牛病毒性腹瀉病毒誘導鐵死亡對其復制水平的影響

摘" 要： 本研究旨在探究牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）感染對牛腎細胞（Madin-Darby Bovine Kidney cells， MDBK）鐵死亡的調控作用及其對病毒復制的影響。本研究通過激光共聚焦、Western blot、qPCR和電鏡技術等技術檢測BVDV感染MDBK細胞鐵死亡發生與病毒復制水平，另外，使用鐵死亡抑制劑Fer-1研究鐵死亡對病毒復制和細胞炎性因子表達的影響。結果表明：BVDV（MOI=5）感染細胞較正常對照組細胞死亡率顯著增加（Plt;0.05），感染細胞內Fe2+和脂質過氧化水平較正常細胞顯著升高（Plt;0.05），透射電鏡檢測可見線粒體表面積變小、嵴減少以及膜密度增加等鐵死亡發生特征；將鐵死亡抑制劑Fer-1預處理MDBK細胞后，可顯著抑制BVDV感染病毒復制水平（Plt;0.05）；此外，BVDV感染誘導鐵死亡對MDBK細胞中IL-1β、IL-18以及IFN-β等炎性因子呈正調控效應。以上結果提示，BVDV感染可引起宿主細胞鐵死亡，且鐵死亡發生可顯著促進病毒復制水平以及宿主細胞炎性因子表達。

關鍵詞： 牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）；鐵死亡；病毒復制；炎性因子

中圖分類號： S852.653

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）12-5716-09

doi： 10.11843/j.issn.0366-6964.2024.12.034

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

收稿日期：2023-12-12

基金項目：國家級大學生創新創業訓練計劃項目（202310712186）；陜西省農業科技創新計劃項目（NYKJ-2022-YL（XN）08）

作者簡介：張梓璇（2003-），女，河北安平人，本科生，主要從事動物醫學研究，E-mail：451095676@qq.com

*通信作者：齊雪峰，主要從事反芻獸重大疫病致病機制與防控研究，E-mail：yxyan2002@163.com

The Effects of Bovine Viral Diarrhoea Virus （BVDV）-induced Ferroptosis on Virus Replication

ZHANG" Zixuan1，2， ZHANG" Ying1，2， LI" Zhijun1，2， YANG" Jingling1，2， JIANG" Zihao1，2， HUANG" Huamin1，2， QI" Xuefeng1，2*

（1.College of Veterinary Medicine， Northwest Aamp;F University， Yangling 712100，" China;

2.Key Laboratory of Ruminant Disease Prevention and Control （West）， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Yangling 712100， China）

Abstract：" This study aimed to investigate the regulatory effect of bovine viral diarrhoea virus（BVDV） infection on ferroptosis in Madin-Darby Bovine Kidney（MDBK） cells and its effect on viral replication. Technologies such as confocal microscopy， Western blot， qPCR and electron microscopy were used to detect ferroptosis and the level of viral replication in BVDV-infected cells. Furthermore， the viral replication level and inflammatory cytokines expression in BVDV-infected cells pretreated with Fer-1， a commonly used ferroptosis inhibitor， were also detected. The results showed that， compared with the normal control group， the mortality rate of cells infected with BVDV （MOI=5） was significantly increased （Plt;0.05）， which was accompanied with increased levels of Fe2+ and lipid peroxidation （Plt;0.05）. Transmission electron microscopy （TEM） analysis revealed that BVDV-infected and Erastin-treated cells displayed shrunk mitochondria with fewer cristae， increased mitochondrial membrane density and decreased mitochondrial mean areas compared with those of mock-infected cells， which was a typical morphological feature of ferroptosis. Fer-1 treatment significantly inhibited the levels of viral replication in BVDV-infected cells （Plt;0.05）. In addition， ferroptosis induced by BVDV infection had positive regulatory effects on inflammatory cytokines expression， including IL-1β， IL-18 and IFN-β. The results suggested that BVDV infection can induce ferroptosis in host cells， and the induction of ferroptosis enhanced the level of viral replication and the expression of inflammatory cytokines.

