副豬格拉瑟菌的莢膜分型方法及原理研究進展

摘" 要： 副豬格拉瑟菌（GPS）是豬的重要病原菌之一，自1910年被確認為豬格拉瑟病的病原以來，血清型鑒定是 GPS 研究領域長期以來的“卡脖子”環節。1992年，基于 GPS 熱穩定抗原的凝膠免疫擴散試驗（GID）分型方法首次將GPS 分為1-15型，但有約25%的菌株不可分型，當時對于其分型抗原的成分也不明確。2003年，基于GPS的“鹽水提取物”抗原建立了GPS的間接血凝試驗（IHA）分型方法，其敏感性和分型率均高于 GID，但仍有約15%的菌株不可分型。IHA和GID方法的分型結果基本一致，因此能夠確定兩者的分型抗原是基于相同的 GPS 表面多糖成分，但仍不能確定是莢膜多糖，或是LPS，甚或是其他多糖物質。2013年，1-15型GPS 莢膜多糖的合成基因簇得到成功解析，證實其血清型抗原形成的本質是莢膜多糖。2015年，Howell等基于GPS 莢膜的特異性靶基因設計引物，建立了 GPS 的PCR分型方法（H-PCR），但不能對血清5型和12型進行鑒別；2017年，Jia等基于GPS 莢膜的特異性靶基因也建立了一套 PCR 分型方法（J-PCR），能對血清5型和12型進行了鑒別。兩種PCR分型方法配合使用可對幾乎所有 GPS 菌株分型，并從分子生物學基礎上驗證了其與GID和IHA方法的一致性，最終確認三種分型方法的抗原基礎均為GPS莢膜。PCR分型方法具有操作簡單、速度快、成本低等優點，成功解決了GID和IHA血清分型方法中的諸多問題，得到了廣泛應用。本文系統回顧了GPS GID、IHA 和 PCR 分型方法的建立與應用歷史，及其相同抗原基礎的發現歷程，以期為GPS三種分型方法的免疫學物質基礎及原理提供系統的理論知識，為副豬格拉瑟菌病防控技術的研發提供新思路。

關鍵詞： 副豬格拉瑟菌；莢膜；血清型；凝膠免疫擴散試驗（GID）；間接血凝試驗（IHA）；PCR

中圖分類號：S852.61

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）12-5412-11

doi： 10.11843/j.issn.0366-6964.2024.12.008

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

收稿日期：2024-01-26

基金項目：國家自然科學基金項目（31672530；U1704117）

作者簡介：朱亞新（1998-），女，河南新鄉人，碩士生，主要從事家畜傳染病及其檢測技術研究，E-mail： zhuyaxin0822@163.com

*通信作者：趙戰勤，主要從事家畜傳染病及其疫苗研究，E-mail：zhaozhanqin@126.com

Advances in Capsular Typing Method and Principle of Glaesserella parasuis

ZHU Yaxin1， GUAN" Lijun1，2， ZHANG" Junfeng1， XUE" Yun1， ZHAO" Zhanqin1，2*

（1.Key Lab of Animal Bacterial Infectious Disease Prevention and Control Technology， College of

Animal Science and Technology， Henan University of Science and Technology， Luoyang 471003，" China;

2.Key-Disciplines Lab of safety of environment and Animal Product， College of Animal Science and

Technology， Henan University of Science and Technology， Luoyang 471003，" China）

Abstract：" Glaesserella parasuis （GPS） is one of the important pathogenic bacteria in pigs， and serotype identification has been a long-standing \"bottleneck\" in the field of GPS research since it was identified as the causative agent of Glasser's disease in pigs in 1910. In 1992， the gel immunodiffusion（GID） typing method based on GPS heat-stable antigens classified GPS as 1-15 for the first time， but about 25% of the strains were not typed， and the composition of the typed antigen was not clear at that time. In 2003， an indirect hemagglutination assay （IHA） typing method for GPS-based \"saline extract\" antigen was established， and its sensitivity and typing rate were higher than those of GID， but about 15% of the strains were still untypeable. The typing results of IHA and GID methods are generally identical， so it is possible to determine whether the typed antigens are based on the same GPS surface polysaccharide composition， but it is still not certain whether it is a capsular polysaccharide， or LPS， or even other polysaccharide species. In 2013， the synthetic gene cluster of GPS serotype 1-15 capsular polysaccharide was successfully analyzed， which confirmed that the essence of serotype antigen formation was capsular polysaccharide. In 2015， Howell et al. designed primers based on the specific target genes of GPS capsule， and established a PCR typing method for GPS （H-PCR）， but it could not distinguish serotype 5 and 12. In 2017， Jia et al. also established a set of PCR typing methods （J-PCR） for specific target genes based on GPS capsule， which could identify serotypes 5 and 12. The combination of the two PCR typing methods was able to type almost all GPS strains， and their consistency with the GID and IHA methods was verified from molecular biology， and the antigen basis of the three typing methods was finally confirmed to be GPS capsule. The PCR typing method has the advantages of simple operation， fast speed and low cost， and has successfully solved many problems in GID and IHA serotyping methods， and has been widely used. In this paper， we systematically reviewed the history of the establishment and application of GPS GID， IHA and PCR typing methods， as well as the discovery process of the same antigen basis， in order to provide systematic theoretical knowledge for the immunological material basis and principle of the three GPS typing methods， and to provide new ideas for the research and development of Glasser's disease prevention and control technology.

