畜禽肌纖維發育相關細胞種類及鑒定方法的研究進展

摘" 要： 肌細胞（又名肌纖維）是組成骨骼肌的基本單位，約占畜禽機體的50%左右，與畜禽產肉性能、骨骼保護密切相關，對調節畜禽機體代謝和內分泌有重要作用，同時也為畜禽的運動提供了動力。骨骼肌是一種較為復雜的組織，而組成這些組織的基本單位是肌細胞，骨骼肌在發育時期需要多種類型的單核和多核細胞相互作用，這是形成優質肉類的關鍵。近些年，隨著科學技術的快速發展，對鑒定骨骼肌發育相關細胞有了更多且全面的技術，而單細胞測序技術在其中運用的最為廣泛，它的運用對組成骨骼肌的細胞類型和相關細胞發育異質性的研究提供了技術支持，對肉品質的研究有重大意義。本文綜述了通過細胞形態學觀察、分子標記物、免疫組織化學、免疫熒光、原位雜交、單細胞測序的方法鑒定與骨骼肌發育過程相關的細胞，歸納與骨骼肌發育相關細胞的標記基因，為了解骨骼肌的結構和功能，為探索骨骼肌發育機制提供參考，為肉品質的研究提供理論基礎，也在不同品種的個體選育中具有重要意義和實踐價值。

關鍵詞： 骨骼??；骨骼肌發育；細胞鑒定

中圖分類號： S852.2

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）12-5325-15

doi： 10.11843/j.issn.0366-6964.2024.12.001

收稿日期：2024-05-08

基金項目：國家重點研發計劃（2021YFD1200901）；國家自然科學基金地區項目（32060742）；北方農牧業技術創新中心項目（BFGJ2022002）；內蒙古自治區科技重大專項（2020ZD0004）；內蒙古自治區高等學校青年科技英才支持項目（NJYT23012）；中央引導地方科技發展資金（2022ZY0185）；內蒙古自治區直屬高校基本科研業務費項目科研創新平臺能力建設專項（BR221005）；內蒙古自治區教育廳一流學科科研專項項目（YLXKZX-NND-007）；內蒙古自治區科技計劃（2023KYPT0021）；新疆動物生物技術重點實驗室開放課題資助課題（2023SWS004）

作者簡介：吳丹妮（2000-），女，內蒙古巴彥淖爾人，碩士，主要從事動物遺傳育種研究，E-mail： 2604879241@qq.com

*通信作者：劉志紅，主要從事羊功能基因組與育種研究，E-mail： Liuzh7799@163.com

Research Progress on Cell Types and Identification Methods Related to Muscle Fiber Development in Livestock and Poultry

WU" Danni1， XIE" Yuchun5， QIN" Qing1， ZHANG" Chongyan1， XU" Xiaolong1， ZHAO" Dan1， LAN" Mingxi1， YANG" Ji4， XU" Songsong4， LIU" Zhihong1，2，3*

（1.Inner Mongolia Agricultural University， Hohhot 010018，" China;

2.Key Laboratory of Mutton Sheep amp; Goat Genetics and Breeding of Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Hohhot 010018，" China;

3.Inner Mongolia Key Laboratory of Sheep amp; Goat Genetics Breeding and Reproduction， Hohhot 010018，" China;

4.China Agricultural University， Beijing 100193，" China;

5.Hebei Normal University of Science amp; Technology， Qinhuangdao 066004，" China）

Abstract：" Muscle cells （also known as muscle fibers） are the basic unit of skeletal muscle， accounting for about 50% of the body of livestock and poultry， and are closely related to meat production performance and bone protection of livestock and poultry. They play an important role in regulating the metabolism and endocrine of livestock and poultry， and also provide power for the movement of livestock and poultry. Skeletal muscle is a relatively complex tissue， and the basic unit of these tissues are muscle cells. Skeletal muscle requires a variety of types of mononuclear and multinucleated cells to interact during development， which is the key to the formation of high-quality meat. In recent years， with the rapid development of science and technology， there are more and more comprehensive techniques for identifying skeletal muscle development-related cells， and single cell sequencing technology is most widely used. Its application provides technical support for the study of cell types and related cell development heterogeneity of skeletal muscle， and is of great significance for the study of meat quality. This paper reviews the identification of cells related to skeletal muscle development by cell morphology observation， molecular markers， immunohistochemistry， immunofluorescence， in situ hybridization， and single cell sequencing， and summarizes the marker genes of cells related to skeletal muscle development， in order to understand the structure and function of skeletal muscle. It provides a reference for exploring the mechanism of skeletal muscle development， provides a theoretical basis for the study of meat quality， and also has important significance and practical value in individual breeding of different varieties.

