CD163基因敲除豬對胸膜肺炎放線桿菌、豬鏈球菌和副豬嗜血桿菌的易感性研究

摘" 要： 旨在探究在CD163基因的SRCR5區(qū)域插入1個堿基的CD163基因敲除（CD163 gene knockout， CD163-KO）型豬對3種關鍵細菌的易感性相較于野生型（wild-type，WT）豬是否會有所變化，評估CD163-KO型豬的生物安全性。本研究選用均為50日齡、體重與健康狀況等相似的17頭CD163-KO型大白豬和17頭WT型大白豬，其中2頭CD163-KO型大白豬和2頭WT型大白豬作為空白對照，不做任何感染處理。試驗豬只均無胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae， APP）、豬鏈球菌（Streptococcus suis，SS）及副豬嗜血桿菌（Haemophlius parasuis， HPS）感染史與接種史。試驗豬只隨機分為3組，每組均有5頭CD163-KO型豬和WT型豬，A組接種APP1型菌株、B組接種SS2型菌株、C組接種HPS13型菌株。連續(xù)觀察8 d，記錄豬只臨床癥狀表現(xiàn)與死亡情況；試驗豬只死亡后及時解剖，觀察心臟、胸腔、肺部等重要部位病變情況；采集肺樣并提取肺部中的細菌DNA，用于定量PCR檢測并統(tǒng)計分析與對比CD163-KO型與WT型死亡大白豬肺中3種細菌分別的相對DNA拷貝量。依據(jù)試驗豬只臨床癥狀表現(xiàn)可得，各組試驗豬只均成功感染相應的細菌，且各組內(nèi)的CD163-KO型豬與WT型豬的存活率均無顯著差異（Pgt;0.05）；依據(jù)死亡豬只肺部病變情況及細菌定量PCR檢測結果可得，CD163-KO型死亡豬肺與WT型死亡豬肺中APP1型、SS2型及HPS13型菌株的相對DNA拷貝量均無顯著差異（Pgt;0.05）。本研究的結果是CD163-KO型大白豬生物安全性的有力證據(jù)，證明CD163基因敲除后沒有提高豬只對APP、SS和HPS的易感性，不會顯著影響豬只抵抗細菌的能力，為CD163-KO型豬的生物安全性評估提供強有力的支持。

關鍵詞： CD163；基因敲除；大白豬；豬繁殖與呼吸綜合征病毒；胸膜肺炎放線桿菌；豬鏈球菌；副豬嗜血桿菌；生物安全評估

中圖分類號：S828.2

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）12-5478-11

doi： 10.11843/j.issn.0366-6964.2024.12.014

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

收稿日期：2024-06-14

基金項目：科技創(chuàng)新2030-農(nóng)業(yè)生物育種重大項目（2023ZD0404303-02）

作者簡介：梁國濠（1999-），男，廣東新興人，碩士生，主要從事生物技術抗病育種研究，E-mail：Leunggodho@163.com

*通信作者：楊化強，主要從事大動物基因修飾育種、動物克隆和干細胞相關領域的研究，E-mail：yangh@scau.edu.cn；張獻偉，主要從事豬生物育種研究及生物安全評價，E-mail：zxianw@163.com

Study on the Susceptibility of CD163 Gene Knockout Pigs to Actinobacillus pleuropneumoniae，

Streptococcus suis， and Haemophilus parasuis

LIANG Guohao1， HU Dandan1， ZHONG Haiwen1， ZHANG Jian2， YANG Dehong2， WU" Zhenfang1， 2， YANG Huaqiang1， 2*， ZHANG Xianwei1， 2*

（1.National Engineering Research Center For Swine Breeding Industry， College of Animal Science， South China Agricultural University， Guangzhou 510642，" China;

