動物腸類器官應用進展

摘" 要： 近年來，多種家畜和伴侶動物的腸類器官培養方法已被建立。腸類器官具有腸道上皮的結構和功能，是介于穩定細胞系和動物模型之間的一種體外模型。目前，動物腸類器官可用于研究腸道疾病發病機制與治療方法，還能用于探究宿主-病原體的相互作用。在腸道營養學與腸道免疫學的研究中，腸類器官可用于提高飼料利用率、尋找適合添加劑，提高動物性能。此外，動物腸類器官在人轉化醫學與再生醫學領域具有巨大發展潛力。本文綜述了近5年來動物腸類器官的主要應用，并對其未來的研究方向進行了展望。

關鍵詞： 動物；腸類器官；應用

中圖分類號： Q813.11

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）12-5431-09

收稿日期：2023-12-01

基金項目：廣州市基礎與應用基礎研究（SL2022A04J01164）；廣東大學生科技創新培育專項資金資助項目（pdjh2021b0083）

作者簡介：黃德如（1999-），女，廣東東莞人，碩士生，主要從事犬乳腺腫瘤研究，E-mail：Huangdr1999@163.com

*通信作者：陳奡蕾，主要從事小動物疾病和馬病研究，E-mail： chenolay@scau.edu.cn

doi： 10.11843/j.issn.0366-6964.2024.12.010

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Progress on Application of Animal Intestinal Organoids

HUANG" Deru， CHANG" Yirui， DING" Ziyan， ZHANG" Yashan， CHEN" Aolei*

（Guangdong Technological Engineering Research Center for Pet， College of Veterinary， South China Agricultural University， Guangzhou 510642，" China）

Abstract：" Multiple methods for culturing intestinal organoids from domestic animals and companion animals have been established recently. Intestinal organoids exemplify the structures and functions of intestinal epithelium， being an in vitro model somewhere in between stable cell lines and animal models. Currently， animal intestinal organoids can be applied to research on the pathogenesis and treatment of intestinal diseases， as well as to explore host-pathogen interactions. In the study of enteral nutrition and enteral immunology， intestinal organoids can be used to improve feed utilization， screen suitable additives， and promote animal performance. In addition， animal intestinal organoids have great potential in the field of human translational medicine and regenerative medicine. In this paper， the main applications of animal intestinal organoids in the past five years were reviewed， and the future research directions were prospected.

Key words： animal; intestinal organoid; application

*Corresponding author： CHEN Aolei，E-mail： chenolay@scau.edu.cn

腸類器官（intestinal organoid）又稱為迷你腸（mini-gut），是腸干細胞或腸隱窩（intestinal crypts）在含特殊生長因子的基質膠中增殖分化所形成的具有完整上皮結構的空心細胞團塊，具有與腸相似的結構與功能。長期以來，腸道體外研究中常用的模型為永生化細胞系。細胞系來源于腫瘤或體外癌變，通常具有影響生長、代謝和生理等方面的突變，其表型和功能與體內腸道細胞有較大差異，不便于開展正常腸道的相關研究［1］。而由干細胞或隱窩增殖分化而成腸類器官不僅可再現腸道的上皮結構特性，還含有腸上皮細胞、杯狀細胞、潘氏細胞、內分泌細胞等多種分化的功能細胞，可呈現其起源組織的功能特性，是一種更貼近動物模型的體外模型，可被用于研究腸道干細胞功能和進一步探索腸道功能［2-5］。近年來，動物腸類器官的研究不僅受到廣泛關注，其應用范圍也逐漸擴大。動物腸類器官的培養技術已有文章對其進行闡述［6-7］，本綜述主要總結了動物腸類器官當前的主要應用，并展望其未來的方向。