Key words： Glaesserella parasuis; capsule; serotype; gel immunodiffusion （GID）; indirect hemagglutination assay （IHA）; PCR

*Corresponding author：ZHAO" Zhanqin，E-mail：zhaozhanqin@126.com英文通信作者

副豬格拉瑟菌（Glaesserella parasuis， GPS）是巴氏桿菌科的一種革蘭陰性小桿菌，可引起豬的多發性漿膜炎、關節炎或敗血癥，稱為副豬格拉瑟菌病，又稱格拉瑟氏病（Glsser’s disease）［1］。近年來，GPS在世界范圍內廣泛流行并致病，是養豬業的重要細菌性傳染病之一［2-3］。各年齡段的豬均能感染GPS，其中斷奶仔豬和保育仔豬最易感［4］。目前預防該病主要依靠接種疫苗，現在市面上的商業化疫苗主要是菌體滅活疫苗；但由于GPS血清型眾多，各血清型之間缺乏交叉保護力，滅活疫苗對各種血清型的保護效果參差不齊［5-7］。

血清型是基于血清抗體反應進行分類的微生物表面特異性抗原型，這些抗原通常是重要的表面多糖或蛋白質，包括莢膜、脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）、鞭毛和菌毛等。血清分型是鑒別病原微生物重要結構成分和抗原特征的重要手段，也是傳染病疫情監測和病原系統發育研究的重要工具，對于指導診斷試劑和疫苗的研發均具有重要意義［8-10］。對GPS進行血清分型的傳統方法主要包括凝膠免疫擴散試驗（gel immunodiffusion，GID）和間接血凝試驗（indirect hemagglutination assay，IHA）分型方法，兩者均是基于抗血清和細菌表面抗原之間的反應，將 GPS 分為 15 個血清型，另外還有相當數量的不可分型菌株［11-12］。但是，兩種方法對GPS 血清分型的抗原成分曾長期不明確，推測應為某種多糖成分，但不能確定是莢膜多糖還是 LPS。2013年，Howell等［7］對 GPS 1-15型參考菌株中該片段進行分析，發現該區域包含編碼 I 類莢膜基因座的wza、wzb和wzc基因同源物，因此認為該區域實際上編碼莢膜多糖，且 GPS 的莢膜應是 I 類莢膜，其莢膜基因座類型與分離株的血清型高度相關，是 GPS 血清型的主要決定因素［7，13-16］。2015年，Howell等［17］又基于15個血清型參考菌株的莢膜特異性基因建立了 PCR 分型方法，相對于 GID 和 IHA 方法，該方法檢測更快速、準確，且分型率較高。本文系統回顧了GPS" GID、IHA 和 PCR 分型方法的建立與應用歷史，及其相同抗原基礎的發現歷程，以期為GPS三種分型方法的免疫學物質基礎及原理提供系統的理論知識，為副豬格拉瑟菌病防控技術的研發提供新思路。

