一株新型鴨呼腸孤病毒的分離及抗體檢測的間接ELISA建立

摘" 要： 新型鴨呼腸孤病毒（Novel duck reovirus， NDRV）能造成多品種雛鴨肝、脾的出血壞死，并造成免疫抑制，給我國的水禽養殖業造成了嚴重經濟損失，但市場上仍無商品化檢測試劑盒?；诖?，本研究通過蝕斑純化從臨床病料中成功分離到一株純凈的新型鴨呼腸孤病毒（命名為E232株），并以原核表達的σC蛋白為包被原建立了能夠檢測NDRV血清抗體的間接ELISA。遺傳進化分析結果顯示，E232株屬于NDRV，且與其他NDRV毒株的核苷酸同源性為96.4%～98.9%。動物回歸試驗結果表明，E232株發病率達到100%，發病雛鴨的脾出現嚴重腫脹、出血、壞死，泄殖腔排毒量和咽部排毒量均在感染后第5天達到高峰。建立的間接ELISA具有良好的特異性，與其他鴨病病原陽性血清均無交叉反應；檢測NDRV陽性血清最低檢出效價為1∶6 400，批內重復變異系數為1.53%～7.24%，批間重復變異系數為1.84%～8.30%，檢測236份臨床血清樣品的陽性率為80.93%。綜上，本研究E232株的成功分離，豐富了我國NDRV流行病學信息庫；間接ELISA的成功建立，為臨床NDRV防控提供了良好的技術手段。

關鍵詞： 新型鴨呼腸孤病毒；分離鑒定；σC蛋白；間接ELISA

中圖分類號：S852.659.4

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）12-5651-12

doi： 10.11843/j.issn.0366-6964.2024.12.028

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

收稿日期：2023-12-01

基金項目：國家自然科學基金面上項目（32272994）

作者簡介：徐晨晨（1999-），女，山東沂南人，碩士生，主要從事動物疫病防控研究，E-mail：15371016412@163.com

*通信作者：閆麗萍，主要從事動物傳染病的防控研究，E-mail：yanliping@njau.edu.cn

Isolation of a Novel Duck Reovirus Strain and Establishment of Indirect ELISA for Detecting Antibodies

XU" Chenchen， MA" Xujie， SONG" Suquan， YAN" Liping*

（College of Veterinary Medicine， Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095，" China）

Abstract： Novel duck reovirus （NDRV）， which can infect ducklings of many breeds， leads to hemorrhagic necrosis of liver and spleen and cause immunosuppression， and has caused serious economic losses to Chinese waterfowl farming industry. However， there are still no commercial test kits on the market. In this study， a pure new duck reovirus was successfully isolated from clinical materials by plaque purification， named as E232 strain. And by using σC protein expressed in prokaryotes as the coating antigen， an indirect ELISA was established to detect NDRV serum antibodies. The genetic evolution results show that E232 belongs to NDRV and has 96.4%-98.9% nucleotide homology with other NDRV strains. Animal regression test showed that the incidence of E232 is 100%. The spleens of the affected ducklings showed severe swelling， bleeding and necrosis， and the cloacal detoxification and pharynx detoxification reached the peak on the 5th day after infection. This assay detected NDRV antibody titer in positive sera at 1∶6 400 dilution， the coefficients of variation of intra batch and inter batch repeatability tests were 1.53%-7.24% and 1.84%-8.30%. It showed 80.93% positive rate for 236 clinical serum samples but did not react with any other disease positive sera. In conclusion， the successful isolation of the E232 strain in this study has enriched the epidemiological information database of NDRV in China. The successful establishment of the indirect ELISA provides a good technical means for the prevention and control of NDRV.