1" 動物腸類器官作為腸疾病的研究模型

1.1" 腸炎

炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease， IBD）是一種慢性、病情反復的胃腸道炎性疾病。目前，IBD的致病機制尚未明確，但主流觀點認為IBD的發生是環境、免疫、遺傳、腸道微生物群失調和腸上皮屏障功能受損等因素綜合作用的結果［8-9］。IBD的常規治療主要包括服用免疫抑制劑和手術切除受損腸道。但是，IBD的常規治療存在耐藥性、手術后遺癥等缺點。因此，IBD治療的研發重點為探索其發病機制及相應的創新療法。

動物腸類器官可以再現細胞的結構與功能，能模擬疾病在體內發生和發展的情況，是研究IBD發病機制和治療方法的十分有效、真實且重要的體外模型。Rallabandi等［10］用葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導生成了小鼠IBD腸道類器官，并對其腸上皮通透性和相關促炎細胞因子表達量進行了分析，發現該小鼠IBD腸道類器官上皮通透性上升，屏障功能下降，炎性細胞因子顯著增加，明確該模型可用于IBD的相關研究。

豬腸類器官也被應用于IBD的相關研究。脂多糖（LPS）是革蘭陰性細菌外膜的組成部分，可被Toll樣受體4（TLR4）識別從而引發促炎反應［11］。基于此，Koltes和Gabler［12］成功培養了豬腸類器官，然后將LPS處理過的豬腸類器官與未處理的豬腸類器官進行比較和觀察，發現經LPS處理后的豬腸類器官其TLR4點狀定位增加，與早期內體抗原1（EEA1）的共定位區域更廣。該試驗證明了豬腸類器官可用于了解腸炎的致病機理和受體定位。

犬腸道生理學與人腸道生理學相似，且犬可自發發生IBD［13-14］。因此，犬可用于IBD的相關研究。但犬作為實驗動物模型成本高且存在人犬情感羈絆的問題，而犬腸類器官能滿足試驗需求且避免上述問題，是更適合研究IBD的體外模型［15］。Chandra等［16］成功分離并培養出健康犬和IBD犬的腸類器官后，研究了其前列腺素E受體4（EP4R）的表達情況，發現EP4R在IBD犬活檢組織中的表達情況與在IBD犬腸類器官中的無明顯差異。EP4R是一種與IBD發病機制相關的蛋白，也是一些抗炎和鎮痛藥物（如非甾體抗炎藥）的靶標受體。該犬腸類器官可用于探究已有的IBD藥物對于胃腸道組織中EP4R表達的影響，也可用于篩選出未知的EP4R拮抗劑，開發IBD新藥物。

展望未來能利用動物腸類器官進一步探究IBD的致病機理，開發IBD新藥物，豐富IBD比較醫學的研究。

1.2" 腸缺血性損傷

腸缺血性損傷是由于腸系膜動靜脈血栓、腸道自身疾病或藥物等因素造成腸道血流供應不足、缺氧，從而導致腸道發生梗死的一種腸道疾病。腸部缺血會引發后續的腸炎和腸道黏膜屏障受損，從而使黏膜失去保護作用。黏膜失去保護作用后，相關毒素與細菌易由此進入體循環從而引起其他疾?。?7］。因此，修復受損的黏膜屏障是腸缺血治療的研究重點。腸道干細胞（ISC）可負責腸道損傷后上皮細胞的更新，有望用于腸缺血性損傷后的治療。Stieler等［18］成功建立了腸缺血的豬模型，隨后成功分離正常豬腸道與腸缺血豬腸道干細胞?；诖?，Stieler團隊［19］還進一步證明了同源域蛋白同源盒基因（HOPX）在ISC修復腸道受損的上皮細胞再生過程中起負調控作用，即HOPX的沉默能促進細胞增殖和腸類器官生長。尋找相關藥物靶點，減輕腸上皮損傷也是腸缺血治療的研究方向。雖然腸類器官能很好地重現腸道結構與功能，但是其缺乏循環系統、免疫細胞和神經細胞等，不便于研究組織與組織間的相互作用。結合微流控系統與腸類器官建立的腸類器官芯片可以很好地解決上述問題。Huang等［20］建立了鼠小腸類器官和人工毛細血管后，將其與微流控技術相結合，制造出了人工毛細血管包埋的腸類器官芯片，通過研究發現當毛細血管受損或者氧氣供應不足時，腸芯片中的類器官在細胞氧化應激和細胞凋亡方面會產生變化。通過RNA測序分析該缺氧類器官發現，嗅素結構域家族蛋白4（OLFM4）是表達最顯著的基因。隨后通過對OLFM4缺陷鼠的進一步研究發現，OLFM4會加劇腸道損傷，提示其為腸缺血性損傷治療的關鍵靶點。