1" 瓊脂凝膠擴散試驗分型

1955年，德國學者Bakos以副豬格拉瑟菌的37℃菌體表面提取物為抗原，通過沉淀試驗從120個 GPS 分離株中鑒別出4種不同的血清型（A、B、C和D）［12］。1986年，瑞士學者Morozumi和Nicolet［11］及Nicolet等［18］分別使用未處理菌體抗原，以及不同溫度處理的（4、60、100和121℃）菌體上清液作為抗原，通過凝集試驗和 GID 試驗對分離自日本和瑞士的32個 GPS 分離株進行檢測，結果顯示基于121℃高壓處理的熱穩定抗原可特異性地對其中 26 個菌株鑒別為5種不同的血清型（1-5型）；同年他們又用同樣的方法進一步鑒別出了6型和7型（6-7型）［12］。這種特異性抗原對熱穩定且可溶，不受鏈酶蛋白酶處理的影響，但可被苯酚提取，提示其主要成分可能為多糖。1991年，Kielstein等［19］參考上述瑞士學者Morozumi等和Nicolet等的方法，使用 GPS 的高壓菌體抗原，通過 GID 試驗（Morozumi和Nicolet等）對來自德國的158個 GPS 分離株（有8個是吲哚陽性的副豬格拉瑟菌樣菌株）進行鑒定，對115株（115/158，72.8%）成功分型，其中95株（95/158，60.1%）被鑒別為已知的血清型1-5型（Morozumi和Nicolet等），另有20株（20/158，12.7%）被鑒別為7個新的血清型（Jena 6-Jena 12）。但是后來，由于Jena 7-Jena 9的5個菌株呈吲哚陽性，判定為非副豬格拉瑟菌而剔除。在該試驗中，再次驗證了這種特異性抗原對熱穩定且可溶，不受鏈酶蛋白酶處理的影響，但可被苯酚提取，提示其主要成分為多糖。1992年，美國學者Rapp-Gabrielson和Gabrielson［20］使用具有熱穩定性的 GPS 的高壓菌體抗原，通過 GID 試驗對來自北美的243個 GPS 分離株進行檢測，從中共鑒別出14種血清型，其中有9種是先前已鑒別出的C、D和1-7型，另外5種是新的血清型，命名為ND1-ND5型。至此，各國學者對于GPS血清分型的獨立研究先后確定了血清型A-D、1-7、Jena6-Jena12和ND1-ND5。

1992年，德國學者Kielstein（德國耶拿動物細菌病研究所）和美國學者Rapp-Gabrielson（美國北達科他州大學農業學院獸醫和微生物科學系）進行合作研究，通過特異性兔抗血清和熱穩定性抗原的 GID 試驗，進一步對上述 GPS 血清型的研究成果進行了集成和創新，保留了先前定義的血清型1-7，而 Jena 和 ND 血清型被指定為血清型8-15；即對已分出的血清型重新排列后，將 GPS 劃分為15個血清型并確認了15個參考菌株，這成為至今仍在使用的 GPS 血清分型統一方案（Kielstein-Rapp-Gabrielson，KRG）［12］。該研究對德國290個 GPS 分離株進行檢測表明，血清型4和5的菌株流行率最高，共有119個分離株（119/290，41%）。另有76株（76/290，26.2%）通過該方法不能被分型［12］。

KRG方案的建立，使 GPS 的血清型種類更明晰，且成立了一套完整的 GPS 血清分型的 GID 方法體系，在 GPS 分型鑒定中發揮了巨大的作用，該方法很快得到了廣泛的應用。1996年，Blackall等［21］根據KRG方案，使用高壓滅菌的菌體抗原通過 GID 試驗對分離自澳大利亞的31個 GPS 分離株進行血清型鑒定，對其中26株（26/31，84%）成功分型。該研究首次發現應用該方法時血清型7和10之間會出現交叉反應，另外，該方法仍有部分菌株不能分型，作者推測其可能只產生少量的血清型特異性抗原，以至于在凝膠擴散試驗中不能被檢測到。2000年，Rafiee和Blackall［22］使用高壓處理的方法制備KRG方案中的15個參考菌株的抗血清，其中血清型1和7用的菌株分別是澳大利亞分離株HS145和HS197（1996年，Blackall等），其余13個血清型均為KRG方案中的參考菌株。用制備的15種抗血清通過GID試驗對KRG方案中的15個參考菌株進行檢測，發現除了4型抗血清和14型抗原發生了單向交叉反應外，其他14種均獲得了特異性的抗血清。但作者認為KRG方案中制備高效價的兔抗血清是比較困難的，因為各血清型菌株抗原需要對兔進行4次或更多次的免疫，即使這樣有時仍不能制備成功，需要使用新的兔重復制備，或更換參考菌株（1型和7型菌株）進行重新制備。作者使用制備的15種抗血清對先前已分型的15個澳大利亞分離株進行鑒定，得到了與預期一致的結果，證明這些抗血清是準確且可用的。后來，進一步使用制備的15個參考抗血清對分離自澳大利亞的46個分離株進行 GID 血清分型，共對27個（27/46，58.8%）菌株成功分型［22］。2013年，Luppi等［23］使用超免疫兔抗血清和高壓菌體抗原，通過 GID 方法對分離自意大利北部的106個 GPS 分離株進行分型，可對77株（77/106，72.7%）成功分型，另有29株（29/106，27.3%）不可分型。