Key words： novel duck reovirus; isolation and identification; σC protein; indirect ELISA

*Corresponding author：" YAN Liping， E-mail： yanliping@njau.edu.cn

新型鴨呼腸孤病毒（novel duck reovirus， NDRV）屬呼腸孤病毒科正呼腸孤病毒屬［1］，2011年首次在北京鴨中被發現，為無囊膜的分節段的、雙鏈RNA病毒，病毒粒子直徑約為70 nm，呈二十面體雙殼結構［2］。NDRV基因組全長約23.4 kb［3］，按照在SDS-PAGE中遷移率的不同，將其分為3類：3個長片段（L1、L2、L3，分別編碼λ1、λ2、λ3蛋白）、3個中片段（M1、M2、M3，分別編碼μ1、μ2、μ3蛋白）與4個小片段（S1、S2、S3、S4，除S1外分別編碼σA、σB、σNS蛋白）［2，4，5］。S1基因為多順反子結構，有3個重疊的開放閱讀框，分別編碼σC、P10和P17蛋白［6］。其中σC蛋白是病毒外殼蛋白的主要成分，以同源三聚體的形式存在［7］，能夠誘導機體產生特異性抗體，介導病毒粒子與細胞受體結合，對病毒吸附、進入受體細胞至關重要［8-10］。同時NDRV編碼σC蛋白的S1基因與禽呼腸孤病毒（avian reovirus， ARV）和番鴨呼腸孤病毒（muscovy duck reovirus， MDRV）的S1基因同源性最低且變異性高，是與ARV、MDRV二者進行區別最主要的基因［5］。

不同于MDRV，NDRV能夠引起麻鴨、番鴨、北京鴨、櫻桃谷鴨等多品種雛鴨脾臟斑塊樣壞死，發病雛鴨的日齡以5～14日齡居多，病程一般為5～7d，發病率在5%～35%，死亡率為2%～20%［11］，并且NDRV能夠通過垂直和水平兩種方式傳播［12］，對我國水禽業養殖存在嚴重的威脅。由于呼腸孤病毒的基因組為多節段的RNA，常發生節段內重組，變異性極強，易產生新的毒株，使得已經研發出來的疫苗不能對新出現的毒株產生良好的保護效果［13］。目前NDRV已成為我國臨床上的優勢流行毒株，但國內市場還尚無商品化的針對新型鴨呼腸孤病毒病的疫苗、藥物和診斷試劑盒，NDRV的防控仍是養鴨業亟待解決的一大難題，因此建立一種快速、有效的檢測方法對NDRV進行防控至關重要。

基于上述分析，本研究從臨床病料分離鑒定了一株NDRV，初步探究了其對SPF鴨的致病能力，發現其能引起雛鴨脾臟嚴重出血、腫大、壞死。并通過原核表達σC蛋白，建立了一種能夠檢測NDRV抗體的間接ELISA，該方法具有良好的特異性、敏感性和重復性，為NDRV的防控和臨床檢測提供了理論支持。

1" 材料與方法

1.1" 主要生物材料

臨床樣品來自2021年山東省某養鴨企業送檢樣品；雞肝癌細胞（the leghorn male hepatoma cell line，LMH）細胞為本實驗室保存；NDRV、鴨腺病毒3型（duck adenovirus 3， DAdV-3）、鴨甲型肝炎病毒1型（duck hepatitis A virus 1， DHAV-1）、鴨甲型肝炎病毒3型（duck hepatitis A virus 3， DHAV-3）、禽腺病毒4型（fowl adenovirus 4， FAdV-4）、鴨坦布蘇病毒（duck Tembusu virus， DTMUV）陽性血清、NDRV陰性血清和大腸桿菌DH5α感受態細胞由本實驗室制備保存；pET32a質粒和Rosetta（DE3）感受態細胞購自南京諾唯贊生物科技有限公司；臨床鴨血清樣品來自江蘇某兩個養殖場及安徽某一養殖場。

1.2" 主要試劑

總核酸快速提取試劑盒及核酸提取儀、Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase、FastPure Gel DNA Extraction Mini kit、2×Taq Plus Master Mix II、HiScript Ⅱ 1st Strand cDNA、ClonExpress II one step cloning kit、ECL發光液均購自南京諾唯贊生物科技有限公司；質粒小提試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司；Hieff qPCR SYBR Green Master Mix、反轉錄試劑購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；LA Taq Mix、pMD-18T載體快速克隆試劑盒均購自TaKaRa公司；DMEM干粉、DMEM培養基、胎牛血清、低熔點瓊脂糖、中性紅溶液均購自Gibco公司；胰蛋白酶、青-鏈霉素購自生工生物工程（上海）股份有限公司；細胞凍存液購自蘇州新賽美生物科技有限公司；EcoRⅠ內切酶、XhoⅠ內切酶購自NEB（北京）；His標簽抗體購自蘇州博特龍免疫技術有限公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗鴨IgG（HRP-羊抗鴨IgG）、辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG（HRP-羊抗鼠IgG）和異硫氰酸熒光素酯標記的羊抗鴨IgG（FITC-羊抗鴨IgG）購自美國SeraCare（KPL）公司。