Key words： bovine viral diarrhoea virus （BVDV）; ferroptosis; virus replication; inflammatory cytokines

*Corresponding author： QI Xuefeng，E-mail：yxyan2002@163.com

牛病毒性腹瀉病毒（bovine viral diarrhea virus， BVDV）在全世界分布廣泛，其宿主包括牛、豬、羊、牦牛、鹿、駱駝及多種野生偶蹄動物［1］。BVDV以持續性感染和免疫抑制為主要致病特征。牛感染BVDV后會出現腹瀉，消化道和腸黏膜糜爛等癥狀；懷孕母牛感染則會造成胚胎死亡、胎兒畸形或胎兒建立免疫耐受，持續性感染動物出生［2-3］。持續性感染的牛可以通過分泌物等持續不斷地向環境中排毒，致使更多的牛感染BVDV，給養牛業造成巨大損害［3］。

鐵死亡是由脂質過氧化介導的一種鐵依賴性細胞程序性死亡方式。細胞鐵死亡過程由鐵代謝、活性氧（reactive oxygen species，ROS）調控和脂質代謝三種因素共同參與［4］。有研究表明，鐵死亡可以通過自由基等途徑參與病毒感染過程［5］。例如豬流感病毒（SI）、輪狀病毒（RV）通過誘導宿主細胞鐵死亡促進病毒復制水平［6-7］；而豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬瘟病毒（CSFV）通過抑制鐵死亡增強病毒感染水平［8-9］。然而，有關BVDV感染對宿主細胞鐵死亡的調控尚不清楚。

本研究旨在探究致細胞病變型（CP） BVDV感染對MDBK細胞鐵死亡的調控作用及其對病毒復制的影響，進一步探究抑制鐵死亡對病毒復制水平以及細胞炎性因子表達的影響，這對深入闡明BVDV致病機理及發掘防控新靶點具有重要的理論意義和應用價值。

1" 材料與方法

1.1" 病毒及細胞

本試驗中所用BVDV HJ-1株（基因型為BVDV-1b，登錄號：JX065783）為本實驗室保存，感染MDBK細胞可出現明顯細胞病變效應（cytopathiceffect，CPE）；牛腎細胞（MDBK）由本實驗室傳代保存。

1.2" 主要試劑

DMEM購自美國Hyclone公司；胎牛血清、青霉素/鏈霉素雙抗溶液和Opti-MEM培養基購自美國Gibco公司；胰蛋白酶購自上海閃晶生物公司；RIPA蛋白裂解液、PMSF蛋白酶抑制劑和5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖溶液購自北京索萊寶科技有限公司產品；TRIzol試劑購自大連寶生物公司產品；鼠抗BVDV NS4B抗體為本實驗室制備保存；鼠抗IL-18抗體、鼠抗IL-1β抗體和鼠抗IFN-β抗體購自美國Immunoway公司；鼠抗GAPDH抗體購自美國Abcom公司產品；Liperfluo-細胞脂質過氧化物檢測試劑盒、鐵離子探針FerroOrange-二價鐵離子檢測探針均購自同仁化學試劑公司；脂質氧化（MDA）檢測試劑盒購自碧云天試劑公司；HRP標記羊抗鼠二抗購自北京TransGen Biotech公司；瓊脂糖（Agarose）購自HydraGene公司；PVDF膜購自美國Merck-Millipore公司；ECL發光液試劑盒購自上海博迅實業有限公司；EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix購自北京TransGen Biotech公司；TransStart Tip Green qPCR SuperMix購自北京TransGen Biotech公司。

1.3" 試驗設計

將感染BVDV（MOI=5）48 h的MDBK細胞作為試驗組，同時設置未感染BVDV細胞為陰性對照組，用Erastin（10 μmol·L－1）處理組細胞為陽性對照組。測定比對BVDV感染的MDBK細胞的細胞活率、線粒體形態變化以及細胞中的鐵死亡特征變化，從而判斷BVDV感染的MDBK細胞是否發生鐵死亡。

在探究BVDV誘導鐵死亡對其復制水平的影響時，將BVDV+Fer-1組作為試驗組，BVDV+DMSO組作為對照組，通過qPCR、Western blot和TCID50法進行測定。同時BVDV+Fer-1組作為試驗組，BVDV+DMSO組、Fer-1組、DMSO組作為對照組測定各組各炎性細胞因子mRNA以及蛋白質表達水平，從而探究BVDV誘導的鐵死亡對其感染細胞中炎性細胞因子表達的影響。