KRG方案的 GID 分型方法所需實驗儀器簡單，常規實驗室即可開展該試驗，極大地促進了 GPS 的血清分型，已成為國際公認的血清分型方法［11-12，22］，但仍有25%左右的菌株不可分型，且制備抗血清困難以及常出現交叉反應［22］。另外更重要的是，當時通過GID方法進行GPS血清分型的抗原物質尚不清楚，推測是一種多糖，但具體的成分還需做進一步的研究［12］。

2" 間接血凝試驗分型

KRG方案已經提出 GPS 有15個血清型，是國際公認的血清分型方法。但有血清分型研究報告該方法對有些 GPS 分離株無法分型，這表明KRG方案存在局限性［12，22］，另外，GPS 血清分型的抗原成分仍不清楚，因此其他血清學分型方法也相繼被開發出來，在拓展 GPS 血清分型方法的同時，也對其抗原物質基礎進行了探索。IHA 試驗是將可溶性抗原（一般為多糖）先吸附到與免疫無關的顆粒狀載體（例如紅細胞）表面上，成為致敏的載體，然后與相應的抗體結合，而使紅細胞連接而聚集在一起，出現可見的凝集反應。該方法早已應用于胸膜肺炎放線桿菌的血清分型［24-25］。2003年，Del Río等［26］制備了 GPS 的15個血清型參考抗血清，以“鹽水提取物”“煮沸提取物”和“高壓提取物”作為抗原，使用以綿羊紅細胞（SRBC）為載體的IHA對 GPS 進行血清分型，結果顯示吸附在SRBC上的血清型抗原是特異性的，其中“鹽水提取物”顯示出最強的特異性和敏感性，其次是“煮沸提取物”。盡管高壓滅菌的提取物是 GID 中的首選抗原［11，22］，但其在 IHA 中卻表現最低的血清型特異性，可能是因為在121℃下加熱2 h改變了靶抗原的免疫學活性，從而降低或喪失了對SRBC的吸附能力。另外，不經加熱處理的“鹽水提取物”的血清反應特異性最強，表明 GPS 的某種表面抗原，而不是深層抗原，與其血清型抗原的特異性相關，胸膜肺炎放線桿菌的血清分型也存在相似的情況［27］。最后，Del Río等［26］以 GPS “鹽水提取物”為抗原，通過 IHA 與 GID 對67株菌株進行血清分型，分型率分別為91%（61/67）和62.7%（42/67），這表明 IHA 較 GID 方法大大提高了 GPS 的分型率。此方法得到了廣泛的應用，并成為 GPS 血清分型的“金標準”。

2004年，Tadjine等［28］制備了15個參考菌株的兔抗血清，以15個參考菌株的滅活菌液的“煮沸提取物”作為 GID 和 IHA 的共同抗原，首先分別用兩個方法鑒定上述制備的抗血清，發現其均具有血清型特異性，只有輕微的交叉反應（GID 中的1型和5型存在單向交叉反應，不影響判定結果）；同時 Tadjine 等［28］對300個 GPS 分離株檢測，GID 常出現交叉反應且有30%以上菌株無法分型，而 IHA 沒有交叉反應且分型率可達90%以上。由于細菌的LPS 可以直接吸附在 SRBC 表面，而蛋白抗原需要用單寧酸、雙二聯苯胺、氯化鉻等對紅細胞進行預處理才能吸附［29］；因此Tadjine等推測吸附在 SRBC 表面的“煮沸提取物”中的熱穩定、血清型特異性抗原可能是 LPS 而非蛋白質抗原。另外，基于瓊脂為反應體系的 GID 需要高濃度的抗原和抗體才能發生肉眼可見的沉淀反應，敏感性較弱，而IHA試驗中抗原和抗體不需要任何介質直接結合，敏感性較強；因此Tadjine等認為用于 GPS 血清分型的IHA的敏感性遠高于GID［28］。同在2004年，Angen等［30］以“高壓提取物”為抗原，通過GID對57株中的30個臨床分離株成功分型（30/57，53%）；而以“煮沸提取物”抗原［27-28］，通過 IHA 對其中的49個成功分型（49/57，85%）；結果顯示兩種方法的分型結果基本一致，只有3個分離株顯示出輕微偏差，但 IHA 的分型率遠高于 GID［30］。2005年，蔡旭旺等［31］以“高壓提取物”為抗原，通過GID對281個 GPS 分離株中的178個成功分型（178/281，63.3%）；而以“鹽水提取物”為抗原，通過 IHA 對其中的254個成功分型（254/281，90.4%）；兩者分型結果基本一致，但 IHA 的分型率遠高于 GID。至此，所有的相關比較研究均認為 IHA 和 GID 的分型結果具有良好的相關性，而 IHA 的敏感性更強，分型率高于 GID，因此建議將IHA作為 GPS 血清分型的首選方法［27-28，30-31］。2012年，Zhang 等［32］首先以“高壓提取物”為抗原的 GID 進行血清型鑒定，然后輔以“鹽水提取物”為抗原的IHA鑒定，對112個臨床分離株中89個（分型率為79.5%）成功進行了分型，另有23個是兩種方法都無法分型的菌株。