期盼未來能夠利用動物腸類器官繼續探索ISC增殖所需的優良條件并發現新的治療靶點，為腸缺血性損傷提供新的治療方案。

1.3" 腸道腫瘤疾病

永生腫瘤細胞系為單一細胞族群，無法重現腫瘤的異質性，且永生腫瘤細胞系的生理狀態會隨著傳代次數的增加或體外培養環境的不同而發生改變，無法準確反映腫瘤在體內的狀態。從腸道腫瘤組織中分離并建立的類器官可重現腫瘤組織的結構特征和功能特性，突出腫瘤的異質性，是研究腸道腫瘤疾病的優良模型。鼠腸類器官被用于研究腸道腫瘤生長相關的調控基因和信號轉導通路，以探究腸道腫瘤的發生機制［21-23］。腺瘤樣結腸息肉易感基因（APC基因）是公認的腫瘤抑制基因，與結腸腺瘤性息肉和直腸癌等疾病的發生息息相關。Xu等［23］從ApcWT和ApcMin/+：Rad21+/-小鼠的腸道中分離并培養出腸類器官后，發現來自ApcMin/+：Rad21+/-小鼠的腸類器官發生APC雜合性缺失的概率顯著降低。然后，針對Rad21進行相關試驗后證明Rad21是APC雜合性丟失的關鍵調節因子，其與直腸癌的基因失調密切相關［23］。

隨著人們對養寵觀念的改變以及小動物醫療的快速發展，犬、貓等伴侶動物的壽命有所增長，隨之而來的是腫瘤疾病的發生率增加［24］。動物腸類器官可以作為研究腸道腫瘤的模型。但目前犬、貓腸腫瘤類器官的研究較少。Chandra等［16］利用犬胃腸道間質腫瘤和結直腸腺癌的臨床病料成功培養出對應的類器官。LPS被認為與促進腸道腫瘤發展有關。過去，科學家主要關注LPS與腸道免疫細胞的關系，而人們對LPS是否影響上皮細胞的認知非常有限。利用犬自發性腸道腫瘤構建的類器官，可探索LPS與腸上皮之間的相互作用。研究發現，LPS不但可以促進腸肥大細胞腫瘤類器官的增殖，還能改變上皮細胞的基因表達，通過LPS/TLR4信號通路和其他代謝通路影響腫瘤的發展［25］。CRISPR/Cas9等基因編輯技術可對腸道類器官或腸道干細胞進行編輯以誘導癌癥相關突變，從而對癌癥的發生機制進行研究。展望基因編輯技術能廣泛結合犬、貓腸類器官平臺用于犬貓腫瘤的研究，此舉能很好解決人們對于犬、貓等伴侶動物作為實驗動物的情感羈絆問題。

2" 動物腸類器官作為宿主-病原體相互作用的研究模型

動物腸類器官不但在體外展現腸黏膜的3D結構特征，還含有多種成熟分化的功能細胞。與腸道細胞系相比，3D腸類器官在解剖結構和生理功能上更接近體內腸道。因此，3D腸類器官是研究宿主與病原體關系的良好平臺。