Key words： skeletal muscle; skeletal muscle development; cell identification

*Corresponding author： LIU Zhihong，E-mail：Liuzh7799@163.com

隨著畜牧業的快速發展和生活水平的不斷提高，人們對食品的健康需求也在逐步提升，對肉類的要求不再僅僅關注數量，而更加注重質量。因此，培育優質高產的肉類新品種，已成為目前肉類生產中的一個重要話題。對不同畜禽肉品質的研究也越來越廣泛和普遍。然而影響肉類品質的因素有很多，其中，肌纖維的組織結構特征不僅是影響肉品質的重要因素，也是評價肉品質的重要指標［1］。

近些年，單細胞測序技術在肌纖維發育研究中的應用越來越廣泛。單細胞RNA測序（scRNA-seq）是基于不同發育階段的單細胞水平上對轉錄組進行分析的一種技術。該技術評估了不同的細胞類型和不同分化軌跡上所對應細胞的狀態［2］。Xu等［3］使用單細胞轉錄組測序技術對3個品種豬的骨骼肌細胞群進行分析，鑒定出9種細胞類型，有三個肌原細胞系，包括衛星細胞、成肌細胞和肌細胞，纖維成脂祖細胞、內皮細胞、膠質細胞、髓系細胞、淋巴細胞等，揭示了細胞異質性，深入了解骨骼肌纖維細胞進化趨勢，為提升肉類品質奠定基礎。本文綜述了通過細胞形態學觀察、分子標記物、免疫組織化學、免疫熒光、原位雜交、單細胞測序的方法鑒定與骨骼肌發育過程相關的細胞，對不同畜禽骨骼肌發育時間節點進行總結，并歸納與骨骼肌發育相關細胞的標記基因，為了解骨骼肌的結構和功能，探索不同畜禽骨骼肌發育機制提供參考，為肉品質的研究提供理論基礎，也在不同品種個體選育中具有重要意義和實踐價值。

1" 骨骼肌纖維概述

1.1" 骨骼肌纖維發育階段

從細胞結構上，骨骼肌發育過程可分為兩個不同的階段，首先是在早期的胚胎時期，骨骼肌細胞數量的增加，其次是在生長的后期，主要是肌纖維的肥大發育和肌纖維類型的轉化［4-5］，從而促進肌肉發育進入細胞增生期，以絨山羊為例，如圖1所示。其中的一些蛋白質和轉錄因子作為調節因子，在胚胎骨骼肌的發育過程和肌肉分化中發揮重要作用。

從細胞組成上，骨骼肌是由中胚層間充質干細胞發育而來，直到形成最成熟的肌肉組織，該過程是極為復雜的，此發育大致可分4個階段［6-7］：第一階段是中胚層間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）發生終末分化（terminal differentiation）而形成體節，體節成對排列在胚胎神經管的兩側［8］，體節可分化為軟骨細胞、成血管細胞、成纖維細胞以及成肌細胞，成肌細胞是骨骼肌的前體細胞，單核成肌細胞（myoblast）的形成；第二階段是單核成肌細胞又發生融合，形成肌管（myotube），肌管是含有肌原纖維的長圓柱狀的多核細胞［9］ ；第三階段是肌管進一步分化而形成肌纖維［10］；最后一個階段為肌纖維繼續生長直到最終發育為成熟的肌肉組織［11-12］，如圖2所示。

1.2" 不同物種骨骼肌發育階段

有研究表明，在不同畜禽中骨骼肌發育過程基本相似，不同的是，在發育階段的時間上，不同物種之間具有一定的特異性。雞在出生后第7胚齡肌纖維主要由慢肌纖維構成，到第14胚齡左右快肌纖維開始作為主導類型，隨著胚齡的增加，發現其肌內纖維直徑和橫截面積逐漸變大但纖維密度越來越小，且腿肌比胸肌發育更迅速［13］。還有研究發現，在小鼠胚胎發育過程中可以被分成兩個階段：在10.5～12.5 d是初級期或早期胚胎期，第14.5～17.5 d是次級期或胎兒后期［14］。牛到180 d時，肌原細胞在第2代時分化結束，纖維總數定型。李雪嬌等［15］對德美羊和中美羊兩個品種的胎兒期骨骼肌發育進行對比，確定105d是綿羊肌纖維從數量增多到增粗轉變的一個關鍵節點。有文獻指出在綿羊、牛和人40%的妊娠期中檢測到了三代肌原細胞。所以從中可以推測出山羊出現三代肌原纖維的時期可能在57～64 d之間。豬的初級纖維形成發生在妊娠第35～55天，由前體成肌細胞向肌管整合完成：從55～90 d初級纖維周圍的次生纖維開始增殖［16］。豬的三級肌纖維通常是在產后早期發育而成，其直徑往往小于初級和次級肌纖維。在末代肌纖維形成過程中，肌纖維總數基本沒有改變［17］。但動物妊娠期無法準確劃分骨骼肌發育階段，無法反映不同物種之間的差異［18］。如圖3所示繪制了不同物種肌原細胞發育時間線。