綜上所述，基于 GID 和 IHA 的免疫學原理和臨床使用效果，能夠確定兩種血清分型方法的靶抗原應是相同的，但 IHA 的敏感性和分型率均應高于 GID［28］；兩種方法相互協作的情況下，仍有相當比例的菌株不可分型［30］。更重要的是，基于當時的研究（在2013年，Howell等［7］解析GPS莢膜基因簇以前）GPS 血清分型的抗原成分仍不明確，推測應為某種多糖成分，但不能確定是莢膜多糖還是 LPS。兩種方法對 GPS 進行血清分型時，均存在下述問題：①特異性抗血清制備程序復雜且操作流程繁瑣；②非標準化的抗血清效價存在差異，其靈敏度也常有變化；③當對臨床分離株進行血清分型時，常出現交叉反應；④因其結果需要操作者目視判讀，因此人為錯誤也會導致分型的精確度降低［17］。

3" GPS 莢膜分型的分子生物學基礎

莢膜是存在于某些細菌細胞壁外的一層黏液性物質，多由糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG；曾稱黏多糖、氨基多糖或酸性多糖）組成，是細菌重要的結構成分和致病因子，在黏附宿主細胞、抵抗吞噬和發生免疫逃逸等方面起著關鍵作用［33-35］。

基于血清抗體和病原表面抗原之間的反應，GID和IHA方法已將 GPS 分為15個血清型，推測其血清分型抗原應為某種多糖成分，但不能確定是莢膜還是LPS［12，28］，甚至也可能是兩者之外的其它成分。PCR分型方法基于細菌表面多糖（如莢膜或LPS）生物合成的相關基因，已被成功用于多種細菌的血清分型［36-39］。莢膜或LPS在 GPS 與宿主的相互作用中均扮演了重要角色，而對其本質的明確定義是解析 GPS 血清分型抗原成分的關鍵。

1964年，Williamson和Zamenhof［40］首次分離出 GPS 的莢膜物質，發現其由磷酸二酯鍵聚合的α-半乳糖-α-N-乙酰氨基葡萄糖苷二糖重復單元組成。1986年，Morozumi和Nicolet［41］通過形態學觀察（菌落虹彩現象和莢膜染色試驗）、吖啶黃凝集試驗和十六烷基三甲基溴化銨電泳試驗（cetavlon electrophoresis）證實9個 GPS 臨床分離株存在莢膜，且驗證了 GPS 莢膜具有可溶、耐熱和抵抗蛋白酶水解的性質，成分為酸性多糖。2011年，Xu等首次報道了 GPS 血清5型SH0165株的全基因組序列（登錄號：CP001321），發現了一個14 kb的多糖生物合成基因簇（從HAPS0039到HAPS0052），注釋該基因簇編碼O抗原多糖［7，42］。

2013年，Howell等［7］對 GPS 15個血清型參考菌株的基因組進行測序，并與SH0165株的HAPS0039-HAPS0052基因簇序列對比分析，發現該基因簇分為R1和R2兩個區域，其中R1區域（HAPS0049-HAPS0051）為wza-wzc基因的同源物，是 I 類莢膜合成和輸出的特有保守基因，從而證實該基因簇編碼的是 GPS 的 I 類莢膜，而不是 O 抗原多糖（圖1）［43-44］。wzx和wzy同時參與 I 類莢膜多糖和LPS或脂寡糖（lipo-oligosaccharides，LOS）的生物合成，而wza-wzc只參與I類莢膜的生物合成［14，44-46］。GPS 的HAPS0052基因位于R1區域之后，是iscR基因的同源物，含有一個HTH DNA 結合域（helix-turn-helix DNA binding motif），是與莢膜合成基因簇啟動子區域結合的部位，正向調控莢膜 GAG 基因的轉錄（圖1和圖2）。HAPS0039基因位于R2區域之前，因為是Howell等發現的首個未知功能的基因而被命名為funA（function unknown gene A），同時在R2區域還存在一些未知功能的基因，分別被命名為funB-funZ（圖2）。R2區域位于funA和wza之間，除血清5型和12型外，其他13個血清型參考菌株在此區域的基因組成均有不同，包含參與寡糖重復單元合成的多種基因，能合成不同血清型的莢膜多糖。因此，R2區域是潛在的血清型特異性區域，是設計PCR分型引物的靶標區域（圖2）［7］。

