抗犬瘟熱病毒犬源化嵌合單鏈抗體scFv-Fc的制備與活性分析

摘" 要： 為減少和改善鼠源單克隆抗體在犬臨床治療中的異源性和功效，用RT-PCR方法從分泌抗犬瘟熱病毒（CDV）中和單克隆抗體的鼠源雜交瘤細胞中擴增抗體重鏈可變區（VH）和輕鏈可變區（VL），通過Linker將VH和VL連接獲得單鏈抗體（scFv）基因，選擇犬源抗體IgG B恒定區（Fc）連接到scFv的C末端獲得犬源化嵌合單鏈抗體（scFv-Fc）基因；分別構建鼠源scFv與犬源化scFv-Fc的原核表達載體，通過大腸桿菌表達、純化，用ELISA、IPMA、細胞融合抑制和中和試驗檢測表達抗體的特異性和中和活性。結果顯示：CDV鼠源scFv、犬源化scFv-Fc的ELISA最低檢出濃度分別為14.38和102.75 μg·mL-1；與表達的CDV H蛋白和CDV均發生特異性反應；能夠抑制CDV H和F蛋白介導的細胞膜融合，完全保護細胞不出現病變的最低濃度分別為0.72和0.64 μg·mL-1。本研究成功制備了鼠源scFv與犬源化scFv-Fc嵌合抗體，為犬瘟熱的臨床治療提供了候選抗體藥物。

關鍵詞： 犬瘟熱病毒；中和活性；單鏈抗體；嵌合抗體

中圖分類號：S852.43

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）12-5763-12

doi： 10.11843/j.issn.0366-6964.2024.12.038

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

收稿日期：2024-02-04

基金項目：國家重點研發計劃項目（2022YFD1800603）

作者簡介：劉雅坤（1998-），女，黑龍江雞東人，碩士生，主要從事獸醫病毒學與免疫學研究，E-mail：910386496@qq.com

*通信作者：趙建軍，主要從事獸醫微生物學與免疫學研究，E-mail：zhaojianjun@byau.edu.cn，Tel： 0459-6819194；畢振威，主要從事寵物用基因工程抗體研究，E-mail：bizhenwei@126.com，Tel： 025-84390339

Preparation and Activity Analysis of Canine Derived Chimeric Single Chain Antibody scFv-Fc against Canine Distemper Virus

LIU" Yakun1， BI" Zhenwei2，3*， XIA" Xingxia2，3， MO" Fei2，3， XU" Siyu2，3， QIAN" Jing2，3， TAN" Yeping2，3， ZHU" Yumei2，3， ZHAO" Jianjun1*

（1.College of Animal Science and Veterinary Medicine， Heilongjiang Bayi Agricultural University，

Daqing 163319，" China;

2.Institute of Veterinary Medicine， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014，" China;

3.GuoTai （Taizhou） Center of Technology Innovation for Veterinary Biologicals， Taizhou 225300，" China）

Abstract： To reduce and improve the heterogeneity and efficacy of mouse-derived monoclonal antibodies in clinical treatment of dogs， the variable region of heavy chain （VH） and variable region of light chain （VL） were amplified from mouse-derived hybridomas secreting monoclonal antibody against canine distemper virus （CDV） using RT-PCR， the single chain antibody （scFv） gene was obtained by linking VH and VL through Linker， and the canine-derived chimeric single chain antibody （scFv-Fc） gene was obtained by selecting the constant region （Fc） of canine IgG B to connect to the C-terminus of scFv; The prokaryotic expression vectors for expressing mouse-derived scFv and canine-derived scFv-Fc were respectively constructed， which were expressed in Escherichia coli for purification， and the specificity and neutralizing activity of the expressed antibodies were detected by ELISA， IPMA， cell fusion inhibition， and neutralization assay. The detection limit of ELISA for CDV mouse-derived scFv and canine-derived scFv-Fc are 14.38 and 102.75 μg·mL-1， respectively; Both of scFv and scFv-Fc specifically react with the expressed CDV H protein and CDV; The cell membrane fusion mediated by CDV H and F proteins can be inhibited by scFv and scFv-Fc， and the minimum concentrations of them for complete protection of cells from CPE formation are 0.72 and 0.64 μg·mL-1， respectively. The mouse-derived scFv and canine-derived chimeric antibody scFv-Fc are successfully developed， providing candidate antibody drugs for the clinical treatment of canine distemper.

