間，均存在顯著性差異（P＜0.05）。

2.3 BPS對金鯽魚中腎中丙二醛（MDA）含量的影響

由圖3可知，金鯽魚中腎在受到BPS急性暴露之前，其中腎中MDA含量較低。在BPS濃度為1 μg/L急性暴露15 d后，中腎中MDA含量與對照組相比顯著高于對照組（P＜0.05）；在BPS濃度為10 μg/L急性暴露15 d后，中腎中MDA含量較BPS濃度為1 μg/L急性暴露15 d時有所上升，且顯著高于對照組（P＜0.05）；在BPS濃度為1 000 μg/L急性暴露15 d后，中腎中MDA含量達到最大值。總之在整個急性攻毒階段，金鯽魚中腎中MDA含量較對照組呈上升趨勢，并且在BPS濃度為1 μg/L與10 μg/L、10 μg/L與100 μg/L之間，均存在顯著性差異（P＜0.05）。

3 討論

BPS作為BPA的代替物廣泛存在于我們生活的環境中，而BPA因其會對環境造成污染，且有明確的毒性，危害動物體健康，已被逐步淘汰甚至禁用[10]。魚類中腎由緊接在前腎后面的一系列生腎節發育而成，整個中腎呈塊狀，位于體腔背壁，是魚類成體階段執行排泄機能的器官[11]。T-SOD是一類廣泛存在于魚體內的金屬酶，具有催化超氧陰離子自由基歧化為過氧化氫和氧的能力。超氧陰離子自由基是生物體內正常代謝的產物， 但自由基的積累將使細胞膜的脂質發生過氧化作用而引起膜裂變， 導致細胞損傷甚至細胞死亡[12]。 SOD是生物體內一種重要的而且也是最佳的自由基清除劑[13]。本研究中，不同濃度的BPS急性暴露后金鯽魚中腎中T-SOD活性顯著降低，中腎器官抗氧化應激能力減弱。

過氧化氫酶（CAT）是一種酶類清除劑，又稱為觸酶，是以鐵卟啉為輔基的結合酶。它可促使H2O2分解為分子氧和水，清除體內的過氧化氫，從而使細胞免于遭受H2O2的毒害，是生物防御體系的關鍵酶之一。本研究中，不同濃度的BPS急性暴露后金鯽魚中腎中CAT活性顯著降低。影響其抗氧化防御系統。

丙二醛（MDA）是衡量氧化脅迫程度的常用指標之一，能反映生物膜脂過氧化的程度。生物體內，自由基作用于脂質發生過氧化反應，氧化終產物為丙二醛，會引起蛋白質、核酸等生命大分子的交聯聚合，且具有細胞毒性。脂質氧化終產物丙二醛在體外影響線粒體呼吸鏈復合物及線粒體內關鍵酶活性。MDA是膜脂過氧化最重要的產物之一，它的產生還能加劇膜的損傷[14]。本研究中，不同濃度的BPS急性暴露后金鯽魚中腎中MDA含量顯著升高。任文娟[15]報導，BPS對紅鯉魚巨噬細胞的短期暴露對巨噬細胞胞內丙二醛含量產生了影響。丙二醛含量在1 000 μg/L濃度BPS暴露下出現了顯著性誘導，與本試驗結果一致。

4 結論

本試驗通過研究金鯽魚中腎中的總超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的活力及丙二醛的含量隨BPS急性暴露處理的變化，來探討BPS對金鯽魚中腎抗氧化指標的影響，試驗結果顯示，當金鯽魚受到BPS為期15 d的急性暴露后，隨著BPS濃度的升高，金鯽魚中腎中總超氧化物歧化酶、過氧化氫酶的活力逐漸減少，但丙二醛的含量卻有著明顯的增加，表明BPS急性暴露使機體清除氧自由基能力減弱，機體細胞受自由基攻擊程度增強。所以在漁業生產中，我們應盡量減少使用含有BPS的物品，從而減輕雙酚類物質向水體富集程度，保證水產品健康生產。

參考文獻：

[1]PIETRAS J. Bisphenol A： A critique of the law's failure to protect the public frontoxic exposure [J]. NZJ Envtl L， 2014，18： 41.

[2] SOTO A M， SCHAEBERLE C， MAIER M S， et al.Evidence of absence： Estrogenicity assessment of a new food-contact coating and the bisphenol used in its synthesis[J]. Environmental Science amp; Technology， 2017， 51（3）：1718-1726.

[3] LI Y， SHEN S， LIU Y， et al. Kinetics of 4， 4'- diaminodiphenylmethane curing ofbisphenol- S ероху resin [J].Journal of Applied Polymer Science，1999，73：1799-1803.

[4] ROCHESTER JR， BOLDEN A L. Bisphenol S and F： A systematic review and comparison of the hormonal activity of bisphenol A substitutes[J]. Environmental Health Perspectives，2015，123：643.

[5] 裘文慧.雙酚A及其替代物雙酚S對魚類免疫和神經內分泌系統的毒性效應與作用機理[D].上海：上海大學，2016：75-95.

[6] KINCH C D， IBHAZEHIEBO K， JEONG J，et al.Low-dose exposure to bisphenol A and replacement bisphenol S induces precocious hypothalamic neurogenesis in embryonic zebrafish [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2015，112（5）：1475-1480.

[7] 蘇燕，范滌敏，王曉蓉，等.四溴雙酚A對鯽魚血清抗氧化系統的影響[J].南京大學學報（自然科學版），2018（39）：101-102.

[8] 唐宏剛.魚蛋白水解物對大黃魚生長代謝、肌肉品質、免疫及抗氧化性能的影響[D].杭州：浙江大學，2018：28-29.

[9] 夏斌鵬.慢性熱應激對虹鱒生化指標及熱休克蛋白基因GRP78mRNA表達的影響[D].蘭州：甘肅農業大學，2017：44-46.

[10] BARBAGALLO F， CONDORELLI R A， MONGIOI L M，et al.Effects of bisphenols on testicular steroidogenesis[J].Frontiers in Endocrinology， 2020， 11：373.

[11] 岳興建.南方鲇頭腎和腎的結構與發育研究[D].重慶：西南師范大學，2002：65-66.

[12] 黃紅纓.王琪.人體健康的衛士—超氧化物歧化酶（SOD） [J].化學教育，2018（39）：54-58.

[13] 姚貝貝.ASX對OTA中毒小鼠雄性生殖機能保護作用的研究[D].沈陽：沈陽農業大學，2020：19-25.

[14] 白文莉.GYY4137對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護作用及機制研究[D].南京：南京醫科大學，2023：21-22.

[15] 任文娟.8種雙酚類化合物對斑馬魚的毒性效應評價及雙酚P的內分泌干擾效應研究[D].南京：南京工業大學，2017：28-30.