1.3" 組成肌纖維的類型及轉化

肉品質與肌纖維類型密切相關，肌纖維類型的組成是調控肉品質的關鍵。畜禽隨著生長發育階段的不同，肌纖維也會隨著年齡的增加逐漸成熟，體積增大，類型也會隨之發生轉化，用以滿足機體的運動、代謝等生命活動［19］。根據肌纖維收縮類型分為慢收縮Ⅰ型（慢肌）和快收縮Ⅱ型（快?。?，慢肌多為紅肌纖維組成，又名氧化型肌纖維：而快肌多為白肌纖維組成，又名酵解型肌纖維［20］。在慢肌和快肌的基礎上，按MYHC亞型被分為I、IIa、IIx、IIb四類，I（慢速氧化型）型即為慢肌，Ⅱ型為快肌，Ⅱ型又可分為IIa型（快速氧化糖酵解型）、IIb型（快速糖酵解）和IIx型（快速糖酵解）。IIx作為中間型，其功能及代謝能力介于IIa和IIb之間，收縮速率從大到小依次為IIb、IIx、IIa、I［21］。

已有研究表明［22］，I型纖維比IIb型纖維直徑細、剪切力小，說明I型纖維具有良好的嫩度特性。同時I型纖維比Ⅱ型纖維含有更多脂質和磷脂，肉質風味好。研究發現在不同肌肉群中具有不同比例的纖維類型。楊玉瑩等［23］通過對不同部位牦牛肌纖維特性進行研究，發現背最長肌和半膜肌Ⅱ型肌纖維比例較高，腰大肌I型肌纖維的比例較高。肌纖維類型也隨畜禽不同發育階段有不同的組成。在出生時，肌肉主要由氧化型肌纖維組成；出生后生長階段，氧化型肌纖維的比例減少同時酵解型肌纖維的比例增加［24］并遵循ⅠⅡaⅡxⅡb的變化規律［25］。同樣通過對蒙古馬胎兒期與成年期骨骼肌肌纖維類型進行比較發現，胎兒期Ⅱ型肌纖維占比相較成年時期更大，并且發育到成年時期時，肌纖維由Ⅱ型（快型）纖維向Ⅰ型（慢型）纖維轉化［26］。周力等［27］對出生和12月黑藏羊背最長肌肌纖維進行分析得到，隨著發育時間的推移，其肌纖維類型由氧化型開始向酵解型轉化，這同時也在一定程度上影響著機體生長發育。

2" 主要肌纖維細胞Marker基因的概述

組成骨骼肌的細胞有肌細胞（myocyte）、內皮細胞（endothelial cell）、成纖維細胞（fibroblasts）、間充質干細胞（mesenchymal stem cell）、免疫細胞［B細胞、T細胞、巨噬細胞（macrophages）］、中性粒細胞（neutrophils）、衛星細胞（satellite cell）、神經膠質細胞（glial cell）、纖維/成脂祖細胞（fibro-adipogenic progenitors， FAPs）、平滑肌細胞（smooth muscle cell）等［28-29］。根據前人的大量研究可以將骨骼肌發育的主要細胞類群歸納為內皮細胞、骨骼肌肌源性亞群（成肌細胞、肌細胞、肌源性祖細胞等）、免疫細胞、纖維/成脂祖細胞等。

2.1" 內皮細胞

內皮細胞（endothelial cells，ECs）遍布血管中，它是氧氣和營養物質輸送、免疫細胞運輸以及清除遠組織廢物的重要管道［30］。ECs可以調節血流、血漿中大分子的傳遞和血管舒縮，防止血細胞的黏附和血栓形成，來維持血管屏障功能［31］。有研究表明，在胚胎細胞群中只有一小部分包括內皮細胞和心肌中少于50%的心肌細胞群（包含肌細胞）［32］。血小板內皮細胞黏附分子-1（PECAM1），也稱為CD31，是一種參與淋巴細胞活化和跨內皮遷移的細胞黏附分子，負責血管內皮細胞單層的形成，PECAM1（CD31）是內皮細胞的marker基因［33］。CD34也是標記內皮和血管周圍細胞的特異性基因［34］，是用于識別各種組織中的血管祖細胞的基因，在維持組織穩態中起著關鍵作用。

2.2" 免疫細胞

免疫細胞是指參與免疫應答或與免疫應答相關的細胞。包括淋巴細胞、樹突狀細胞、單核/巨噬細胞、粒細胞、肥大細胞等。研究表明，在肌肉損傷后，免疫細胞的比例會增加，幫助清除壞死細胞并促進再生。而在免疫細胞中，巨噬細胞扮演著中心角色，它們通過調控細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的組織恢復和重構，有助于維持組織的穩定性［35］。B細胞包括骨髓中的祖細胞，淋巴組織中處于發育狀態的B細胞以及淋巴和非淋巴組織中終末分化的記憶B細胞和漿細胞。它們通過產生針對特定身體部位的抗體，在體液免疫中發揮著核心作用，從而參與機體的免疫系統［36］。Xu等［37］使用scRNA-seq對新生仔豬骨骼肌細胞群進行分析，一共定位到9個細胞群，其中用基因PTPRC和CD3G對淋巴細胞進行了定位，揭示了細胞異質性、新的細胞亞群及其相互作用的變化。Zhao等［38］通過利用癌癥基因組圖譜數據挖掘了9個B細胞標記基因ZBP1、SEL1L3、CCND2、TNFRSF13C、HSPA6、PLPP5、CXCR4、GZMB和CCDC50。Coulis等［39］得到巨噬細胞的標記基因有Folr2、Mt2、Lyvel和Gas6等。