Key words： canine distemper virus; neutralizing activity; single chain antibody; chimeric antibody

*Corresponding authors：" ZHAO Jianjun， E-mail： zhaojianjun@byau.edu.cn; BI Zhenwei， E-mail：bizhenwei@126.com

犬瘟熱病毒（canine distemper virus，CDV）屬于副黏病毒科（Paramyxoviridae family）、麻疹病毒屬（morbillivirus genus），自然感染宿主范圍非常廣泛，除了感染犬科、鼬科、貓科等食肉動物外，還感染嚙齒科、鹿科、豬科，而CDV感染靈長類（懸猴科和獼猴科）的案例引起了人們對犬瘟熱（canine distemper，CD）潛在人畜共患病風險的擔憂，但目前還沒有人類感染CD的病例［1-3］。CDV感染引起的CD是一種熱性、高度接觸性傳染病，以呼吸系統、消化系統、神經系統等多系統疾病為特征，主要表現為咳嗽、雙向熱、皮疹、腹瀉、不自主抽搐等癥狀［4-6］。該病在全球范圍內存在和流行，對毛皮動物養殖、犬類飼養以及野生動物保護都造成較嚴重危害和經濟損失。CDV新基因型的不斷出現、病毒變異以及生態環境改變等，給疫苗免疫預防為主的防控帶來挑戰［7-10］。

CD發病后的治療主要是抗病毒的特異性治療，輔以對癥治療［11-12］。抗體是治療CDV感染的有力工具，包括高免血清和單克隆抗體（monoclonal antibody，McAb）。目前臨床上CD發病犬用的McAb多為鼠源的，在犬體內半衰期短，而CD病程長，需要反復大量使用；但作為外源性蛋白，反復使用會引發犬的抗鼠抗體反應，導致嚴重副作用。此外，鼠源McAb在犬體內無法激活免疫效應功能，如抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用（antibody dependent cell mediated cytotoxicity，ADCC）、抗體依賴性細胞介導的吞噬作用（antibody dependent cellular phagocytosis，ADCP），以及補體依賴的細胞毒性作用（complement dependent cytotoxicity，CDC），限制了鼠源McAb在犬病治療中的應用。20世紀80年代以來，利用日益成熟的基因工程技術對鼠源性抗體進行人源化改造，制備了嵌合抗體、人源化抗體、全人源化抗體，對人的免疫原性不斷降低［13］。而小型化抗體、抗體偶聯藥物、雙特異性抗體等是目前研究的熱點和未來的主要發展方向。目前已有犬源化的抗NGF、IL-31抗體藥物上市，用于治療犬骨關節炎疼痛和犬異位性皮炎。對犬流感病毒、犬細小病毒單克隆抗體的犬源化改造也有文獻報道［14-15］，但尚未見CDV McAb的犬源化研究。

前期，我們成功制備了多株針對CDV的中和McAb［16-18］。本研究選擇分泌較高中和活性CDV McAb的鼠源雜交瘤細胞株G12，擴增小鼠抗體重鏈可變區（variable region of heavy chain，VH）和輕鏈可變區（light chain variable region，VL）基因，構建CDV特異性的單鏈抗體scFv，將其與犬IgG抗體Fc片段結合，構建犬源化嵌合單鏈抗體scFv-Fc，并分析其免疫學活性，為進一步臨床應用提供物質基礎。

1" 材料與方法

1.1" 試驗毒株、菌株及質粒

CDV 823毒株（GenBank注冊號：KU552082）由本實驗保存；大腸桿菌感受態細胞E. coli DH5α、E. coli BL21（DE3）、E. coli TSsetta（DE3）均購自擎科生物科技有限公司；原核表達質粒pET-28a（+）由本實驗室保存；CDV單克隆抗體雜交瘤細胞株G12由本實驗室制備［18］。

1.2" 主要試劑

Trizol（產品貨號：3070-100）購自北京天恩澤基因科技有限公司；質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒為Omega公司產品；ApexHF HS DNA聚合酶-CL（產品貨號：AG12204）購自湖南艾科瑞生物工程有限公司；2X Phanta Max Master Mix（Dye Plus）（產品貨號：P525-02）、ClonExpress II OneStep Cloning Kit（產品貨號：C112-02-AA）購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；Hifair Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（gDNA digester plus）（產品貨號：11141ES10）購自翌圣生物科技有限公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的小鼠抗His標簽單克隆抗體（產品貨號：AE028）為武漢愛博泰克生物科技有限公司產品；HRP標記羊抗小鼠IgG、HRP標記兔抗犬IgG（H+L）（產品貨號：BF03011），為北京博奧龍免疫技術有限公司產品；單組分TMB顯色液（產品貨號：TMB-S-001）購自湖州英創生物科技有限公司；DMEM培養基、胎牛血清（FBS）購自美國Gibco公司；AEC顯色液（產品貨號：BF06076-20）購自蘇州博奧龍科技有限公司。