1.3" 臨床樣品檢測

2021年山東養殖場內雛鴨大量發病，表現出精神沉郁、腹瀉等臨床癥狀，同場雛鵝也出現類似癥狀。剖檢病變為脾臟出血壞死，肝臟斑塊狀出血，懷疑呼腸孤病毒感染。取肝臟、脾臟共約0.5 cm3置于滅菌PBS溶液內低溫研磨，12 000 g離心10 min后取上清于-80℃保存。

1.4" RT-PCR檢測及病毒分離純化

取“1.3”制備的組織研磨液上清400 μL，使用核酸提取儀提取總核酸，并反轉錄為cDNA，進行鴨常見病原的PCR檢測。取鑒定為陽性的病料樣品研磨液，經0.22 μm過濾除菌后接種于LMH細胞，24 h后出現典型的巨細胞融合病變，提取核酸進行PCR檢測，挑取NDRV陽性較強、其它病毒陽性弱的細胞培養產物，在LMH細胞上進行5輪蝕斑純化。將純化后病毒液使用間接免疫熒光分析（indirect immunofluorescence assay，IFA）進行鑒定，稀釋200倍后接種LMH細胞24 h，PBST清洗后使用4%多聚甲醛室溫固定1 h，清洗后使用5%脫脂乳37℃封閉1 h；將NDRV陽性血清稀釋200倍，37℃孵育1 h，FITC-羊抗鴨IgG稀釋100倍后37℃避光孵育1 h，觀察熒光。

1.5" S1基因測序及遺傳進化分析

參考朱英奇［14］文獻中引物（上游引物：5′-GCTTTTTTCTTCTCTGCCCA-3′，下游引物：5′-GATGAATAGCTCTTCTCATCGTGC-3′，擴增片段長度為1 568 bp），按照LA Taq Mix說明書配制反應體系，反應程序為95℃ 5 min；95℃ 30 s，56℃ 30s，72℃ 90 s，30個循環；72℃ 10 min。膠回收后連接至T載體，連接產物轉化至DH5α，將單克隆菌液送至南京擎科生物技術有限公司測序。使用遺傳進化分析軟件MEGA以最大似然法構建進化樹，Bootstrap算法運行1 000次檢驗進化樹的可信度，使用Megalign軟件進行同源性分析。所用參考毒株見表1。

1.6" TCID50測定

用LMH細胞鋪一48孔板，用含2%血清的培養基將病毒液稀釋至10-1～10-7 6個稀釋度，待細胞密度長至80%～90%時，每孔加入200 μL病毒液，每個梯度設6個重復，最后一列加入等量含2%血清的培養基作為陰性對照。細胞培養箱感作2 h后，棄去病毒液，用PBS清洗3遍，加入新的含2%血清的培養基，置于細胞培養箱中培養48 h，記錄出現病變的孔數，按照Reed-Muench法計算病毒TCID50。

1.7" 致病性試驗

孵化SPF鴨15只，對照組5只雛鴨，攻毒組10只雛鴨，攻毒組于1日齡時頸部皮下注射105.65 TCID50病毒液，對照組注射等量PBS。自攻毒后逐日對實驗鴨稱重記錄，攻毒前和攻毒后第1、3、5、7、9、11、13、15天采集雛鴨口腔和泄殖腔拭子，并在攻毒后第5、10與15天分別剖殺3只（對照組剖殺1只）采集組織臟器，觀察病變。臟器用4%多聚甲醛固定1周，送往武漢皮諾飛生物公司制作HE切片，觀察組織病理學變化。

提取脾臟、胸腺、法氏囊組織和口腔、泄殖腔拭子樣本核酸，合成基于SYBR Green Ⅰ的實時熒光定量NDRV RT-PCR檢測引物［15］（上游引物P1：5′-TGAGTGGCTGGGAACTGT-3′，下游引物P2：5′-CCATAAAGGAAGCAGAAG-3′，擴增片段位于S1基因，長度為233 bp），使用“1.5”中方法構建NDRV-233bp陽性質粒，進行熒光定量PCR檢測病毒載量。