2.3" 成纖維細胞

結締組織的主要細胞類型是成纖維細胞，它在組織發育、穩態、修復和疾病過程中分泌細胞外基質成分［40］。在正常情況下它們不表達α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle-actin，α-SMA）。成纖維細胞在皮膚真皮層中最為豐富，除此之外，還在腸、肺、心臟和肌肉等組織中存在。研究者們為區分不同的組織來源，一般把來自不同組織器官的成纖維細胞分別命名為 “組織名稱+成纖維細胞”，例如皮膚成纖維細胞、結腸成纖維細胞、滑膜成纖維細胞、肺成纖維細胞、肌肉成纖維細胞等［41］。Fan等［42］對人的臍帶和包皮間充質干細進行單細胞轉錄組測序，分析了所有細胞亞群中常見成纖維細胞的標記基因有ACTA2、FAP、PDGFRA、PDGFRB、COL1A1、POSTN、DCN、COL1A2、CDH11等。成纖維細胞的占比在不同種類肌肉和不同發育階段有明顯差異，如表1所示。

2.4" 纖維/成脂祖細胞

纖維/成脂祖細胞（FAPs），也被稱為肌肉常駐間充質祖細胞，具有多種分化潛力，可用于脂肪形成、纖維化、成骨和軟骨形成。是肌肉內穩態和保持細胞完整性的關鍵調節器。纖維/成脂祖細胞通過協調肌肉干細胞（muscle stem cell，MuSCs）和免疫細胞之間的相互作用，在肌肉發育和修復中發揮重要作用。研究表明 ，FAP不僅在再生過程中促進短暫的肌肉纖維化和脂肪形成，而且還調節衛星細胞［43］。Wosczyna等［44］在小鼠上證明，體內fap可防止衛星細胞過早分化，從而促進再生早期階段衛星細胞的增殖。Chen等［45］研究表明，FAPs已被認為是維持肌肉內穩態的重要調節因子。FAPs有時也被稱為成纖維細胞，“成纖維細胞”作為一個總括術語，用來描述包括分化細胞和成體祖細胞在內的細胞類型的異質群體。為了避免語義混淆，使用術語“肌成纖維細胞”來表示由成年祖細胞（如FAPs）產生的不同分化的細胞，該祖細胞產生細胞外基質［46］。有研究表明，PDGFRAα是纖維/成脂祖細胞的標志物，PDGFRα＋細胞能夠有效的分化成脂肪細胞［47-48］。

2.5" 骨骼肌肌源性亞群

已有研究發現在牛胚胎期時，發育的骨骼肌肌源性亞群以MYF5+成肌細胞、MYOG+肌細胞為主，也觀察到少量表達PAX7的肌源性祖細胞亞群。在出生后階段，幾種類型的肌纖維構成了肌源性群體的大部分，沒有檢測到分化的肌源性細胞。在成年期，骨骼肌主要是由慢速肌纖維和快速肌纖維構成的，這些纖維可以進一步細分為I型纖維、IIA型纖維以及IIX型纖維［49］。肌肉衛星細胞（satellite cells，SCs）又名成體干細胞，位于肌纖維基底板和肌膜之間，通常保持靜止狀態，是維持骨骼肌穩態的核心細胞。骨骼肌的再生和修復能力依賴于衛星細胞和其他細胞如免疫細胞、內皮細胞（ECs）、成纖維細胞等細胞之間的相互作用［50］。在穩定的肌肉結構中，靜止衛星細胞的占比不足10%，并且在不同的肌肉組織中，靜止衛星細胞的數Cattle背最長肌胚胎期（懷孕后60 d）、哺乳期（出生后4月齡）和成年期（出生后24月齡）胚胎期成纖維細胞占比最多；哺乳期內皮細胞占比最多，其次是IIX型肌纖維；成年期IIX型肌纖維占比最多10×Genomics單細胞RNA測序18個主要細胞類型：脂肪細胞、內皮細胞、紅系細胞、成纖維細胞、淋巴細胞、單核細胞、成肌細胞、肌細胞、肌源性祖細胞、中性粒細胞、周細胞、雪旺氏細胞、腱細胞、I型纖維1、I型纖維2、IIA型纖維1、IA型纖維2和IIX 型纖維［102］

