雞傳染性貧血病毒對SPF雞的致病特性及其排毒規律研究

摘" 要： 旨在了解雞傳染性貧血病毒（CAV）對SPF雞的致病性、排毒規律及水平傳播能力。本研究將CAV JL17/1204株經腹腔接種和同居接觸感染1日齡及28日齡SPF雞，在感染后3 d（dpi）、5 dpi、7 dpi、9 dpi、11 dpi、14 dpi、21 dpi、28 dpi、42 dpi、56 dpi、84 dpi和112 dpi，感染組和同居組分別采集3只雞的抗凝血并剖檢，以檢測其貧血、胸腺萎縮情況；每個時間點另采集每組20只雞的咽拭子和肛拭子通過PCR方法進行排毒檢測。臨床觀察結果顯示，1日齡感染組和同居組雞的死亡率分別為50.0%和10.0%，死亡時間為12～15 dpi；28日齡感染組和同居組雞感染后無死亡。剖檢結果顯示，各組發病雞出現胸腺萎縮和/或貧血癥狀，1日齡感染組和同居組發病率分別為100.0%和20.0%；28日齡感染組和同居組發病率分別為10.0%和8.0%。排毒檢測結果顯示，1日齡感染組雞呼吸道和消化道分別從3 dpi、5 dpi開始排毒，1日齡同居組呼吸道和消化道排毒期分別為同居后5～84 d和7～42 d；28日齡感染組呼吸道和消化道排毒期分別為感染后3～9 dpi和5～14 dpi；28日齡同居組呼吸道和消化道排毒期分別為同居后5～9 d和5～42 d。結果提示CAV對1日齡SPF雞致病性強，感染后可誘導雞死亡、胸腺萎縮和/或貧血等致病特征，對28日齡SPF雞致病性明顯減弱；接種和同居感染后均經呼吸道和消化道排毒，可誘導同居接觸感染雞發病甚至死亡，表明CAV具有較強的水平傳播能力。本研究結果系統闡明了CAV感染致病特征和排毒規律，為雞群科學開展CAV的凈化提供了理論指導和科學依據。

關鍵詞： 雞傳染性貧血病毒；SPF雞；致病特性；排毒規律；水平傳播

中圖分類號：S831.7

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）12-5684-08

doi： 10.11843/j.issn.0366-6964.2024.12.031

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

收稿日期：2024-02-18

基金項目：“十四五”國家重點研發計劃（2022YFF0710500）；現代農業產業體系肉雞體系（CARS-41）

作者簡介：馮笑艷（1998-），女，河南鄭州人，碩士生，主要從事獸醫微生物及其分子生物學研究，E-mail：2075586214@qq.com

*通信作者：張艷萍，主要從事獸醫微生物及其分子生物學研究，E-mail：zhangyanping03@caas.cn;高玉龍，主要從事獸醫微生物及其分子生物學研究，E-mail：gaoyulong@caas.cn

Pathogenicity and Shedding Virus of Chicken Infectious Anemia Virus on SPF Chickens

FENG" Xiaoyan1， HU" Mingxue1， LIN" Yumeng1， GAO Honglei1， YU" Haibo2， LIU Changjun1， QI" Xiaole1， ZHANG" Wei2， ZHANG" Yanping1*， GAO" Yulong1*

（1.State Key Laboratory for Animal Disease Control and Prevention， Harbin Veterinary Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Harbin 150069，" China;

2.National Poultry Laboratory Animal Resource Center， Harbin Veterinary Research Institute， CAAS， Harbin 150069，" China）