2.Wens Foodstuff Group Co.， Ltd.， Yunfu 527400，" China）

Abstract：" This study aimed to investigate whether pigs with a CD163 gene knockout （CD163-KO） resulting from a single base insertion in the SRCR5 domain of the CD163 gene exhibit altered susceptibility to 3 crucial bacterial pathogens compared to their wild-type （WT） counterparts and to evaluate the biosafety profile of CD163-KO pigs. This study selected a total of 34 Large White pigs， 17 CD163-KO pigs and 17 wild-type pigs， all at the age of 50 days with similar body weights and health statuses. Among them， 2 CD163-KO Large White pigs and 2 WT Large White pigs were used as blank controls without any infection treatment. None of the pigs had a history of infection or vaccination against Actinobacillus pleuropneumoniae （APP）， Streptococcus suis （SS）， and Haemophilus parasuis （HPS）. The pigs were randomly divided into 3 groups of 5 CD163-KO and 5 WT pigs each： group A received APP serotype 1， group B received SS serotype 2， and group C received HPS serotype 13. The pigs were observed continuously for 8 days， the clinical symptoms and mortality were recorded. Upon death， the pigs were promptly necropsied to observe lesions in critical organs such as the heart， thorax， and lungs. Lung samples were collected， and bacterial DNA was extracted from the lungs for quantitative PCR analysis. The relative DNA copy numbers of the 3 bacterial species in the lungs of deceased CD163-KO and WT pigs were statistically analyzed and compared. The primary aim of this study was to evaluate whether CD163-KO pigs exhibit altered susceptibility to these 3 key bacterial pathogens compared to their WT counterparts， ultimately assessing the biosafety profile of CD163-KO pigs. Based on the clinical manifestations observed in the experimental pigs， all groups successfully contracted the respective bacterial infections， and there were no significant differences in survival rates between CD163-KO and WT pigs within each group （Pgt;0.05）. Furthermore， according to the pathological findings in the lungs of deceased pigs and the results of quantitative PCR analysis for bacterial DNA， no significant differences were detected in the relative DNA copy numbers of APP serotype 1， SS serotype 2， and HPS serotype 13 strains in the lungs between deceased CD163-KO and WT pigs （Pgt;0.05）. The findings of this study serve as robust evidence for the biological safety of CD163-KO Large White pigs， demonstrating that the knockout of the CD163 gene does not enhance the susceptibility of pigs to APP， SS， and HPS， nor does it significantly compromise their ability to resist these bacterial infections， which provides strong support for the biological safety assessment of CD163-KO pigs.

Key words： CD163; gene knockout; Large White pig; porcine reproductive and respiratory syndrome virus; Actinobacillus pleuropneumoniae; Streptococcus suis; Haemophilus parasuis; biosafety assessment

*Corresponding authors： YANG Huaqiang， E-mail：yangh@scau.edu.cn; ZHANG Xianwei， E-mail：zxianw@163.com

豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome， PRRS），在我國俗稱“豬藍耳病”，臨床上會導致妊娠后期母豬早產(chǎn)、流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎、弱仔等問題，妊娠母豬感染繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus， PRRSV）后造成仔豬成活率低。仔豬感染PRRSV后會出現(xiàn)發(fā)熱、體重減輕、呼吸系統(tǒng)疾病，死亡率高達40%～80%。目前，PRRSV疫苗效果并不穩(wěn)定，且病毒變異加快，嚴重影響疫苗的交叉保護效果。PRRS是長期困擾養(yǎng)豬業(yè)、危害最嚴重的傳染性疾病之一。