豬

Pig背最長肌1日齡新生豬/10×Genomics單細胞RNA測序11種不同的細胞類群，包括內皮細胞（24.39%）、肌管（18.82%）、纖維成脂祖細胞（18.11%）、衛星細胞（16.74%）、成肌細胞（3.99%）、肌細胞（5.74%）、雪旺細胞（3.81%）、平滑肌細胞（3.22%）、樹突狀細胞（2.99%）、周細胞（1.86%）和中性粒細胞（0.33%）［66］

雞

Chicken胸肌生長早期（孵化后第5天）和快速生長期（第100天）在生長早期鑒定到了5個成肌細胞群和2個脂肪細胞群，在快速生長期鑒定到了1個成肌細胞群和脂肪細胞群10×Genomics單細胞RNA測序生長早期（孵化后第5天）鑒定出4種細胞類型：成肌細胞、脂肪細胞、紅細胞和其他細胞。快速生長期（第100天）鑒定出6種細胞類型：成肌細胞、脂肪細胞、干細胞、紅細胞、內皮細胞和其他細胞［103］

量表現出明顯的差異性，在與慢肌纖維有關的衛星細胞數量多，而與快肌纖維有關的衛星細胞則相對較少［51］。但在損傷和再生過程中會增多。PAX7是衛星細胞的特異性表達轉錄因子，有研究表明，PAX7的產生使成人的衛星細胞能夠進行誘導性基因標記和消融，并證明衛星細胞對肌肉再生既是必要的，也是充分的［52］。

靜止的衛星細胞通常表達諸如基因Pax7和Myf5等標記物。肌肉損傷之后，衛星細胞會被損傷環境所發出的多種信號所激發。然后，衛星細胞向損傷部位遷移，并重新進入細胞周期進行增殖。在這個發展階段，共同生成的衛星細胞被命名為成肌細胞，并且它們表達了肌原性標記物Pax7和/或Myf5和/或MyoD。增殖期過后，成肌細胞從細胞周期中撤出并向成熟肌細胞分化。在這個分化過程中，基因Pax7和Myf5的表達水平下降，同時基因MyoG和Mrf4的水平也有所上升。如圖4所示。

骨骼肌纖維的生長發育進而形成肌肉的過程需要成肌細胞的增殖和分化，而骨骼肌纖維的形成受肌衛星細胞的分化增殖等復雜過程調控，其中生肌調節因子（myogenic regulatory factors，MRFs）家族被認為是啟動和促進骨骼肌衛星細胞分化增殖的關鍵調控因子，在骨骼肌的生長發育過程中發揮著至關重要的作用。MRFs是由四種肌肉特異性蛋白組成的，包括MyoD、Myf5、MyoG、Mrf4［53］。

肌細胞生成素（MyoG）屬于生肌調節因子家族（MRFs）的一員，它是決定肌細胞終末端分化的核心因子，并在調節肌細胞生成過程中發揮中心角色，它的表達還能終止成肌細胞增殖并調控單核成肌細胞向多核肌細胞整合的進程。MyoG作為生肌調節因子家族的主要成員之一，調節中胚層向肌纖維的分化過程，進而通過成肌細胞向肌纖維的整合過程。MyoG基因是MRFs基因家族中唯一在所有骨骼肌肌細胞系中均可表達基因［54］。

2.6" SCX＋細胞

SCX＋的表達標記了一個干細胞/祖細胞群體，產生軟肌骨骼細胞（肌細胞、半月板細胞、腱細胞）和硬肌骨骼細胞（軟骨細胞和骨細胞），對肌腱和韌帶的正常發育和成熟至關重要同時可能參與后肢骨骼肌發育［55］。SCX＋高表達肌腱細胞標記物，通過單細胞轉錄組測序技術結合質譜流式細胞術確定了兩個肌肉常駐細胞群，基因TNMD、THBS4和EGR1定位了間質肌腱細胞［56］。成熟的肌腱由大量的胞外基質組成， 胞外基質由膠原纖維和蛋白聚糖構成［57］。有研究發現，TNMD也名腱調蛋白，是一種II型跨膜糖蛋白，分布在肌腱、韌帶及骨骼肌的肌外膜中，是肌腱分化的特異性標志。而肌腱標記基因SCX能夠正向調控TNMD的表達。在雞骨骼肌發育的早期階段，基因SCX的表達早于TNMD，并且SCX的存在促進了TNMD的表達［58］。這表明，SCX對多個胞外基質成分具有調控作用。