Abstract：" The object of this study was to understand the pathogenicity， virus shedding and horizontal transmission ability of chicken infectious anemia virus （CAV） on SPF chickens. In this study， 1-day-old and 28-day-old SPF chickens were infected with CAV JL17/1204 strain by intraperitoneal inoculation and cohabitation. At 3 days post infection （dpi）， 5 dpi， 7 dpi， 9 dpi， 11 dpi， 14 dpi， 21 dpi， 28 dpi， 42 dpi， 56 dpi， 84 dpi and 112 dpi， the anticoagulant blood of 3 chickens in each group was collected and the thymus was dissected to detect anemia and thymus atrophy. Throat swabs and anal swabs of 20 chickens in each group were collected at each time point to detect the virus shedding by PCR method. The clinical observation results showed that the mortality rates of 1-day-old infected chickens and cohabiting infected chickens were 50.0% and 10.0%， respectively， and the death occurred at 12-15 dpi; 28-day-old infected and cohabiting infected chickens did not die. The results of autopsy showed that the thymus atrophy and/or anemia symptoms appeared in the diseased chickens of each group. The incidence rate of the 1-day-old infected chickens and the cohabiting infected chickens were 100.0% and 20.0%， respectively; The incidence of 28-day-old infected chickens and cohabiting infected chickens were 10.0% and 8.0%， respectively. The virus shedding results showed that the respiratory tract and digestive tracts of the 1-day-old infected chickens began to shed from 3 dpi and 5 dpi， respectively. The detoxification period of the respiratory and digestive tracts of the 1-day-old cohabiting infected chickens were 5-84 days and 7-42 days after cohabitation， respectively; The respiratory and digestive virus shedding periods in the 28-day-old infected chickens were 3-9 dpi and 5-14 dpi， respectively; The respiratory and digestive virus shedding periods in the 28-day-old cohabiting infected chickens were 5-9 days and 5-42 days after cohabitation， respectively. The results showed that CAV was highly pathogenic to 1-day-old SPF chickens， and could cause high mortality， thymus atrophy and/or anemia after infection， but its pathogenicity was obviously weakened to 28-day-old SPF chickens. Infected chickens excrete virus through respiratory tract and digestive tract， and the excreted virus can infect cohabiting chickens to get sick or even die， which indicates that CAV has high horizontal transmission ability. The results of this study systematically expounded the pathogenic characteristics and virus shedding of CAV infection， which provided theoretical guidance and scientific basis for the scientific purification of CAV in chickens.

Key words： chicken infectious anemia virus; SPF chickens; pathogenicity; shedding virus; horizontal transmission

*Corresponding authors： "ZHANG Yanping， E-mail： zhangyanping03@caas.cn; GAO Yulong， E-mail： gaoyulong@caas.cn

雞傳染性貧血（chicken infectious anemia， CIA）是由雞傳染性貧血病毒（chicken infectious anemia virus， CAV）引起雞的一種的免疫抑制病，在2～4周齡的雞群中較為常見。CAV屬于圓環病毒科、環狀病毒屬［1］。CAV是1979年由日本學者Yuasa等［2］首次被發現并報道，隨后南美洲、意大利、南非等地陸續報道分離出CAV［3-5］，目前CAV在全世界范圍內廣泛流行。我國首次于1992年報道了CAV［6］，隨后的血清學和病原學調查結果顯示，山東、安徽、河南、河北、江西、福建等地雞群中CAV的感染普遍存在，且流行范圍越來越廣泛［7-10］。

CAV的自然宿主主要是雞，研究表明，鵪鶉、烏鴉、鴿子可感染CAV［11］。CAV主要侵害雛雞的骨髓造血細胞以及免疫器官（胸腺）的前T淋巴細胞，臨床上的典型癥狀是貧血、皮下出血、生長遲緩、羽毛凌亂、肢體癱瘓、胸腺和骨髓萎縮［12］。感染雞通常免疫功能低下，這增加了繼發性病毒、細菌或真菌感染的風險，越來越多報道CAV易與網狀內皮組織增生癥病毒、禽腺病毒、禽白血病病毒、新城疫病毒發生混合感染，導致較高的死亡率［13-14］，對養禽業的發展造成了嚴重危害。