1.4" 病毒感染及TCID50測定

取生長狀態良好的MDBK細胞，用胰酶消化，在10% DMEM培養液中重懸細胞，進行細胞計數，調整細胞濃度至1×105個·mL－1，于12孔板按1 mL·孔－1添加細胞懸液。培養24 h后，棄掉培養液用PBS清洗2次后，每孔加1 mL 2%的DMEM培養液，每孔感染BVDV（MOI=5），于37℃孵育。收獲的病毒液進行TCID50測定，將收集的細胞或上清反復凍融，經梯度稀釋后（10-1、10-2、……、10-10），分別加入96孔板中，每孔100 μL，每個梯度8個重復。置細胞于37 ℃、5% CO2的培養箱中5～7 d，每天觀察細胞病變情況，并用Reed-Muench法計算TCID50。

1.5" Western blot檢測

將收集細胞樣本用RIPA裂解液（含PMSF）裂解后進行SDS-PAGE檢測，然后將蛋白質電轉至PVDF膜上，封閉液室溫封閉2 h，分別孵育抗目的蛋白一抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜5次，二抗孵育2h，TBST洗膜5次，加入化學發光劑ECL，通過凝膠照相系統對蛋白進行曝光并進行數據分析。

1.6" Fe2+和脂質過氧化物LPO熒光檢測

將MDBK細胞接種至鋪有細胞爬片的24孔板中培養至24 h后，接種BVDV（MOI=5），培養至48h后，吸出培養基，用PBS洗3遍。分別加入Fe2+熒光探針FerroOrange工作液（終濃度1 μmol·L－1）和脂質過氧化物探針Liperfluo工作液（終濃度10 μmol·L－1），37℃培養箱中培養30 min，吸掉工作液，PBS洗2遍。加入4%多聚甲醛固定15 min。PBS洗3遍，加DAPI染色液室溫孵育15 min，PBS洗3遍，每次5 min。將片子取出，在載玻片上滴1滴防熒光淬滅劑，將玻璃片倒扣在載玻片上，標記，用熒光顯微鏡觀察記錄。

1.7" RNA提取和熒光定量PCR

將MDBK細胞接種至6孔板中，待細胞匯合度為60%～70%時，接種BVDV（MOI=5），接毒后繼續培養48 h。用TRIzol收獲各試驗組和對照組細胞并提取總RNA，用Nanodrop 2000測定RNA濃度，用EasyScript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix將總量為1 μg RNA反轉錄為cDNA。以此cDNA為模板進行熒光定量PCR檢測。采用TransStart Tip Green qPCR SuperMix進行qPCR檢測，每組設3個重復。反應體系如下：1 μL cDNA，上、下游引物各1 μL ，10 μL Tip Green qPCR SuperMix 和7 μL RNase free water共20μL。qPCR反應程序如下：94 ℃預變性30 s；94 ℃ 5 s，60 ℃ 30s，40個循環。分別檢測各組細胞樣本中BVDV Npro、IL-18、IL-1β和IFN-β基因轉錄水平，各基因引物序列見表1。以GAPDH為內參基因，2-△△Ct進行相對定量計算，每個樣品重復3次求平均值。

1.8" 透射電鏡

將MDBK細胞鋪于6 cm細胞皿中，待細胞匯合度為70%時感染BVDV（MOI=5），繼續培養至48 h，棄去培養基，PBS沖洗細胞3次，用細胞刮將細胞刮下，用1.5 mL離心管收集細胞后1 500 r·min－1離心10 min。細胞樣品具體處理步驟如下：將細胞沉淀用2.5%的戊二醛4 ℃固定48 h，棄掉戊二醛，使用PBS清洗細胞5次；1%鋨酸4 ℃固定2 h，用PBS清洗細胞5次；然后分別用不同濃度的乙醇進行脫水，最后用100%的丙酮脫水2次，每次30 min；滲透依次用Epon812環氧樹脂∶丙酮=1∶3處理2 h，環氧樹脂∶丙酮=1∶1處理5 h，環氧樹脂∶丙酮=3∶1處理12 h，環氧樹脂滲透2次，每次24 h；之后依次放入30℃烘箱24 h，60℃烘箱24 h進行包埋；使用超薄切片機切片，設好切片厚度（50～60 nm），醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛進行染色10 min；雙蒸水沖洗染色液，用濾紙吸干存放在樣品夾中，使用HT7700型透射電鏡觀察制備好的樣品超薄切片并獲取圖像。