1.8" 表達載體的構建

利用限制性內切酶EcoRⅠ和Xhol Ⅰ酶切pET32a質粒，酶切后的質粒用DNA回收試劑盒進行清潔回收。根據測序得到的E232株σC蛋白編碼序列設計同源臂引物（上游引物σC-F：5′-atggctgatatcggatccGAATTCATGGATCGCAACGAGG-TGATA-3′，下游引物σC-R：5′-ggtggtggtggtggtgtgCTCGAGCTAGCCCGTGGCGACGGTGAA-3′，小寫表示同源臂序列，擴增長度為966 bp），參照Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase說明書配制反應體系，反應程序為95℃ 3 min；95℃ 15 s，56℃ 15 s，72℃ 90 s，30個循環；72℃ 5 min。反應產物進行膠回收，同源重組至線性化pET32a載體上，轉化后取單克隆菌液送至南京擎科生物技術有限公司測序，確認測序結果正確后將菌株擴大培養提取重組質粒，命名為pET32a-σC。

1.9" 融合蛋白表達

將重組質粒轉化入表達菌株Rosetta（DE3）感受態細胞中，挑選陽性單克隆菌液以1∶100的比例擴大培養200 mL，37 ℃ 220 r·min-1至OD600 nm值達到0.05左右時加入IPTG溶液（終濃度為0.5 mmol·L-1），16 ℃ 120 r·min-1誘導表達16 h。表達結束后菌液12 000 r·min-1 4 ℃離心10 min，用lysis buffer重懸菌體沉淀，洗滌三次以去除IPTG，后用20 mL lysis buffer重懸沉淀，冰浴超聲破碎菌體，程序為超聲1 s，暫停3 s，總超聲時間1 h，超聲功率為最大輸出功率（150 W）的30%。破碎結束后12 000 r·min-1 4 ℃離心20 min，收集上清液，沉淀用含有8 mol·L-1尿素的20 mL lysis buffer溶解。將IPTG誘導前全菌、超聲前全菌、超聲后上清液、溶解沉淀和pET32a空載體對照樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳，分析重組蛋白的表達情況。

1.10" 重組蛋白的Western blot鑒定

將表達后的σC蛋白和空載體經SDS-PAGE電泳后轉至PVDF膜，5%脫脂乳于37 ℃封閉1 h，PBST清洗3次，每次5 min；將NDRV抗體陽性血清和His標簽抗體1∶1 000倍稀釋，37 ℃孵育2 h，PBST清洗后使用1∶5 000倍稀釋的HRP-羊抗鴨IgG和HRP-羊抗鼠IgG于37 ℃孵育1 h，清洗后使用ECL顯色液進行顯色。

1.11" 間接ELISA的建立

1.11.1" 最佳反應物濃度組合篩選

將“1.9”中成功表達的σC蛋白稀釋至0.25、0.5、1 μg·mL-1共3個濃度梯度，4℃過夜包被ELISA板12 h；待檢鴨陰、陽血清使用5%脫脂奶分別稀釋200倍、400倍以及800倍，37 ℃孵育1 h；HRP標記羊抗鴨IgG二抗使用5%脫脂奶分別稀釋1 000倍、2 000倍與4 000倍，37 ℃孵育1 h；孵育結束后每孔添加顯色液A液B液混合液100 μL，37 ℃反應15 min，后加入50 μL的終止液終止反應，置于全波長酶標儀內讀取OD450 nm。以最終陽性樣品OD450 nm值（P）和陰性樣品OD450 nm值（N）的比值P/N值作為判斷依據，P/N值最大為各反應物的最佳濃度。

1.11.2" 包被條件篩選

用探索得到的σC蛋白的最佳包被濃度進行包被，選用37℃和4℃兩個包被溫度，各包被溫度下設置1、2、3 h共3個時間長度進行包被，再在各包被時間長度下設置1、2、3 h共3個時間長度進行封閉，封閉結束后加入最佳稀釋度的陰、陽性血清進行ELISA檢測，測定OD450 nm，計算P/N值，選擇P/N值最大對應的包被條件作為最佳包被條件。