由于沒有商品化的特效藥及疫苗，目前CIA主要通過生物安全進行防控，因此了解CAV的致病特征、排毒規律及水平傳播能力尤為重要。本研究將CAV JL17/1204株通過腹腔接種和同居接觸感染1日齡及28日齡SPF雞，分析CAV對SPF雞的致病特性、排毒規律和水平傳播能力，為CIA的診斷及防控凈化方案的制定提供理論依據。

1" 材料與方法

1.1" 主要實驗材料

1640細胞培養基購自Sigma公司；胎牛血清購自Gibco公司；Ex Taq DNA聚合酶、DL2000 Marker購自寶生物工程（大連）有限公司；DNA提取試劑盒購自AxyGen公司；PBS、異丙醇、冰乙酸均為國產分析純產品。CAV特異性檢測引物CAV F/R由吉林庫美生物科技有限公司合成［15］（表 1）。

1.2" 病毒、SPF雞分組及處理方式

感染用病毒為CAV分離毒株JL17/1204［16］，在MDCC-MSB 1細胞培養8代，效價為103.5 TCID50·100 μL-1。1日齡及28日齡SPF雞各分三組：感染組、同居組及空白對照組，每組50只。同一日齡的感染組與同居組雞飼養于同一負壓隔離器。感染組經腹腔注射接種1日齡和28日齡SPF雞，體積分別為200 μL·只-1和1 mL·只-1；同居組及空白組雞不做處理。每組各標記（戴腳標）10只雞僅用于統計死亡率，剩余40只雞用于在3 dpi（days post infection， dpi）、5 dpi、7 dpi、9 dpi、11 dpi、14 dpi、21 dpi、28 dpi、42 dpi、56 dpi、84 dpi、112 dpi每組各隨機剖檢3只雞，采集胸腺及抗凝血，采集各組20只雞的咽拭子和肛拭子。采集14 dpi胸腺，經用10%福爾馬林（pH 7.2）進行固定，制備石蠟切片，進行HE染色，鏡檢觀察顯微病理變化。

1.3" SPF雞人工及同居感染CAV后的發病特征

1.3.1" 死亡率統計

持續觀察并記錄SPF雞人工及同居感染CAV（JL17/1204）后的死亡情況，計算死亡率并使用GraphPad Prism 8繪制生存曲線。

1.3.2" 胸腺萎縮情況

通過剖檢并稱重后計算胸腺指數判定胸腺是否發生萎縮。計算每只雞的胸腺體重比（胸腺體重比=胸腺重量/體重）及胸腺指數（胸腺指數=感染組或同居組每只雞的胸腺體重比/空白組雞胸腺體重比均值），若感染組或同居組雞的胸腺指數低于空白組雞胸腺指數均值的70%，即胸腺指數＜0.7，則判定胸腺發生萎縮。將各組胸腺指數使用GraphPad Prism 8繪圖。

1.3.3" 貧血癥狀

紅細胞壓積（hematocrit， HCT）值＜27%則判定雞只出現貧血癥狀。將剖檢雞的抗凝血，加至壓積管的100刻度處，2 260 r·min-1離心30 min，記錄紅細胞層所處數值，紅細胞壓積值=紅細胞的高度/液面高度×100。

1.4" SPF雞人工及同居感染CAV后的排毒規律

在咽拭子、肛拭子中加入600 μL PBS，震蕩2 min后取200 μL提DNA，進行PCR檢測，反應體系：2×PCR Taq Starmix10 μL，上、下游引物（CAV F/R）各1 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 6 μL；反應條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 s，共35個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。陽性對照為實驗室保存的HeN19/3001［16］病毒液，陰性對照為MSB 1細胞。將PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳試驗。使用GraphPad Prism 8繪制各組雞通過呼吸道、消化道排毒率的規律圖。