3" 骨骼肌中不同類型細胞相互作用

骨骼肌中不同細胞的相互作用是一個復雜的動態過程。各類細胞通過分泌多種信號分子和細胞間直接接觸，共同維持肌肉的健康與功能。間充質干細胞（MSCs）是一種多能性組織干細胞，可分化為多種中胚層組織類型，包括成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞和肌成纖維細胞［59］。周細胞（pericyte，PC）長期以來被視為血管的結構性細胞。然而，隨著對它們與內皮細胞緊密接觸的識別，以及通過旁分泌信號與周圍細胞的相互作用，逐漸揭示出周細胞在維持血管周圍環境穩態方面的其他重要功能［60］。有研究表明，纖維/成脂祖細胞（FAPs）不僅在再生過程中促進短暫的肌肉纖維化和脂肪形成，而且還調節衛星細胞、巨噬細胞，并且是調節性T細胞的分泌信號的重要來源［61-62］。還有研究發現，在肌肉損傷中，免疫細胞（尤其是巨噬細胞）會被招募到受損區域，促炎M1巨噬細胞和抗炎M2巨噬細胞對衛星細胞分別進行調控。這種相互作用對于有效修復肌肉至關重要［63］。Ahmad等［64］研究得到牛肌肉組織中含有成纖維細胞的條件培養基可以增加培養中的成肌細胞的增殖，說明成纖維細胞不僅可以通過細胞外基質的形成來調節衛星細胞的激活，還可以作為生長因子的旁分泌來源。不同細胞之間通過細胞因子、化學信號和直接接觸進行相互調節。研究表明，IGF-1和FGF等生長因子在衛星細胞的增殖和分化中起重要作用，同時也激活PI3K/Akt信號通路來調控成肌細胞的增殖分化［65］。對這些相互作用的深入研究不僅有助于理解肌肉生物學，也為治療肌肉相關疾病提供了潛在的新方向。

4" 不同畜禽骨骼肌細胞類型組成

骨骼肌發育相關的細胞類型與不同畜禽、不同發育階段以及不同組織部位等因素密切相關。如表1所示。根據前人的研究表明，在牛胚胎期，成纖維細胞占比最多，肌細胞次之；在哺乳期，內皮細胞占比最多，其次是IIX型肌纖維、I型肌纖維和周細胞；在成年期，IIX型肌纖維占比最多，其次是肌腱細胞、IIA型肌纖維［102］。在1日齡新生豬背最長肌中發現內皮細胞占比最多，其次是肌管、纖維成脂祖細胞和衛星細胞［66］。在生長早期（孵化后第5天）和快速生長期（第100天）雞的胸肌中得到占比最多的成肌細胞，其次是脂肪細胞［103］。通過對不同細胞類型的研究可以更好地解析不同畜禽發育機制。

5" 細胞鑒定方法

骨骼肌的發育是一個動態且復雜的過程，從胚胎期到胎兒期再到出生后期，需要多種細胞相互作用，相互配合，共同完成。即對不同發育階段肌肉組織的細胞鑒定是更好的理解肌肉發育、再生以及疾病等生物過程中的關鍵。根據不同的研究階段和目的，研究者們采用多種細胞鑒定方法聯合分析，下面通過概述多種鑒定方法在肌肉發育中的應用，如細胞形態學觀察、免疫細胞化學染色和一些高通量測序技術等，進一步全面理解肌肉發育過程中的細胞類型及其遺傳機制。

5.1" 細胞形態學鑒定

細胞形態學分析是最直接的細胞鑒定方法之一。通過觀察細胞的形態、大小、顏色、核形態等特征，可以初步確定細胞的類型。在細胞形態學分析中，可以使用光學顯微鏡或電子顯微鏡來觀察和記錄細胞的形態特征。

石蠟切片和HE染色，是組織學中最基本的技術之一，至今已經使用了一百多年［67］。石蠟切片是常規切片技術中應用最為廣泛的技術之一，其優點是切片的厚度容易控制（最薄可達0.15μm），清晰度較好，在顯微鏡下可以觀察到組織形態，從而判斷其細胞類型［68］。蘇木精-伊紅（HE）染色作為組織學常用的染色技術，能夠突出細胞和組織的精細結構，從而對細胞類型進行觀察與分析［69］。

HE是最常見且簡單的染色方法，是因為它適合多種固定物，并顯示出細胞質、細胞核和細胞外基質的普遍特征。蘇木精有一種深藍紫色，通過一種復雜的反應來染色核酸。伊紅是粉紅色的，可以非特異性地染色蛋白質。在組織中，細胞核被染成藍色，而細胞質和細胞外基質有不同程度的粉紅色［70］。石蠟切片結合HE染色可以更好地觀察到不同發育時期不同組織或細胞的形態結構?？梢宰鳛檠芯坎煌M織和細胞形態最有效的工具。有很多研究將HE染色和其他免疫細胞化學染色技術結合起來用來鑒定細胞類型。Chen等［71］通過HE和免疫熒光染色，檢測到了來自于脂肪組織中的微小神經纖維細胞和雪旺細胞。Hao等［72］通過使用HE染色法，觀察到CV8穴位的形態學特征，將HE染色和免疫組化染色相結合鑒定了CV8穴位的細胞類型。