GPS 血清5型和12型的莢膜生物合成基因簇由相同的基因構成；但兩者編碼的氨基酸序列對比分析發現，除R2區域的iscR和wzb完全相同外，其余12個CDS共存在48個氨基酸位點不同，而且在莢膜多糖合成的兩個關鍵酶的基因wbgY（編碼糖基轉移酶）和wzx（編碼翻轉酶）的差異位點最多；另外，蛋白質結構預測分析顯示，48個差異性位點中有40個氨基酸的變化可能導致蛋白質的結構改變；與血清12型相比，血清5型的莢膜合成基因簇中還含有一個額外的啟動子［7］；這些差異足以導致兩者合成不同血清型的莢膜多糖。另外，血清5型和12型參考菌株的全基因組也有較大差異，兩者核苷酸序列的相似性僅有81.7%［7］。

2014年，Howell等［16］對117株 GPS 莢膜基因簇序列（funA-iscR）的相似性的比較結果顯示，相同血清型的 GPS 菌株，即使他們親緣關系較遠，莢膜基因簇的位置和構成也是相同的，說明莢膜基因簇是 GPS 血清型的主要決定因素；同時發現血清6型莢膜基因簇序列的具有85%以上的相似性，而血清1型、2型、3型、4型、5/12型、7型、8型、9型、13型和15型不同菌株的相似性均在98%以上（血

清10型、11型和14型各僅有1個菌株，無法比較相似性）；另外，基于這些菌株還發現了莢膜基因簇之外的23個潛在的血清型特異性基因，包括5個先前鑒定過的莢膜基因、3個噬菌體基因、1個轉座酶基因、1個絲狀血凝素基因和13個功能未知的基因。

4" GPS 的PCR分型方法及應用

前期研究成功解析了 GPS 莢膜多糖的合成基因簇，證實該基因簇是 GPS 莢膜血清型形成的決定因素［7，16］。GPS 莢膜基因簇的R2區域是血清型抗原合成的特異性區域，包括轉氨酶基因、糖基轉移酶基因、翻轉酶基因以及一些功能未知的基因（圖2），這些基因在核苷酸水平的相似性在51%以下［7，16］。細菌的PCR分型方法主要基于菌體莢膜或LPS生物合成的相關基因而建立，已被成功用于多種細菌的血清分型［36-39］。因此，也可基于 GPS 莢膜多糖合成基因簇中的型特異性基因建立 GPS 莢膜抗原的 PCR 分型方法。

2015年，Howell等［17］以 GPS 莢膜多糖基因簇R2區域中的特異性基因序列為靶點設計引物，建立了鑒定 GPS 莢膜1-15血清型的PCR方法；但是，由于 GPS 血清5型和12型的莢膜多糖基因簇由相同的基因構成，導致這兩個血清型未能區分開來［7，17］。本研究中，由于 GPS 血清1型、2型和11型的莢膜基因簇缺乏足夠的特異性靶點基因或差異性基因，因此Howell等建立的PCR分型方法不能直接將三者區分開來。該PCR分型方法中，1型引物選擇的特異性靶點基因為funB，但是11型含有完全相同的funB基因，2型含有相似性較高的funE同源基因；當PCR鑒定1型菌株時，11型會出現陽性結果，2型會出現弱陽性結果。因此，需要通過11型和2型的特異性引物（兩者的靶點基因分別為amtA和wzx）進一步與1型鑒別開來。同時，2型引物選擇的靶點基因為wzx，其他多個血清型也含有wzx基因，但是血清2型與其他型的wzx基因具有差異性較大的遺傳變異序列。Howell等使用該PCR方法對150個臨床分離株的分型率為100%，且與其莢膜基因簇測序分型的結果完全相符；IHA對其中117個菌株的分型率為84%（98/117），共有84株與PCR分型結果一致，符合率為85.7%（不包括IHA不可分型的菌株）。該PCR方法對另外84株 GPS （未經莢膜基因簇測序分型）的分型率也為100%，IHA對其中66個菌株的分型率為77%（51/66），共有45株與PCR分型結果一致，符合率為88.2%（不包括IHA不可分型的菌株）。Howell等［17］建立的PCR分型方法快速、靈敏、特異，進一步減少了不可分型率、交叉反應和檢測成本，且可對直接來源于菌落的粗提 DNA 進行檢測，迅速得到了廣泛應用。