1.9" 數據處理與統計

每個試驗重復3次，所有數據均采用t檢驗進行統計分析，數據用“x±s”表示，“*”表示差異顯著（Plt;0.05），“**”表示差異極顯著（Plt;0.01），“n.s.”表示差異不顯著。

2" 結" 果

2.1" BVDV感染MDBK細胞活率與線粒體形態變化

經測定病毒滴度為107.35TCID50/0.1 mL。將BVDV（MOI=5）感染MDBK細胞后48 h，同時設置未感染BVDV細胞為陰性對照組，用Erastin（10 μmol·L－1）處理組細胞為陽性對照組，進行臺盼藍染色通過顯微鏡觀察細胞的死亡率。結果顯示，與陰性對照組細胞相比，BVDV感染MDBK細胞后細胞死亡率極顯著上升（Plt;0.01），陽性對照鐵死亡誘導劑Erastin處理組細胞死亡率較對照組極顯著上升（Plt;0.01，圖1）。

通過透射電鏡觀察各組細胞線粒體的形態變化。結果發現，BVDV感染細胞線粒體與對照組相比，可見線粒體萎縮，平均表面積極顯著降低（Plt;0.01），線粒體膜密度增加，與陽性對照組（Erastin）一致（圖2）。提示BVDV感染MDBK細胞能誘導鐵死亡的發生。

2.2" BVDV感染MDBK細胞中鐵死亡特征變化

為進一步檢測BVDV感染細胞中鐵死亡發生特征，本研究檢測Fe2+、LPO以及丙二醛（malondialdehyde， MDA）的水平變化。本研究通過熒光法檢測BVDV感染引起的Fe2+熒光強度變化，發現BVDV感染細胞中Fe2+平均熒光強度相較于未感染對照細胞極顯著增加（Plt;0.01，圖3）。此外，可見BVDV感染細胞中LPO平均熒光強度相較于未感染的對照細胞極顯著增加（Plt;0.01，圖4）。MDA是細胞內脂質過氧化產物。為檢測BVDV感染細胞中MDA變化，使用MDA檢測試劑盒對細胞進行處理，用酶標儀在532nm測量吸光度。結果顯示，BVDV感染組較正常細胞組MDA含量極顯著增加（Plt;0.01，圖5）。綜上，結果表明BVDV感染MDBK細胞中脂質過氧化水平顯著升高，Fe2+含量增加，鐵死亡發生水平增加。

2.3" BVDV誘導鐵死亡對其復制水平的影響

為探究BVDV誘導鐵死亡對其復制水平的影響，本研究分別通過qPCR、Western blot和TCID50法檢測鐵死亡抑制劑Fer-1處理對BVDV感染細胞中病毒復制水平的影響。結果顯示，Fer-1預處理后BVDV感染不同時間BVDV+Fer-1組細胞中病毒復制水平較BVDV+DMSO組均顯著降低（圖6、7、8）。提示BVDV誘導鐵死亡對病毒復制水平具有促進作用。

2.4" BVDV誘導的鐵死亡對其感染細胞中炎性細胞因子表達的影響

為探究BVDV感染誘導鐵死亡對于細胞中炎性細胞因子表達的影響，本研究通過qPCR和Western blot法檢測BVDV感染MDBK細胞中IFN-β、IL-18、IL-1β的表達水平。結果顯示，在BVDV感染細胞中各炎性細胞因子的mRNA和蛋白質表達水平均較未感染組細胞顯著增加（Plt;0.01），而鐵死亡抑制劑Fer-1預處理的細胞在感染BVDV后各炎性細胞因子的mRNA和蛋白質表達水平較未處理感染組均顯著降低（Plt;0.01，圖9）。提示鐵死亡促進BVDV感染細胞中炎性細胞因子的表達。