腸類器官可以用于揭示腸道病原體所侵染的種屬和靶向的腸段偏好。Derricott等［26］利用熒光免疫法發現鼠傷寒沙門菌 4/74可出現在牛和豬的腸類器官的上皮細胞中而未出現在鼠腸類器官上皮細胞中。Yin等［27］用豬Delta冠狀病毒（PDCoV）感染不同腸段的豬腸類器官，發現PDCoV傾向侵染小腸，特別是空腸和回腸。此外，腸類器官還能夠鑒定腸道病原體所靶向的腸道上皮細胞類型。如豬流行性腹瀉病毒（PEDV）感染多類型的細胞，包括腸細胞、干細胞和杯狀細胞［28］。基于這些試驗現象，不同種屬或不同腸段的類器官有望成為制造腸道病原體的高效“工廠”。

盡管腸類器官已經廣泛被用于研究宿主-病原體的相互作用，但基礎的腸類器官其上皮細胞的頂端是向內的，部分病原體無法接觸小腸的絨毛面，無法感染腸道。為解決此問題，Williamson等［29］建立了高通量顯微注射平臺。然而該技術操作難度高，難以普及。Van der Hee 等［30］將3D腸類器官轉化為2D的培養系統以便宿主-病原體的研究。而PEDV在2D腸類器官和體內的感染程序不同。Li等［31］開發了一種豬上皮細胞頂端朝外的腸類器官培養系統，該系統有助于研究PEDV、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）和呼腸孤病毒等專門通過小腸絨毛對腸道進行感染的病毒。雞、牛、犬、兔等動物的上皮細胞極性反轉的腸類器官（上皮細胞頂端朝外）或單層類器官也已被成功培養，更便于宿主-病原體的研究［32-35］。這些動物腸類器官或將成為深入闡明宿主-病原體關系的可靠研究模型（表1）。

3" 動物腸類器官作為腸道營養學的研究模型

腸道是營養物質消化吸收的主要場所。腸類器官能夠再現腸道功能，可用于腸道營養學的研究。Kar等［45］建立鼠腸類器官衍生的極化單層細胞后將其暴露于未消化的蛋白質（酪蛋白、豆粕等飼料成分或黃粉蠕蟲等替代蛋白質）中，然后對其進行轉錄組學和生物途徑分析，發現與動物體內研究的結果一致。這表明該腸道類器官可能有助于預測飼料在動物體內的代謝。目前，豬、禽的腸類器官也有被應用于腸道營養學的研究。Wang等［46］使用仔豬腸道類器官模型研究發現，維生素A（VA）及其代謝產物視黃酸抑制了仔豬腸類器官的出芽、鉻粒蛋白A和腸液黏蛋白2（腸細胞分化標志物）的表達，上調了Spp1和Trop2基因（胚胎干細胞標志物）表達量，表明給仔豬飼喂高劑量VA可能會抑制腸道干細胞的分化，從而影響仔豬的腸道功能和生長性能。Satitsri等［47］發現，胡椒堿在豬腸類器官中具有抗炎和抗分泌的作用，對胡椒堿的進一步研究可為斷奶仔豬腹瀉的治療提供新方案。Liu等［48］用褪黑素處理雞腸類器官后發現，較低劑量的褪黑素會使其抗氧化酶的表達升高，結合相關動物試驗結果發現，蛋雞飼喂褪黑素后可上調抗氧化酶來局部促進氨基酸轉運蛋白在小腸的表達和功能，最終提高蛋雞性能。對于畜牧生產而言，提高飼料效率、尋找適宜的營養物質可幫助提高產量。動物腸道類器官可以作為研究腸道對飼料中物質的反應、提高飼料轉化率的潛在機制等營養學問題的模型，從而助力人們深入探究腸道對于提高生產效率的潛在可能性。