CD163蛋白是豬肺泡巨噬細胞（PAM）表面介導PRRSV入侵宿主的受體。早在2007年，Calvert等［1］發(fā)現(xiàn)CD163蛋白可以介導PRRSV的入侵與增殖。隨后Patton等［2］進一步研究表明，參與機體免疫生理過程的CD163蛋白是PRRSV入侵豬體內(nèi)的關鍵受體，而CD163結構域中富含半胱氨酸的清道夫受體結構域5（scavenger receptor cysteine-rich 5，SRCR5），是PRRSV識別并感染宿主的核心區(qū)域［3］，缺失該區(qū)域后PRRSV無法感染靶細胞。CD163基因結構和功能的深入研究為PRRSV的抗病育種帶來了希望。2015年，Whitworth等［4］率先利用CRISPR/ Cas9技術制備了CD163基因編輯豬，研究發(fā)現(xiàn)對CD163基因外顯子7的SRCR5結構域進行編輯后，基因編輯豬對PRRSV-2型毒株感染表現(xiàn)完全抗性［5］；Wells等［6］為將人CD163中SRCR8結構域取代豬自身的CD163中SRCR5結構域，制備的CD163基因編輯豬僅對PRRSV-1型毒株具有抗性，但仍然支持PRRSV-2型毒株的感染。此外，Salgado等［7］通過刪除CD163基因中exon 13區(qū)域的PSTII結構域所制備的基因編輯豬對PRRSV-1型和PRRSV-2型毒株均具有完全抗性，并仍保留大部分CD163基因表達區(qū)域及其關鍵生物學功能，如識別并介導巨噬細胞對游離血紅蛋白和觸珠蛋白結合形成復合物（Hb-Hp）的吞噬等［8］。本團隊于2018年通過在CD163基因SRCR5結構域中LBP（ligand-binding pocket，LBP）區(qū)域引入1 bp插入突變，CD163翻譯被提前終止，而導致C端缺失，成功制備出能夠抵抗高致病性PRRSV感染的CD163基因敲除（CD163 gene knockout，CD163-KO）型杜洛克豬［9］，隨后于2022年又成功獲得了CD163-KO型大白豬，該豬不僅可以完全抵抗高致病型藍耳毒株和NADC30-like毒株的感染，而且基因編輯種豬的生產(chǎn)和繁殖性能與野生型（wild-type， WT）大白豬并無顯著差異［10］。

CD163蛋白在抵抗細菌感染、炎癥反應、免疫應答等過程中也發(fā)揮著重要作用［11，12］。Fabriek等［13］研究表明，CD163蛋白可作為細菌在巨噬細胞中的受體介導細菌識別和信號傳導，促進促炎因子的表達，促使局部發(fā)生炎癥反應，有助于清除細菌感染。Jarosova等［14］通過用胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae， APP）感染試驗豬群，發(fā)現(xiàn)CD163蛋白有助于促炎因子的產(chǎn)生，發(fā)揮抗APP感染的作用。Wilson等［15］推測，表達CD163的單核細胞可能存在除吞噬作用以外的其他途徑消除豬鏈球菌（Streptococcus suis，SS）感染。lvarez-Estrada等［16］發(fā)現(xiàn)，豬只感染副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis， HPS）后體內(nèi)CD163基因的表達量顯著增加，CD163蛋白可以發(fā)揮其抗原呈遞能力［17］及促炎功能來消除HPS感染。豬傳染性胸膜肺炎（porcine infectious pleuropneumonia， PCP）、豬鏈球菌病、副豬嗜血桿菌病等關鍵的細菌病有著傳播范圍廣、患病豬喘氣咳嗽、多發(fā)炎癥、嚴重時會導致患病豬死亡等特征，同樣也會嚴重影響?zhàn)B豬業(yè)的生產(chǎn)效益［18-20］。由于CD163蛋白對機體抵抗細菌感染的作用不可忽視，因而探究CD163基因缺失后的豬只對細菌易感性的變化，是對CD163-KO型豬安全評估的重要環(huán)節(jié)。

目前尚未有針對CD163-KO型豬的細菌易感性研究，本研究將探究CD163-KO型豬對世界各地豬場出現(xiàn)頻率相對較高的APP1型菌株、SS2型菌株、HPS13型菌株的易感性相較于WT型豬的變化［21-23］，以評價CD163基因缺失后豬只對細菌抵抗能力的影響，為抗藍耳基因編輯豬新品種培育提供生物安全證據(jù)。