1.11.3" 反應時間組合篩選

用探索得到的σC蛋白最佳包被濃度和條件包被、封閉酶標板，封閉結束后加入最佳稀釋度的陰、陽性血清孵育，設置0.5、1、1.5 h共3個時間梯度；在各血清孵育時間長度下設置30、45、60 min共3個時間梯度進行二抗孵育；之后再在各二抗孵育時間長度下設置10、15、20 min共3個時間梯度進行顯色，顯色結束后加入50 μL的終止液終止顯色，測定OD450 nm，計算P/N值，選擇P/N值最大對應的組合作為最佳反應時間。

1.11.4" 臨界值的確定

利用已建立的間接ELISA測定24份鴨陰性血清的OD450 nm，每份3個重復，計算所得OD450 nm的平均值（x-）和標準差（s），以x-+3s作為判定標準，OD450 nm＞x-+3s判定為陽性，反之為陰性。

1.11.5" 特異性試驗

用建立的間接ELISA對實驗室保存的已知抗NDRV、DAdV-3、DHAV-1、DHAV-3、FAdV-4和DTMUV的陽性血清進行檢測，每組設置3個重復，以確定該方法的特異性。

1.11.6" 敏感性試驗

將本實驗室制備的NDRV鴨陰、陽性血清1∶800倍稀釋后，2倍梯度稀釋至1∶102 400，使用建立的間接ELISA進行試驗，確定其敏感性。

1.11.7" 重復性試驗

以相同批次和3個不同批次制備的NDRV σC蛋白作為包被原，選取NDRV陽性血清和陰性血清各3份進行檢測，分別進行批內、批間重復性試驗。

1.11.8" 臨床應用驗證及符合性試驗

應用建立的間接ELISA檢測江蘇某兩個養殖場及安徽某一養殖場的236份臨床血清樣品，了解新型鴨呼腸孤" 病毒感染的流行情況。用建立的間接ELISA和IFA同時檢測42份臨床血清樣品，IFA結果呈現綠色熒光則證明該樣品為NDRV抗體陽性，計算兩者的陽性及陰性符合率。

2" 結" 果

2.1" 病毒分離純化及遺傳進化分析

對2021年山東省某養鴨廠內疑似呼腸孤病毒感染的臨床樣品進行PCR檢測鑒定，確定病死雛鴨主要感染NDRV并混合感染FAdV-4和番鴨細小病毒（muscovy duck parvovirus， MDPV）。該病原在LMH細胞上接種24 h后可出現明顯的巨細胞融合病變，經過5輪蝕斑純化后得到一株純凈毒株，其FAdV、MDPV均為陰性（圖1），IFA結果顯示，分離株可與NDRV陽性血清結合，出現特異性熒光（圖2），命名為E232株。

擴增E232 S1基因片段，并進行遺傳進化分析，結果如圖3所示，呼腸孤病毒分為雞源的ARV、水禽源的MDRV和NDRV三個分支，E232與我國近年出現的強毒株NDRV TH11株為代表的新型鴨呼腸孤毒株處于同一分支（圖3）。同源性分析結果顯示，E232與NDRV參考毒株核苷酸序列相似性為96.4%～98.9%，而與MDRV、ARV相似性僅為43.2%～52.0%，其中，E232與2020年所分離的NDRV YL株親緣關系最近，核苷酸序列相似性達98.9%，而與NDRV代表株TH11和091的核苷酸序列相似性僅為96.4%和96.9%。

2.2" 病毒毒價滴定及致病性試驗

取經蝕斑純化后得到的E232病毒液，測得其TCID50為105.25·0.2 mL-1。動物回歸試驗顯示，1日齡SPF雛鴨攻毒后4 d左右開始出現精神沉郁、活動量下降、喜臥等癥狀，后逐漸消失，14 d觀察期內飲食正常，未發生死亡。攻毒后5、10 d剖檢可見脾臟存在明顯出血斑塊，攻毒后15 d剖檢發現脾臟轉為灰藍色，內部干硬粉末化，病變率為100%。HE病理切片結果顯示，攻毒組鴨感染后5、10、15 d脾均出現因細胞壞死崩解而形成的空腔，組織中出現大量均質紅染的纖維素性滲出物，血管內可見淋巴細胞聚集，胸腺皮質皆有明顯出血現象（圖4）。