4" 動物腸類器官作為腸道免疫學的研究模型

動物腸類器官可用于研究病原體感染腸道后的免疫應答反應。Nash等［49］創新性地用禽腸絨毛創建了腸絨毛外翻的禽腸類器官，研究發現其保留了源自固有層的免疫細胞并且其中的白細胞保留了吞噬能力。該模型可被鼠傷寒沙門菌、甲型流感病毒和柔嫩艾美耳球蟲 （Eimeria tenella）感染，可用于研究病原體-腸道上皮細胞-白細胞間的相互作用。此外，免疫細胞的共培養系統也能夠用于研究病原體-腸道上皮細胞-免疫細胞的相互作用。Noel等［50］將巨噬細胞和人腸類器官分別接種在Transwell小室的下層和小室上層，且單層腸類器官的基底外側朝向濾膜，由此建立了人巨噬細胞-腸類器官共培養系統。然后用產腸毒素大腸桿菌（ETEC）和致病性大腸桿菌（EPEC）模擬體內腸腔感染，即從單層腸類器官頂端絨毛感染該系統，發現巨噬細胞可以感知、捕獲和殺死腸類器官管腔內的病原體且不會破壞上皮屏障。

動物腸類器官還有望用于腫瘤免疫的研究。微流控技術和免疫共培養系統相結合能重現不同腫瘤的腫瘤微環境（TME），這不僅助于研究腫瘤類器官與免疫細胞中的相互作用，探索腫瘤免疫的潛在機制，還有利于預測新型免疫治療藥物［51］。

除了微流控技術和免疫共培養系統，近期“二代”腸類器官的出現也填補了腸類器官不具復雜免疫成分的缺陷。2023年，Bouffi等［52］將人腸類器官移植至具有人源化免疫系統的小鼠腎包膜中，進一步研究發現，移植后的人腸類器官具有免疫細胞的浸潤。該技術有望被用于其他動物腸類器官，產生含有免疫細胞浸潤的動物腸類器官，讓動物腸類器官更好地服務于腸道免疫學的研究。

5" 動物腸類器官作為人轉化醫學和再生醫學的研究模型

5.1" 人轉化醫學

藥物研發是轉化醫學研究的重要內容，是基礎科研成果應用于臨床治療的關鍵一環。新藥需通過藥代動力學和藥物毒理學的評價，確保其在臨床試驗中的有效性和安全性后才能進入下一步臨床試驗。傳統的前期藥物篩選模型分為體外模型和動物模型。其中體外模型主要從分子水平和細胞水平上對藥物進行評價；而動物模型則是利用活體生物來測試藥物的各項指標。體外模型具有成本低、便于基因操作等優點，被廣泛用于藥物研究。但是體外模型受其自身所限，無法重現人體所處的真實生理環境，導致體外試驗的藥物篩選結果片面，失敗率較高。而大量不具成藥性的候選藥物進入動物試驗，會導致研究成本增加、試驗周期延長。如果在研究中運用更加真實且有效的體外模型，就能提高“從實驗室到臨床”的轉化效率。腸類器官作為一種3D體外模型，包含了多種具有吸收和分泌等腸生物學功能的分化細胞，更接近于真實的腸道結構與功能。因此，腸類器官有望成為篩選和評價藥物功能的理想體外模型。

豬和人在黏膜屏障生理學和多種易感的病原中具有較高的相似性［14，53］。目前，很多研究已證明豬可以作為多種疾病的動物模型，如急性腸系膜缺血、短腸綜合征、艾滋病相關的隱孢子蟲感染和應激性腸功能障礙［54-58］。動物腸類器官可以很好地展現原組織的某些特性，出于對效益和減少活體動物使用的考慮，近兩年來，多篇毒理學研究的文章中，已呈現豬腸類器官取代活體豬的趨勢［31，59-61］ 。豬是對真菌毒素脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）最敏感的動物，Li等［59］將豬腸類器官用作體外研究DON對腸道毒性的模型。Zhou等［60］利用豬腸類器官以探索脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、Wnt/β-catenin通路及腸道干細胞之間的關系。因此，筆者團隊認為，豬腸類器官模型有望逐漸替代活體豬動物模型用于上述疾病和毒理學的研究。