1" 材料與方法

1.1" 試驗材料

1.1.1" 試驗動物

50日齡無APP1型、SS2型、HPS13型菌株感染史及接種史的CD163等位基因雙敲除的CD163-KO型大白豬和WT型大白豬各17頭，來自廣東中芯種業(yè)科技有限公司。其中2頭CD163-KO型大白豬與2頭WT型大白豬作為空白對照，不做任何感染處理。

CD163-KO型大白豬為在CD163基因的SRCR5區(qū)域（對應外顯子7）只有1個A堿基插入的突變型大白豬。

1.1.2" 菌株及菌液制備

APP1型菌株（APP101）、SS2型菌株（SS201）和HPS13型菌株（HPS1301）由溫氏食品集團股份有限公司研究院健康養(yǎng)殖技術中心惠贈。

將APP101和HPS1301菌株劃線復蘇于含有煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）以及胎牛血清的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（tryptose soya agar，TSA）上，挑單克隆菌落到含NAD以及胎牛血清的胰蛋白胨大豆肉湯（tryptic soy broth， TSB）培養(yǎng)基內(nèi)作為種子液，將種子液接種于含有NAD以及胎牛血清的TSA培養(yǎng)基上，37℃恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)后用PBS（phosphate buffer saline， PBS）緩沖液將全部菌落洗脫下來，應用平板菌落計數(shù)法進行活菌計數(shù)，將菌液濃度稀釋調(diào)整至適合的濃度，直接用于攻毒。SS201菌株則劃線于添加血清的TSA平板，挑取單菌落于添加血清的TSB培養(yǎng)基，按照如上方式制備攻毒菌液。

1.1.3" 試劑耗材

病毒核酸提取試劑盒（磁珠法）購自廣東標允生物科技有限公司。Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。qPCR定量引物由溫氏食品集團股份有限公司研究院健康養(yǎng)殖技術中心提供。

1.2" 攻毒試驗豬分組

攻毒試驗豬分組見表1。

1.3" 攻毒方法

將A、B、C三組的試驗豬只提前1周分別圈養(yǎng)在3個欄中，A組為APP101攻毒組，采用氣管注射的方式攻毒：將試驗豬翻轉，使其背部貼地、腹部朝上，并固定嘴鼻和四肢，在頸部找到喉結，將注射器垂直刺入喉結并經(jīng)過軟骨后回拉注射器，若在注射器中能沒有阻力而產(chǎn)生氣體，即針頭成功扎入氣管，可將菌液注射進氣管。B組和C組分別為SS201和HPS1301攻毒組，均采用腹腔注射的方式攻毒：將試驗豬只兩前肢抓住并提起，使其直立后保定，觀察腹部，在呼氣即將完成的瞬間將針頭垂直刺入腹腔并注射菌液。

1.4" 臨床癥狀觀察

連續(xù)8 d觀察攻毒后試驗豬只的臨床癥狀表現(xiàn)，包括采食量、精神狀態(tài)、體溫變化等多項指標，以感染相應細菌的標準臨床癥狀來判斷豬只的感染情況：患有PCP的豬只通常表現(xiàn)為精神沉郁、呼吸困難伴有嚴重的咳嗽、口鼻流出白沫類分泌物，后期豬只出現(xiàn)犬式呼吸、臨死前嘴鼻出血等癥狀［27］；感染SS的豬只通常出現(xiàn)關節(jié)炎、咳嗽、呼吸困難、腦膜炎等癥狀［28］；感染HPS的豬只會出現(xiàn)咳嗽、呼吸困難、關節(jié)腫脹、食欲不振等癥狀［29］。感染SS201和HPS1301的豬只每隔12 h觀察一次，由于在預試驗時發(fā)現(xiàn)感染APP101的豬只發(fā)病較快較明顯，其前后觀察的時間間隔縮短至6 h。若發(fā)現(xiàn)死亡豬只要及時解剖并采集肺樣，用于臨床解剖學診斷及提取DNA。