2016年，Ma等［47］同時使用PCR和GID對100株 GPS 進行分型，結果顯示兩種方法的分型率分別為93%和73%，兩者的符合率為66%（66/100）；對其中11株 GPS ，包括兩種方法分型結果不一致的9株（不包括PCR能定型而GID未能定型的菌株）和均不能定型的2株，進行了莢膜基因簇的測序分析，結果顯示這些菌株莢膜基因簇中存在基因缺失、插入、變異和漂移的情況，表明 GPS 莢膜基因簇存在一定的遺傳不穩定性［47-49］。2017年，Wang等［50］使用該mPCR對254個 GPS 分離株（中國四川）的分型率為92.13%（234/254），20個菌株不能分型。2021年，Macedo等［51］使用該mPCR對950個 GPS 分離株（美國223株，歐洲436株，中國167株，越南56株，加拿大68株）的分型率為93.3%（886/950），64個菌株不能分型。2022年，Silva等［52］使用mPCR方法對105個 GPS 分離株（巴西）的分型率為100%。這些大量菌株的分型數據表明，Howell等建立的PCR方法對 GPS 的分型率整體上在92%以上，但仍需要用傳統的 GID 或 IHA 方法進行5型和12型的鑒別［7，17］。

2017年，Jia等［53］通過比較分析 GPS 莢膜合成的基因簇序列發現12型含有一功能尚不明確的假定基因（Hypothetical gene），而5型和其他血清型不含有該假定基因，因此利用該基因設計引物并建立了血清5型和12型的PCR鑒別方法。同時，Jia等重新設計了其他血清型的PCR引物并建立了能夠區分1-15血清型 GPS 的整套 PCR 方法。Jia等的PCR方法（命名為J-PCR）中，血清1型、7型、8型、9型、10型和14型引物的靶基因名稱與Howell等的方法（命名為H-PCR）相同，但引物序列不同。其他血清型引物的靶基因名稱和引物序列與Howell等均不相同［53］。Jia等［53］同時使用該PCR方法與IHA對298個 GPS 菌株進行分型，兩者的分型率分別為94.30%（281/298）和76.51%（228/298），符合率為80.87%（241/298），其符合率均稍低于Howell等［17］的H-PCR方法（85.7%和88.2%）。Jia等的J-PCR分型方法建立之后，通常與Howell等的H-PCR方法配合使用，即對于H-PCR無法區分的血清5型和12型菌株，用J-PCR方法中的血清12型的特異性引物對其進行鑒別［17，53］。2018年，Li等［54］結合使用H-PCR和J-PCR兩種方法對148個 GPS 分離株（中國東部）進行分型，分型率為97.3%（144/148），有4個菌株不能分型。

2020年，Schuwerk等［55］使用H-PCR方法對308株中的297株 GPS （德國）成功進行分型，分型率為96.4%；其中，鑒定為5/12型的46個菌株經J-PCR方法可進一步區分出16株5型和28株12型，另有2株不能區分；但是，經J-PCR鑒定為12型的28株 GPS 中，使用其5/12型引物僅有10株呈PCR陽性，18株呈PCR陰性，表明Jia等的5/12型通用引物易出現假陰性結果；因此，進行 GPS 的PCR分型時可選擇Howell等基于靶基因wcwK設計的5/12型通用引物。在其他251個分型菌株中，兩種PCR方法分型不一致的菌株僅有20個，且僅限于血清1型、2型和11型。其中，16個菌株經H-PCR鑒定為血清2型（引物靶基因為wzx），但使用1型引物（靶基因為funB）鑒定這些菌株時也會產生弱陽性條帶，因為2型莢膜基因簇中還含有funB的同源基因funE［17］；但是，這16個菌株經J-PCR方法均可特異性鑒定為2型，因為其引物源自funE中與funB完全不同的變異序列；因此，進行血清2型 GPS 的鑒定時可優先選擇Jia等基于靶基因funE設計的引物。另有2個菌株經H-PCR和J-PCR均鑒定為血清11型（引物靶基因分別為amtA和actA）；使用1型引物（引物靶基因均為funB）鑒定這些菌株時也會產生陽性條帶，因為11型莢膜基因簇中也含有基因funB，但根據兩者基于靶基因設計引物的原理均應判定為11型［17，53］。另外，2個菌株經兩種PCR方法均無法分型，其中在H-PCR中同時呈1型、2型和11型陽性，在J-PCR中同時呈2型和11型陽性，其莢膜基因簇中可能存在基因漂移的情況［49］。此外，多位學者對 GPS 菌株使用這兩種PCR分型方法對大量的 GPS 菌株進行分型，均能取得良好的分型效果，得到良好的應用［55-60］。