擴增E232 S1 233 bp基因片段，提取標準質粒構建qPCR檢測方法，標準曲線為y=-3.702 6x+37.804，R2=0.998 7。

SPF鴨攻毒后5、10、15 d的脾、法氏囊和胸腺中均可檢出病毒，其它內臟檢測結果為NDRV陰性。在感染后5 d脾、胸腺及法氏囊病毒載量最高超過106 copies·g-1，其它器官及對照組鴨中未檢出病毒（圖5A）。咽部在感染后1 d可檢出病毒，泄殖腔在感染后3 d開始可檢出病毒，并都在5 d時達到高峰，且泄殖腔排毒量高于咽部排毒量，最高超過106 copies·mL-1（圖5B）。

2.3" 融合蛋白表達

用SDS-PAGE檢測重組質粒pET32a-σC誘導表達后的蛋白表達情況。結果表明，表達的σC蛋白大小與預期相符，約48 ku，并大量存在于菌體沉淀中（圖6A）。使用表達的σC蛋白為抗原，NDRV抗體陽性血清和His抗體為一抗，HRP標記的羊抗鴨IgG抗體為二抗，Western blot檢測結果顯示表達的σC蛋白能與NDRV抗體陽性血清和His標簽抗體發生特異性反應（圖6B、C）。

2.4" 間接ELISA最佳反應條件的確定

在最佳反應物濃度組合篩選中，當抗原包被濃度為0.5 μg·mL-1，待檢血清稀釋800倍，HRP羊抗鴨二抗稀釋1 000倍時P/N值最大，為21.25；在抗原包被條件篩選中，我們發現37℃包被2 h，封閉3 h時P/N值最大，為30.43；反應時間篩選中，當待檢血清孵育1.5 h，二抗孵育45 min，顯色15 min時P/N值最大，為27.58。綜上所述，經過系列條件優化，本研究建立了檢測NDRV抗體的間接ELISA，最佳反應條件如下：重組σC蛋白包被濃度為0.5 μg·mL-1，包被條件為37℃包被2 h，封閉3 h；待檢血清稀釋倍數為800倍，37℃孵育1.5 h；HRP羊抗鴨二抗稀釋倍數為1 000倍，37℃孵育45 min；顯色時間為15 min。

2.5" 臨界值的確定

利用已建立的NDRV抗體間接ELISA測定24份鴨陰性血清的OD450 nm值，計算得出平均值（x-）為0.158，標準差（s）為0.095，以x-+3s作為本ELISA的判定標準，得出判定標準OD450 mmgt;0.443判定為陽性，反之為陰性。

2.6" 特異性試驗

利用已建立的NDRV抗體間接ELISA測得DAdV-3、DHAV-1、DHAV-3、FAdV-4和DTMUV陽性血清的OD450 nm值均小于臨界值0.443，證明本研究建立的間接ELISA具有良好的特異性。

2.7" 敏感性試驗

利用已建立的NDRV抗體間接ELISA檢測2倍梯度稀釋的鴨陽性血清和陰性血清，發現陽性血清稀釋6 400倍時OD450 nm值仍高于臨界值0.443，而陰性血清OD450 nm值始終小于臨界值，表明該方法敏感性較高。

2.8" 重復性試驗

批內重復性試驗變異系數在1.53%～7.24%之間，批間重復性試驗變異系數在1.84%～8.30%之間，表明本研究建立的間接ELISA重復性較好。

2.9" 臨床應用驗證及符合性試驗

應用本研究建立的間接ELISA檢測236份臨床血清樣品，檢測出陰性樣品45份，陽性樣品191份，抗體陽性率為80.93%（191/236），具有良好的臨床應用性。在其中的42份臨床血清中，IFA檢測出陽性14份，陰性28份；而本研究建立ELISA檢測出陽性12份，陰性30份，兩種檢測方法符合率為95.24％（40/42）。

3" 討" 論

2009年，陳少鶯等［16］從病鴨組織臟器中分離鑒定到一株新型鴨呼腸孤病毒，但其引起的細胞病變與經典的MDRV不同，其主要表現為細胞凝聚成團，產生合胞體等細胞病變，而MDRV則以細胞圓縮為主［17］，因此將新發現的病毒稱為NDRV。據報道，該病毒最早在2005年前后出現于我國南方水禽養殖省份［2，16］，但隨著時間的推移，新型鴨呼腸孤病毒病逐漸在我國華北地區（如山東、河北等地）出現并流行［18-20］，近年在西南地區（如江西省、廣西壯族自治區、川渝地區）也有報道［21-23］。NDRV可感染多品種雛鴨，還可導致雛鴨免疫抑制和生長發育障礙［24］，其發病急、病程短，并且感染病例有逐年增加的趨勢［25］，其與MDRV抗原相關性較低［26］，因此建立方便快捷的檢測方法對NDRV的防控意義重大。