1.5" 肺部細菌DNA提取

在每個死亡豬肺中隨機挑取兩個不同病變部位各取0.5 g病料，分別加入至兩個裝有1 mL超純水的2 mL離心管中，各加入3～4顆研磨珠，放進上海凈信組織研磨儀，以90 s一組、共進行3組的程序研磨病料，隨后以1 500 r·min-1、5 s的程序瞬時離心，取400μL上清，加入至廣東標允生物科技有限公司病毒核酸提取試劑盒，將試劑盒放入核酸提取儀提取細菌DNA，隨后凍存于-20℃冰箱備用。

1.6" 細菌相對表達量qPCR檢測

將提取的細菌DNA以“10.0 μL 2×Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix、0.4μL Primer 1、0.4μL Primer 2、2.0μL Template DNA、7.2μL ddH2O”的qPCR體系配成混合液，以“95℃ 30 s進行預變性;95℃ 10 s、60℃ 30 s進行40次循環(huán)反應以及95℃ 15 s、60℃ 60 s、95℃ 15 s進行熔解曲線反應”的程序運行Thermo Fisher QuantStudio 實時熒光定量儀并收集相關數(shù)據(jù)。

1.7" 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法

日常記錄的試驗豬只死亡情況在GraphPad Prism8中以存活率圖展示，運用Log-rank（Mantel-Cox） test比較分析同種細菌感染的試驗組與對照組豬只存活率的差異性。

qPCR最終得出的結果以2-（ΔΔCt）法計算處理，在GraphPad Prism8中以散點圖展示，運用Unpaired t test比較分析同種細菌感染的試驗組與對照組死亡豬只肺部細菌相對DNA拷貝量。

2" 結" 果

2.1" 試驗豬只感染細菌后的臨床癥狀

A組為APP101攻毒組，其中有2頭CD163-KO型、2頭WT型試驗豬只于攻毒6 h后就出現(xiàn)明顯的PCP臨床癥狀，具體表現(xiàn)為咳嗽、精神沉郁、呼吸困難、口吐白沫、犬坐式呼吸、倒地抽搐等（圖1A～D），豬只死亡后出現(xiàn)口、鼻出血的現(xiàn)象（圖1E）。B組為SS201攻毒組，其中有1頭CD163-KO型、2頭WT型試驗豬只于攻毒48 h后出現(xiàn)咳嗽、腿痛、腿瘸、關節(jié)炎等典型的感染SS后臨床癥狀（圖2A～C）。C組為HPS1301攻毒組，其中有1頭CD163-KO型、1頭WT型試驗豬只于攻毒72 h后出現(xiàn)與A組豬只相同的咳嗽、呼吸困難、倒地抽搐以及與B組豬只相同的關節(jié)炎等HPS感染后的臨床癥狀（圖1B、D，圖2C）。上述試驗豬只的臨床癥狀表現(xiàn)說明本次試驗已成功地將3種菌株分別接入各組試驗豬只體內(nèi)。

2.2" 試驗豬只死亡情況

感染APP101的試驗豬只發(fā)病速度較快，最先死亡（圖3A），攻毒72 h后WT型豬只已全部死亡，僅1頭CD163-KO型豬只一直存活至d8。經(jīng)統(tǒng)計學分析，A1組CD163-KO型大白豬只與A2組WT型大白豬只在攻毒期間的存活率無顯著差異（Pgt;0.05）。

感染SS201的試驗豬只在攻毒后d4開始有死亡的情況出現(xiàn)（圖3B），在攻毒d8后CD163-KO型和WT型大白豬只均剩存2頭。經(jīng)統(tǒng)計學分析，B1組CD163-KO型大白豬只與B2組WT型大白豬只在攻毒期間的存活率無顯著差異（Pgt;0.05）。

感染HPS1301的試驗豬只也在攻毒后d4開始有死亡的情況出現(xiàn)（圖3C），在攻毒d8后CD163-KO型大白豬只僅剩存1頭，而WT型大白豬只仍剩存3頭。經(jīng)統(tǒng)計學分析，C1組CD163-KO型大白豬只與C2組WT型大白豬只在攻毒期間的存活率無顯著差異（Pgt;0.05）。