此外，犬胃腸道生理結構功能與人類的相似［14］。因此，犬常作為動物模型用于評價人類藥物的安全性［62-63］。由于犬是公認的伴侶動物，人犬關系、動物倫理和動物福利等因素限制了實驗犬的使用，因此近年活體犬的實驗率有所下降［64］。而犬腸道類器官能再現犬腸道的生理結構和功能，有望替代活體犬進行多種臨床試驗，減少活體動物模型的使用，確保落實動物實驗的3R原則，即替換（Replacement）、減少（Reduction）和改進（Refinement）［16］。Sahoo等［65］建立了犬結腸衍生的單層的具有高度完整性的腸類器官，用其評估了β阻滯劑（例如普萘洛爾，美托洛爾和阿替洛爾）的滲透性，并與Caco-2細胞系做了對比，揭示了使用犬結腸衍生的單層腸類器官作為藥物滲透性評估的模型系統的潛力。

綜上所述，豬和犬腸類器官的體外模型已在人轉化醫學的研究中得到廣泛應用。未來將有更多種屬動物的腸類器官代替其2D體外模型，在新藥研發中發揮重要作用。

5.2" 再生醫學

腸上皮黏膜由單層細胞緊密排列而成，起到吸收營養、保護、屏障等作用。腸上皮功能的受損與IBD的發生關系密切，而嚴重的IBD和腸切除手術會導致短腸綜合征（short bowel syndrome，SBS）。這種情況會影響腸道吸收功能，導致機體發生嚴重的營養不良，還可能因為腸道屏障功能受損而易受病原體侵害。因此，SBS患者術后修復和IBD患者腸屏障的修復是再生醫學的研究熱點。

腸類器官可在體外重現腸道的結構與功能，是腸道研究真實且有效的模型，也是腸道再生領域備受關注的工具。Yui等［66］使用硫酸葡聚糖硫酸鈉（DSS）成功誘導了小鼠IBD模型。為了探索腸類器官是否能用于移植修補損傷的腸黏膜，Yui等［66］將帶有熒光標記的小鼠結腸類器官以灌腸方式引入具有黏膜損傷的小鼠結腸中，發現小鼠結腸類器官附著在結腸黏膜受損的創面上，形成平坦的上皮層或輕微的內陷面。小鼠結腸類器官再生的管狀隱窩與小鼠結腸的上皮組織在組織學上無明顯差異，且具有相同的表皮屏障功能，證明了腸類器官移植修復腸組織的可行性，說明小鼠結腸類器官具有再生醫學應用潛力。

盡管腸類器官作為再生醫學的工具具有優勢，但是腸類器官成熟后會形成一個中心球體，不形成腸絨毛結構的指狀突起，腸類器官依舊不能完全精準復刻體內腸道的大小、形狀和功能［2］。此外，腸類器官培養所需的基質膠多數來源于小鼠的肉瘤，組分無法標準化且費用昂貴。上述缺點可能會限制腸類器官在再生醫學中的應用。

6" 問題與展望

近年來，隨著科研人員不斷探索和改良各動物的腸類器官培養體系，腸類器官能無限擴增、易操作、能重現起源組織功能特性等優點令其成為了受歡迎的體外模型。但是腸類器官作為研究模型仍存在一些問題。基礎腸類器官的上皮細胞具有極性，頂端向內，使得許多病原體或其他物質無法接觸腸類器官的絨毛面。因此，研究病原體或物質與腸道之間的關系時需要結合顯微注射等方法。但顯微注射技術難度較大。而細胞極性反轉腸類器官、單層腸類器官和懸浮培養腸類器官的培養技術相對簡單，能更好地用于物質與腸道相互作用的研究。此外，動物腸類器官培養所需的基質膠多數來源于肉瘤，有病原傳播風險，存在組分無法標準化且費用昂貴等問題，這限制了動物腸類器官的廣泛應用。未來有望發展標準化的、非肉瘤源的基質膠進一步優化腸類器官的培養，使腸類器官更好地為科學研究服務。另外，動物腸類器官不能重現腸道微生物群，基礎腸類器官缺乏免疫、神經、間充質和血管等相關細胞。未來可以通過共培養、微流體腸芯片以及將類器官移植至動物宿主體內等方法來增加腸道類器官的復雜性，進一步擴大腸類器官的應用范圍。

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（編輯" 范子娟）