2" 結" 果

2.1" SPF雞人工及同居感染CAV后死亡率統計

各組分別10只雞用于臨床觀察。1日齡感染組在12～15 dpi累計死亡5只，死亡率50.0%；同居組雞在12 dpi死亡1只，死亡率10.0%；28日齡感染組及同居組雞在感染CAV后均未出現死亡現象，生存曲線如圖1所示。

2.2" SPF雞人工及同居感染CAV后胸腺萎縮情況

每個時間點，每組隨機3只雞剖檢結果顯示，1日齡感染組雞在3 dpi開始出現胸腺萎縮（檢測到21 dpi），在11 dpi和14 dpi剖殺雞胸腺全部萎縮（3/3）；1日齡同居組雞在同居后7 d開始出現胸腺萎縮現象，在同居后21 d胸腺萎縮最為嚴重，剖殺雞胸腺全部萎縮（3/3），病理切片結果可見胸腺皮質和髓質界限消失，皮質淋巴細胞顯著減少（圖 2A），對照組胸腺正常（圖2B）。而此時感染組雞胸腺已經部分恢復（2/3），在同居組雞在同居后28 d雞胸腺全部恢復（3/3）（圖 2C）。

28日齡感染組和同居組雞胸腺萎縮程度比1日齡感染組和對照組雞明顯減弱，感染組雞在84 dpi和112 dpi出現了胸腺萎縮現象（2/3），同居組雞在同居后7 d～9 d、21 d和84～112 d有部分雞出現了胸腺萎縮現象（1/3～2/3）（圖2D）。

2.3" SPF雞人工及同居感染CAV后貧血癥狀統計

HCT值＜27%是判定雞出現貧血癥狀的一個重要指標。檢測結果顯示，1日齡感染組雞檢測期9～21 dpi，檢測期內各時間點均有雞HCT值＜27%；1日齡同居組雞在同居后11～21 d也出現了HCT值＜27%的現象，在之后的檢測時間點HCT值均高于27%。28日齡感染組和同居組雞僅在9 dpi分別出現了HCT值＜27%的現象；空白組雞HCT值均高于27%（表 2）。

2.4" SPF雞人工及同居感染CAV后的排毒情況

1日齡感染組檢測期為3～14 dpi，其他組檢測期為3～112 dpi。PCR檢測結果顯示，空白組雞咽拭子、肛拭子均為陰性。

1日齡感染組咽拭子在3 dpi開始出現CAV陽性，咽拭子陽性率呈持續上升趨勢，其中14 dpi陽性率最高，為84.6%（11/13）。1日齡同居組雞咽拭子在同居后5～84 d出現CAV陽性，其中14 dpi咽拭子陽性率最高，為90.5%（21/19）（圖3）。

1日齡感染組雞肛拭子在5 dpi開始出現CAV陽性，其中9 dpi陽性率最高，為94.7%（18/19）。1日齡同居組雞肛拭子在同居后7～42 d出現CAV陽性，陽性率呈現先上升后下降趨勢，其中11 dpi和28 dpi陽性率最高，為100.0%（圖3）。

28日齡各組雞的咽拭子、肛拭子PCR檢測結果顯示，28日齡感染組雞咽拭子在3～9 dpi出現CAV陽性，其中5 dpi陽性率最高，為75.0%（15/20）。同居組雞咽拭子在5～9 dpi出現CAV陽性，其中7 dpi陽性率最高，為75.0%（15/20）（圖4）。

28日齡感染組雞肛拭子在5～14 dpi呈CAV陽性，其中5 dpi陽性率最高，為91.7%（22/24）。28日齡同居組SPF雞肛拭子在5～42 dpi為CAV陽性，其中21 dpi肛拭子CAV陽性率最高，為58.3%（7/12）（圖4）。