5.2" 分子標記物鑒定

生肌調節因子（myogenic regulatory factor，MRF），又稱為MyoD家族。MRF只在骨骼肌中表達［73］。它可以誘導成纖維細胞、衛星細胞分化為成肌細胞，參與調控肌肉生長發育［74］。它由四個家族成員組成，分別是MyoD、myogenin、Myf5和MRF-4（Myf-6或herculin）。Myf5能促進肌纖維形成［75］，是衛星細胞的關鍵細胞標志物之一，在肌肉損傷再生中起著重要作用［76］，MyoG和Mrf4參與肌管融合及肌細胞分化［77］。在胚胎發育過程中MRF家族具有特定的時空表達模式，myf-5、myogenin、MRF4和MyoD分別于胚胎形成第8、8.5、9、10.5天表達［78］。

5.3" 免疫細胞化學染色

免疫細胞化學染色是一種常用的細胞鑒定方法。通過使用特異性抗體標記目標蛋白質，可以在細胞中檢測到特定的抗原表達。這種方法可以用于確定細胞的類型和功能，以及檢測細胞中特定蛋白質的表達量和定位。主要可以分為免疫熒光和免疫組化兩方面。

5.3.1" 免疫熒光

免疫熒光（IF）是一種重要的免疫化學技術，可以檢測和定位各種細胞制劑的不同類型組織中的各種抗原，根據實驗的范圍或使用的特異性抗體不同，有兩種方法可用：直接（初級）或間接（次級）［79］。很多研究者在研究細胞的時候都會將免疫熒光作為后期的驗證實驗。Feng等［80］通過使用Pax7基因針對小鼠肌肉組織且在斑馬魚肌肉研究的基礎上優化了免疫熒光染色方案，對衛星細胞進行了標記。Dumont和Rudnicki［81］用Pax7、MyoG基因對小鼠腿部肌肉進行免疫熒光試驗，用來驗證骨骼肌再生肌原細胞。

5.3.2" 免疫組織化學

免疫組織化學（IHC）是應用最廣泛的蛋白質檢測技術之一。該技術的原理是基于特異性抗體與組織中匹配的特異性抗原的結合，使用一系列檢測技術使結合的抗原-抗體復合物可視化。IHC使用多種不同的酶標記物（例如過氧化物酶和堿性磷酸酶）來檢測感興趣的抗原［82］。有研究表明，在某些情況下，這些組織化學染色被證明在特定的細胞鑒定中具有關鍵價值［83］。Cefis等［84］通過使用免疫組化技術研究大鼠比目魚?。╯oleus，SOL）和腓腸?。╣astrocnemius，GAS）中腦源性神經營養因子（BDNF）在細胞中的定位。Kalbe等［85］通過進行免疫組織化學分析，確定肌肽相關蛋白的細胞定位，研究肌肽對從糖酵解肌纖維和氧化肌纖維中分離出的成肌細胞的增殖生長的影響。

5.4" 熒光原位雜交

熒光原位雜交（FISH）為研究不同生物背景下基因和細胞的空間定位和表達水平提供了寶貴的工具。熒光原位雜交（FISH）廣泛用于特定DNA片段（和RNA片段）的視覺定位，廣泛應用于細胞周期任何階段的染色體或細胞核［86］。使用單分子RNA原位雜交的方法可以更好地理解特定基因在亞細胞中的定位［87］。

RNA FISH是一種能夠檢測和可視化細胞內特定RNA分子的技術。隨著技術的進步，RNA FISH的靈敏度和特異性得到了提高，可以檢測單個mRNA分子。使用一組熒光標記的探針檢測RNA，這些探針與感興趣的基因對應的特定核苷酸序列互補。這些探針與目標RNA分子雜交，能夠同時檢測同一細胞或組織內的多個RNA，鑒定基因在細胞內的表達情況［88］。Lawrence等［89］通過對體外分化的雞骨骼肌成肌細胞進行原位雜交，直接在單個細胞內分析肌肉特異性mRNA的表達，獲得了關于這些基因在單個細胞中表達的精確信息。DNA FISH是一種常用的分子技術，用于可視化DNA序列的位置［90］。DNA FISH的核心原理是熒光標記的DNA探針（雙鏈或單鏈DNA片段）在細胞或組織中原位結合其互補序列的能力，以熒光顯微鏡可檢測的熒光信號的形式揭示其靶標的位置［91］。

5.5" 流式細胞術

流式細胞術是一種高通量的細胞分析方法。通過標記細胞表面和內部的特定標記物，如抗體或熒光染料，可以在流式細胞儀中對細胞進行快速準確的分析和鑒定。流式細胞術可以用于細胞的多參數分析，如細胞大小、形態、表面標記物等，可以快速鑒定不同細胞類型。通過單染流式細胞計量分析檢測包括肌動蛋白、肌球蛋白、原肌球蛋白和α-肌動蛋白在內的蛋白質。而肌纖維類型可以通過骨骼肌肌動蛋白和不同肌球蛋白的雙重標記流式細胞術來確定。流式細胞術能夠用多種抗體同時標記整個肌肉樣本，在某些應用中比傳統方法更具有優勢［92］。