NDRV可在多種細胞中增殖，在細胞上傳代培養后，可誘導細胞融合，形成巨細胞融合病變［27］?；诖耍狙芯客ㄟ^LMH細胞蝕斑純化方式，從2021年山東省某養鴨企業送檢病料中分離出一純凈毒株，命名為E232株，接種LMH細胞后可在24 h內出現明顯的巨細胞融合病變。通過對其S1序列核苷酸序列同源進化分析，發現E232株與2020年所分離的NDRV YL株序列相似性達98.9%，這些數據提示NDRV的病毒基因組一直在不斷變異中。將上述分離株人工感染1日齡SPF雛鴨，結果顯示攻毒組鴨的脾皆呈典型的腫大、出血、壞死。組織病理學觀察顯示，攻毒組鴨脾均呈現組織壞死崩解，胸腺皮質部皆有明顯出血現象，與前人研究相符［27-29］。qPCR檢測結果顯示，SPF鴨感染后5、10、15 d的脾、胸腺和法氏囊均可檢出病毒，雛鴨在攻毒后1 d咽部開始排毒，攻毒后3 d泄殖腔開始排毒，且泄殖腔排毒量高于咽部排毒量，提示E232株也許可以通過糞口傳播。

雖然目前NDRV的病原檢測技術在臨床上應用很多，但是疫苗及抗體的研發對該病的防控仍然具有重要的臨床價值。目前有多篇文獻報道了NDRV疫苗或者抗體的研究情況［6，30-31］，如對母鴨免疫NDRV滅活苗能夠誘導雛鴨產生母源抗體［31］。因此評估研發的疫苗是否有效，能否誘導產生高效的NDRV抗體等都需使用特異的抗體檢測技術，但目前市場上尚無針對NDRV抗體的ELISA商品化試劑盒。σC蛋白存在于NDRV病毒粒子外衣殼的12個頂角上，其表面存在特異性抗原決定簇，可以刺激機體產生特異性中和抗體［32］，因此本研究以NDRV E232株為模板，以原核表達的σC蛋白作為ELISA包被抗原，通過一系列的條件優化，最終建立了針對NDRV抗體的間接ELISA。使用本方法可檢出稀釋6 400倍NDRV陽性血清，說明建立的間接ELISA具有良好的敏感性；檢測其他常見水禽病毒陽性血清，結果為陰性，無交叉反應，說明本方法特異性較好；對包被蛋白的批內和批間重復性試驗結果顯示變異系數始終小于10%，證明本方法具有良好的重復性；檢測236份臨床血清樣品，NDRV抗體陽性率為80.93%，具有一定的臨床適用性。本研究建立的針對NDRV抗體的間接ELISA為養殖企業NDRV的大規模篩查提供了可選方法，也為未來研發的NDRV疫苗的免疫效果檢驗提供了技術支持。

4" 結" 論

本研究通過細胞蝕斑純化的方式從臨床病料中分離得到一株新型鴨呼腸孤病毒（NDRV E232株），豐富了新型鴨呼腸孤病毒毒種資源，為進一步研究和生物制品的制備奠定基礎。動物回歸試驗結果顯示，該毒株致病率100%，剖檢發現感染鴨的脾呈腫大、出血、壞死，提示脾壞死可以作為NDRV E232株的致病指標；組織病理學觀察可見雛鴨免疫器官脾和胸腺均出現病變，證實NDRV感染主要損傷雛鴨脾等免疫器官；對雛鴨咽部和泄殖腔拭子進行病毒載量檢測證實感染NDRV后的雛鴨可以通過口腔和泄殖腔持續排毒。本研究成功構建了pET32a-σC表達載體，利用誘導表達的σC蛋白成功建立了NDRV抗體間接ELISA，該方法敏感性高，特異性好，重復性好，能夠適用于臨床上NDRV抗體檢測，為未來NDRV疫苗免疫效果的評價提供了檢測手段。

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（編輯" 白永平）