5" 總結與展望

副豬格拉瑟菌病是世界范圍內危害養豬業的最主要細菌性傳染病之一，GPS 的血清分型是掌握其流行情況和防控該病的關鍵環節［4］。1992年，Kielstein和Rapp-Gabrielson［12］基于熱穩定性抗原的 GID 試驗首次建立了1-15型 GPS 的血清分型方法，但有25%左右的菌株不可分型，且其抗原成分不明確。2003年，Del Río等［27］基于“鹽水提取物”抗原建立了 GPS 的 IHA 血清分型方法，該方法中抗原制備簡單，且其敏感性和分型率均高于 GID，逐漸成為 GPS 血清分型的“金標準”，對 GPS 的血清分型起到極大的推進作用。IHA和GID的分型結果基本一致，因此能夠確定兩者的分型抗原是基于相同的 GPS 表面多糖成分，但不能確定是莢膜多糖，或是LPS（LOS），甚或是其他多糖物質［12，19，27-28］。

2013年，Howell等［7］成功解析了血清1-15型 GPS 莢膜多糖的合成基因簇，證實該基因簇是 GPS 莢膜血清型形成的本質因素；2015年，Howell等［17］又基于 GPS 莢膜的特異性靶基因設計引物，建立了 GPS 的PCR分型方法（血清5型和12型不能區分），并驗證了其與 GID 和 IHA 分型結果的一致性，確認了GID、IHA和PCR三種分型方法的抗原基礎均為 GPS 莢膜。2017年，Jia等［53］基于 GPS 莢膜的特異性靶基因也建立了相似的 PCR 分型方法，并對血清5型和12型進行了鑒別。兩種PCR分型方法配合使用基本可對所有 GPS 菌株分型，且具有操作簡單、速度快、成本低等優點，解決了GID和IHA血清分型方法的諸多問題，得到了廣泛應用［55-60］。

回顧 GPS 分型方法的建立和應用歷史，基于熱穩定性抗原莢膜建立的GID分型方法在對 GPS 進行分型的過程中常出現非特異性反應［21-22］，推測主要是同樣具有熱穩定性的LPS（或LOS）抗原的干擾所致。因此，在通過 GID 對 GPS 進行血清分型時，可通過對莢膜多糖進行純化并標定抗原價，同時使用純化莢膜多糖制備的標準血清抗體，從而降低或排除LPS（或LOS）等抗原的干擾及其非特異性反應的發生。同時，IHA分型方法中產生非特異性反應的因素也應是LPS（或LOS）抗原主要導致的，因為其具有與莢膜多糖相似的吸附SRBC的特性［29］，因此也可參照上述方法降低或排除其非特異性反應。此外，為了更好地理解莢膜多糖分型的分子免疫反應機理，尚需對 GPS 莢膜多糖的成分與結構、基因簇及功能、分子合成機制等進行深入解析［61］。

當使用PCR方法對 GPS 進行分型時，H-PCR和J-PCR方法可配合使用。在H-PCR的基礎上，J-PCR方法進一步實現了5型和12型的鑒別［17，53］；但是，Jia等的5/12型通用引物易出現假陰性結果；因此可首先選擇Howell等基于靶基因wcwK設計的5/12型通用引物，然后再用Jia等設計的12型引物進行鑒別［55］。在鑒定血清2型 GPS 時，可優先選擇Jia等基于靶基因funE設計的引物，因為H-PCR中2型菌株還會出現1型的非特異性陽性條帶［17，53］。另外，GPS 莢膜基因簇具有一定的遺傳不穩定性，可能存在基因缺失、插入、變異和漂移等情況，會導致少量不可分型的菌株，可通過莢膜基因簇的DNA序列分析進一步了解其結構特征性［47-49，55］。

莢膜多糖和LPS（或LOS）為革蘭陰性菌血清分型的兩種重要菌體表面抗原物質。已有研究表明，與巴氏桿菌科的其他細菌相似，GPS 除含有莢膜多糖抗原外，還含有LOS抗原［61-66］，為了更好地理解 GPS 的基本結構及其血清型，還需對 GPS LOS的血清分型、LOS的成分與結構、LOS的生物合成基因簇及功能等進行系統研究［61］。

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（編輯" 白永平）