此外，發(fā)病未死亡的豬只后續(xù)對上述細菌產(chǎn)生抗性，機體逐漸恢復正常，表現(xiàn)為咳嗽頻率減少、恢復食欲等狀態(tài)，并于d8全部進行安樂死處理。因此，通過攻毒期間的存活率可得，CD163-KO型大白豬只與WT型大白豬只對上述3種細菌的易感性及抵抗性無顯著差異。

2.3" 臨床解剖觀察

與沒有攻毒的正常豬相比，感染APP101的CD163-KO型和WT型試驗豬只肺隔葉均與胸膜有嚴重的粘連，表面有纖維素樣滲出物附著，間質增寬（圖4A），右側全肺有嚴重的出血病變（圖4B），左側肺隔葉有成片出血點，是典型的PCP的癥狀；感染SS201的CD163-KO型和WT型試驗豬只腦部均有輕微的水腫（圖4C），伴有輕微的腦膜炎，是感染SS后的其中一種癥狀；感染HPS1301的CD163-KO型和WT型試驗豬只心臟均出現(xiàn)心包積液的現(xiàn)象（圖4D），是感染HPS后典型的癥狀之一。上述死亡試驗豬只臨床解剖所觀察到的病理特征表現(xiàn)再次證明本次試驗已成功將3種菌株分別接入各組試驗豬只體內(nèi)。

感染3種細菌的試驗豬只肺部均出現(xiàn)不同程度的病變水腫及充血。感染APP101的A組試驗豬只肺部病變情況最嚴重（圖5A），A1組CD163-KO型大白豬只與A2組WT型大白豬只單側肺局部病灶均＞1/3隔葉面積，發(fā)生嚴重的病變，且另一邊有小部分心葉發(fā)生病變。根據(jù)胸膜肺炎SPES評分規(guī)則［30］，病變評分等級均為P3級，無顯著差異。感染SS201的B組試驗豬只肺部出現(xiàn)較輕的病變情況（圖5B），B1組CD163-KO型大白豬只與B2組WT型大白豬只僅有小范圍的肺尖葉與心葉間及肺隔葉的腹側緣發(fā)生粘連，無顯著差異。感染HPS1301的C組試驗豬只與A組豬只同樣發(fā)生嚴重的病變，其肺部也出現(xiàn)明顯的病變水腫及充血（圖5C），C1組CD163-KO型大白豬只與C2組WT型大白豬只單側肺局部病灶均＞1/3隔葉面積，無顯著差異。

2.4" 死亡試驗豬肺中細菌相對DNA拷貝量

為進一步探究CD163-KO型豬只與WT型豬只感染APP101、SS201、HPS1301的嚴重程度，采用qPCR法將死亡試驗豬肺病變部位中細菌DNA相對拷貝量進行定量分析對比，結果如圖6所示。

A組為感染APP1型菌株的試驗豬，經(jīng)過統(tǒng)計學分析后發(fā)現(xiàn)，感染APP101的CD163-KO型大白豬只與WT型大白豬只肺部病變部位中APP101的相對DNA拷貝量無顯著差異（Pgt;0.05）（圖6A）；B組為感染SS2型菌株的試驗豬，經(jīng)過統(tǒng)計學分析后發(fā)現(xiàn)，感染SS201的CD163-KO型大白豬只與WT型大白豬只肺部病變部位中SS201的相對DNA拷貝量無顯著差異（Pgt;0.05）（圖6B）；C組為感染HPS13型菌株的試驗豬，經(jīng)過統(tǒng)計學分析后發(fā)現(xiàn)，感染HPS1301的CD163-KO型大白豬只與WT型大白豬只肺部病變部位中HPS1301的相對DNA拷貝量無顯著差異（Pgt;0.05）（圖6C）。

總體而言，上述3種細菌入侵CD163-KO型大白豬只與WT型大白豬只并在體內(nèi)復制繁殖的情況無顯著差異，進一步說明CD163-KO型大白豬只與WT型大白豬只對這3種細菌的易感性無顯著差異。