3" 討" 論

BVDV屬于黃病毒科，瘟病毒屬，是一種小包膜單股正鏈RNA病毒，它具有三種不同的基因型：BVDV-1，BVDV-2，BVDV-3。根據其是否引起細胞病變可以分為致細胞病變型（CP）和非致細胞病變型（NCP）［12］。BVDV通過病毒糖蛋白E2與宿主細胞表面受體CD46進行特異性結合，從而促使病毒感染細胞［13-14］。在BVDV進入細胞并且感染復制后，病毒的結構蛋白和非結構蛋白與宿主蛋白分子發生相互作用，有利于病毒逃脫機體的免疫監視并在細胞內增殖［14］。目前，對于BVDV的致病機制雖然做了很多有價值的研究工作，但尚不十分明確。

鐵死亡是一種新型細胞死亡方式，其具有鐵離子依賴性，是細胞內脂質活性氧（ROS）生成與降解的平衡失調所致［15］。鐵死亡不同于細胞凋亡的形態學特征，鐵死亡細胞沒有傳統細胞凋亡時出現的現象，如細胞皺縮、染色質凝集、凋亡小體的形成、細胞骨架的解體等現象的發生。發生鐵死亡的細胞線粒體在透射電鏡下表現為體積縮小、線粒體膜密度增加和線粒體嵴減少或消失［15-16］。這與本研究中檢測到的BVDV感染MDBK細胞中線粒體形態變化一致。有研究發現，病毒蛋白和線粒體膜之間的相互作用促進了ROS的產生，并且越來越多的研究表明，增加的ROS水平有利于增強病毒的復制［17］。而Fe2+在氧化還原循環中，由于具有電子轉移的特性，使其在芬頓反應中可以與H2O2反應，產生羥基自由基（·OH）——活性氧（ROS）之一［18］。丙二醛 （MDA）則是細胞內脂質過氧化產物。故可以通過檢測Fe2+、LPO以及MDA的含量進一步檢測鐵死亡的發生以及探究鐵死亡對于BVDV復制水平的影響。Npro是BVDV 開放閱讀框（open reading frame，ORF）編碼的第一個蛋白，具有免疫抑制特性，可以協助BVDV逃避宿主的免疫監控。NS4B為BVDV非結構蛋白，會進一步幫助BVDV逃避宿主的固有免疫［19］。故可以通過檢測Npro和NS4B蛋白表達水平及病毒滴度來檢測鐵死亡對于BVDV復制水平的影響。本研究中BVDV感染可誘導上述Fe2+以及脂質體過氧化水平顯著增強，感染細胞中上述蛋白表達水平及病毒滴度顯著增強，明確了BVDV誘導宿主細胞發生鐵死亡，且鐵死亡的發生增強了BVDV的增殖水平。其它研究也表明，輪狀病毒（RV）可通過SLC7A11-AS1/xCT軸觸發鐵死亡并促進自身的復制［7］。本團隊后續將聚焦BVDV誘導鐵死亡發生的機制研究。

鐵死亡發生伴隨細胞損傷模式（DAMP）的釋放并促進炎性因子的表達分泌［20］。此外，鐵死亡還受與各種疾病相關的信號通路的調節［21］。例如在 A 型流感病毒（influenza A virus，IAV）與鐵死亡的研究中發現，IVA可能是通過激活HIF-1α/iNOS/VEGF 信號通路發揮作用，從而促進鐵死亡，促進炎性分子分泌［22］；H1N1病毒可以通過NRF2-KEAP1-GCLC信號通路和谷氨酰胺水解誘導hNECs鐵死亡導致鼻黏膜上皮炎癥［23］。本研究中BVDV誘導鐵死亡發生，同時可見宿主細胞中促炎性因子IL-18、IL-1β等表達水平升高，而鐵死亡特異性抑制劑Fer-1預處理的細胞在感染BVDV后各炎性細胞因子的mRNA和蛋白質表達水平均較未處理感染組顯著降低，提示鐵死亡發生可能是BVDV誘導促炎性因子表達升高的重要途徑。

4" 結" 論

BVDV感染可引起宿主細胞線粒體膜密度增加及表面積減少、Fe2+離子增加、LPO和MDA濃度增加最終誘導鐵死亡的發生，且鐵死亡發生可顯著促進病毒復制水平以及促炎性細胞因子表達。

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（編輯" 范子娟）