Kosmac等［93］通過流式細胞術驗證得出可以明確識別出人類骨骼肌的巨噬細胞群體。Gattazzo等［94］使用流式細胞術概述了肌原細胞從出生到成年的異質性和動態，更好地理解肌原細胞在分化過程中的進展，并證明了這一過程具有復雜的肌原細胞狀態多樣性的特征。ACˇGamernik和Zupan［95］提出使用流式細胞術來準確定量間充質干細胞/基質細胞（MSCs）表面抗原。Krasniewski等［96］通過流式細胞儀分析證實了骨骼?。╯keletal muscle，SKM）中4個巨噬細胞亞群的存在。Montarras等［97］通過流式細胞術從成年骨骼肌中直接分離出表達（Pax3）的肌肉衛星細胞。Luk等［98］使用基于圖像的流式細胞術和細胞微量染料來監測衛星細胞的增殖，并識別衛星細胞分化的不同階段。Percopo等［99］通過流式細胞術挖掘出一種可以用來定量和檢測嗜酸性粒細胞，并從受過敏原感染的野生型和未受感染的小鼠的骨髓、脾和肺組織中分離出嗜酸性粒細胞的方法。從前人研究可以得到，使用流式細胞術可以很好的將目的細胞與其他細胞分離開，并可以監控細胞分化的情況。

5.6" 單細胞測序

單細胞轉錄組測序（scRNA-seq）技術在對生物機體發育的分子機制和細胞程序的研究中，逐步達到從單細胞水平研究生物發育的目的。

Coulis等［100］通過利用單細胞和空間轉錄組技術對骨骼肌纖維化巨噬細胞進行的研究，發現了6個不同巨噬細胞簇，確定了一種與纖維化相關的營養不良肌肉巨噬細胞的獨特轉錄譜。Giordani等［101］使用單細胞RNA測序和大量細胞術的結合方法，精確地繪制了成年小鼠肌肉中10種不同的單核細胞類型。發現了兩個之前未被充分研究的細胞群。其中一種在體外表達轉化因子并在體外產生肌腱細胞。第二種表達平滑肌和間充質細胞（smooth mesenchymal，MSCs）的標記物。Cai等［102］在牛骨骼肌中，通過scRNA-seq和scATAC-seq分析，在三個發育階段發現了不同類型的細胞類型，如脂肪細胞、內皮細胞、成皮細胞、成纖維細胞、淋巴細胞、單核細胞、周細胞和8個骨骼肌生成亞群。并預測了與肌肉發育相關的特異性表達的轉錄因子。Li等［103］利用scRNA-seq在雞的胸肌中鑒定出10個孵化后第5天發育階段的細胞簇和7個發育后期第100天的細胞簇。在第5天發現了5個肌細胞相關簇和2個脂肪細胞簇，在第100天發現了1個肌細胞簇和1個脂肪細胞簇。De Micheli等［104］使用scRNA-seq技術，通過無監督聚類，一共解析了16種來源于免疫、血管和基質的細胞，以及肌肉干/祖細胞（MuSCs）和一些肌纖維肌細胞核的兩個不同亞群，為研究人類肌肉組織的異質性和識別疾病環境中MuSCs的多樣性和失調的潛在靶點提供了參考。De Micheli等［105］一共鑒定了15種不同的細胞類型，包括肌肉干和祖細胞的異質群。通過配體-受體相互作用分析，確定了超過100對突變細胞和非肌原細胞之間與再生相關的旁分泌通信對，為研究肌肉再生過程中細胞通訊的相互作用提供了參考。通過利用單細胞測序技術，可以更好的對肌肉組織細胞類群進行分類，對細胞異質性有更好的研究，為進一步研究肌纖維發育提供有力的支持。

6" 展" 望

隨著現代科技分子生物技術的快速發展，對細胞類型鑒定的方法多種多樣，在單細胞轉錄組測序技術的支持下用標記基因來鑒定細胞類群的方法運用的最為廣泛且準確。通過不同標記基因的方法鑒定與肌纖維發育過程相關的細胞，可以大致將骨骼肌分為12多種細胞類型。肌纖維發育和分化是影響肉品質最重要的因素，深入探究其在不同發育階段的細胞組成與變化是必要的。尋找與肌纖維數量、面積和脂肪沉積方面相關的細胞類型，發現與之相關的關鍵調控因子，為進一步更好的了解肌纖維發育提供理論依據。

隨著人們生活水平的提高，追求好吃且健康的肉類成為趨勢，根據不同畜禽骨骼肌發育的差異，在未來可以通過整合多組學的方法，將不同組學如代謝組、蛋白組、表型組和空間轉錄組等互相組合的方式，更好地揭示在不同狀態或者形態下畜禽骨骼肌發育情況，得到影響不同畜禽肉品質差異的分子調控機制。同樣可以運用多組學的方法分析影響肌纖維發育相關的細胞通訊網絡及通路，為進一步探究不同畜禽肉品質提供方向。也可以通過機器算法，代入育種模型中，將理論與實踐相結合，發現新的肌肉細胞標記和調控機制，為未來選育新品種提供參考。

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（編輯" 郭云雁）