3" 討" 論

基因編輯技術為動物抗病育種提供了新的研究思路。但在基因編輯成功后對特定疾病產(chǎn)生抗性的前提下，必須保證新材料或品種各方面的生理功能、生產(chǎn)性能、繁殖性能、商品價值等生物安全性的正常，因而將目標基因所表達的蛋白參與的生理功能研究透徹，并對基因編輯動物進行多方面的生物安全性評估十分重要。

以往大量的研究證明［31］，作為PRRSV入侵宿主最關鍵的受體，CD163基因片段是制備抗藍耳病豬理想的基因編輯靶點。然而，CD163作為巨噬細胞的清道夫受體，紅骨髓中表達CD163的巨噬細胞具有較強的向T細胞呈遞可溶性抗原的能力，在抵抗豬的多種病毒及細菌感染中起著重要的免疫作用［32］，缺失CD163蛋白很可能會影響豬體內(nèi)某些正常的免疫功能。本團隊于2023年就用CD163-KO型大白豬作為模型［10］證明了CD163基因的缺失不會影響豬只本身具備的巨噬細胞吞噬細胞外血紅蛋白的功能［33］，但其他的免疫功能是否正常有待

A.感染APP101的CD163-KO型和WT型豬只肺部正、反面均有大面積嚴重病變；B.感染SS201的CD163-KO型和WT型豬只肺部正、反面均有部分病變；C.感染HPS1301的CD163-KO型和WT型豬只肺部正、反面均有大面積嚴重病變進一步研究，尤其對細菌感染敏感性的變化需要進一步評估。

根據(jù)本研究中試驗豬只感染細菌后的臨床癥狀表現(xiàn)、存活率以及肺部病變部位細菌相對DNA拷貝量統(tǒng)計學比較分析表明，CD163-KO型大白豬與WT型大白豬對APP1型、SS2型以及HPS13型菌株的易感性均沒有顯著差異，缺失了CD163基因后，豬只對細菌的抵抗能力并沒有顯著變化。雖然本研究中的CD163-KO型大白豬與WT型大白豬在感染APP、SS或HPS后，不同試驗豬只抵抗細菌的能力存在著個體差異，部分試驗豬只發(fā)病至死亡的時間較短，影響細菌在活體內(nèi)的增殖，使得同組試驗豬只細菌相對DNA拷貝數(shù)出現(xiàn)離散型差異，但從統(tǒng)計學上分析，CD163-KO型大白豬在感染上述3種細菌后，存活率和肺部細菌載量與WT型豬并無顯著差異。CD163蛋白在炎癥和抵抗細菌感染的過程中發(fā)揮重要作用，有可能參與機體的免疫應答和病原體清除，但是相關研究較少，并沒有深入揭示CD163蛋白在體內(nèi)的生理功能。早期研究顯示，CD163基因的缺失并不影響豬體內(nèi)巨噬細胞的免疫表型，也不影響巨噬細胞相關的吞噬功能［9］。雖然CD163蛋白的真實體內(nèi)生理功能并沒有得到充分闡明，但是為了更全面評估CD163蛋白缺失的影響，對其可能影響的病原體清除能力進行了評估。本研究結果顯示，CD163-KO型豬對主要的幾個細菌的易感性與WT型豬相比并沒有顯著差異，為CD163基因編輯的生物安全性評價提供了一個關鍵證據(jù)。同時，CD163基因編輯對其他更多疾病的易感性影響依然需要進一步研究。

4" 結" 論

本研究結果表明，CD163-KO型豬對APP1型菌株、SS2型菌株以及HPS13型菌株的易感性與WT型豬相比無顯著變化，CD163蛋白的缺失并不會顯著影響豬只抵抗細菌感染的能力。本研究進一步證實了CD163-KO型豬具有較好的生物安全性，為其未來推廣應用打下基礎。

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（編輯" 郭云雁）