3" 討" 論

CIA的典型特征是貧血和胸腺萎縮，誘發機體免疫抑制，極易發生混合感染，對雞群造成較大危害，目前CAV的分布極為廣泛［17］。由于CAV對外界理化因素具有一定的抵抗力，常規手段不易使其失活［18］，雞群一旦感染不易清除，且目前沒有特效藥及疫苗用于CIA的防治。然而由于目前對于CAV感染雞后的致病特性及排毒規律的報道較少，也不利于防控凈化工作的開展。為此，本研究以1日齡及28日齡的SPF雞為研究對象，通過人工接種及同居兩種途徑進行感染，系統研究了雞群感染CAV后的致病特性及排毒規律，以期為防控凈化方案的制定提供理論指導。

SPF雛雞感染CAV后，根據不同日齡一般呈現出臨床及亞臨床兩種體征，10～14日齡雛雞一般表現為食欲減退、體重減輕、發育遲緩、雞冠顏色蒼白等臨床體征，2～3周齡及以上的雛雞通常情況下只會發展為亞臨床疾病［19］。臨床感染雞還會出現翅膀皮膚呈藍紫色或發生炎癥、伴有槳液性滲出物流出［20］。近年來，多項研究結果表明，CAV分離毒株接種1日齡SPF雞后可引起20%～50%的死亡率，接種雞出現骨髓黃化、胸腺萎縮及增長遲緩等癥狀［15，21-22］。本研究所用毒株JL17/1204分離于吉林某雞群，10日齡開始發病，到30日齡雞死亡率10%～15%，經MDCC-MSB 1細胞分離獲得。遺傳進化分析顯示該毒株的VP1基因序列與國內大多數分離毒株位于同一分支，具有流行毒株代表性［16］。感染1日齡SPF雞死亡率較高，可達50.0%，而且可引起同居雞全部感染并誘導10%的雞死亡，說明該毒株致病性強，水平傳播能力也強。CAV可以水平傳播，消化道是CAV的主要傳播途徑、其次也可通過呼吸道進行感染［20］。呼吸道和消化道的排毒分別通過PCR檢測咽拭子和肛拭子是否攜帶病毒，本研究檢測結果表明，1日齡及28日齡感染雞均可通過呼吸道和消化道排毒，消化道排毒率高于呼吸道，排毒期長于呼吸道。這提示了，對雞群CAV感染情況進行檢測時，可采集咽拭子或肛拭子進行PCR檢測，其中肛拭子檢出時間長可作為拭子采集的首選。

有研究曾使用豬圓環病毒2型（porcine circovirus type 2，PCV-2）對SPF小鼠進行感染，其鼻液、唾液、尿液、糞便均能檢測到PCV-2的存在，與其同籠同居、同房非同籠同居的小鼠均能在臟器中檢測到病毒的存在，說明PCV既可以進行接觸式水平傳播也可以進行非接觸式的空氣傳播［23］。PCV與CAV同屬于圓環病毒屬，CAV的水平傳播方式與其一致。本研究中將相同日齡的SPF雞與感染雞飼養于同一隔離器，同居雞與感染雞可接觸，1日齡和28日齡同居組均感染并可通過呼吸道及消化道進行排毒，表明CAV具有較強的接觸式水平傳播能力。因此在進行CAV防控工作時，需要重點監測小日齡雛雞，嚴格遵守并實施生物安全防控措施，增強監測力度，增加抽檢頻率，及時發現并淘汰CAV陽性雞，以保證雞群健康。

綜上所述，本研究系統研究了人工及同居兩種途徑感染的1日齡及28日齡的SPF雞的臨床癥狀、排毒規律和水平傳播能力，研究結果為CAV凈化方案的制定、臨床采樣提供了理論依據，具有重要的理論與實際意義。

4" 結" 論

CAV對1日齡SPF雞致病性強，感染后可誘導雞死亡、胸腺萎縮和/或貧血等致病特征，對28日齡SPF雞致病性明顯減弱；接種和同居感染后均經呼吸道和消化道排毒，可誘導同居接觸感染雞發病甚至死亡，表明CAV具有較強的水平傳播能力。

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（編輯" 白永平）