1.3" 鼠源單抗可變區基因的克隆與鑒定

參照文獻［19］設計用于擴增小鼠抗體輕鏈、重鏈可變區基因的引物VH-F/R和VL-F/R（表1）。按TRizol法提取雜交瘤細胞G12的總RNA，根據反轉錄試劑盒說明書，用Random primers/Oligo（dT）18進行反轉錄（RT），以其cDNA為模板，使用VH-F/R和VL-F/R引物分別擴增VH與VL基因，擴增VH基因PCR反應體系的組成：模板2 μL，引物各1 μL，ApexHF HS DNA Polymerase CL 1 μL，2X ApexHF CL Buffer 25 μL，用去離子水補至50 μL；PCR反應條件：94℃預變性60 s，98℃變性10 s，56℃退火15 s，68℃延伸60 s，經過35個循環，最后于68℃延伸7 min。擴增VL基因PCR反應體系的組成：模板1 μL，引物各2 μL，2X Phanta Max Master Mix 25 μl，用去離子水補至50 μL，PCR反應條件：95℃預變性3 min，95℃變性15 s，56℃退火15 s，72℃延伸30 s，經過35個循環，最后于72℃延伸5 min。將回收的VH和VL片段各取5 μL，分別加至5 μL Premix Taq（TaKaRa Taq Version 2.0）中，72℃作用10 min，添加A尾后，分別連接至pMD18 T載體，連接體系的組成為：模板4.5 μL，pMD18T載體0.5 μL，Solution Ι 5 μL，連接過夜后轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，挑取單菌落，進行PCR鑒定。將PCR陽性菌送至擎科生物科技有限公司測序，以確定抗體可變區基因序列，提取的質粒分別命名為pMD18T-G12-VH和pMD18T-G12-VL。

1.4" scFv和scFv-Fc原核表達載體的構建

根據獲得的小鼠抗體輕鏈可變區序列VL，設計引物G12-Linker-VL-F/G12-VL-R（表1），并在引物5'端引入Hind Ⅲ和Xho Ⅰ酶切位點，以pMD18T-G12-VL質粒為模板，用PCR方法擴增上游含有Linker（Gly4Ser）3的G12-VL片段，回收目的片段，將pET-28a（+）載體用Hind Ⅲ和Xho Ⅰ進行雙酶切，回收線性載體；將回收的目的片段和載體用T4連接酶連接，轉化E. coli DH5α感受態細胞，挑取單菌落，進行PCR和測序鑒定，提取陽性質粒命名為pET28a-Linker-VL。

根據獲得的小鼠抗體重鏈可變區序列VH，設計引物G12-VH-F/G12-VH-R（表1），并在引物5′端引入EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ酶切位點，以pMD18T-G12-VH質粒為模板，用PCR方法擴增G12-VH 基因片段，回收目的片段，pET28a-Linker-VL用EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ進行雙酶切，回收線性載體；將回收的目的片段和載體用T4連接酶連接，轉化E.coli DH5α感受態細胞，挑取單菌落，進行PCR和測序鑒定，提取陽性質粒命名為pET28a-VH-Linker-VL（pET28a-scFv）。

根據犬IgG-B類（GenBank注冊號：AF354265）重鏈恒定區CH1-CH3設計引物dogCH-F/dogCH-R，并在引物5'端添加同源臂（表1）。以pUC57-犬IgG-B質粒為模板，用PCR方法擴增帶有同源臂的犬IgG Fc片段；將pET28a-VH-Linker-VL（pET28a-scFv）用Xho Ⅰ單酶切并膠回收，用同源重組酶將回收的目的片段和載體進行連接，轉化E.coli DH5α感受態細胞，挑取單菌落，進行PCR和測序鑒定，提取陽性質粒命名為pET28a-VH-Linker-VL-犬Fc（pET28a-scFv-Fc）。

1.5" scFv與scFv-Fc的原核表達及鑒定

將pET28a-scFv、pET28a-scFv-Fc分別轉化E. coli BL21（DE3）、E. coli TSsetta（DE3）感受態細胞，同步設立pET-28a（+）空載體轉化菌為對照組，轉化菌涂到含有卡那抗性的LB固體培養基中，過夜培養，挑取單菌落進行鑒定；將陽性菌接種至含卡那抗性的LB培養基中于37℃溫箱以200 r·min-1轉速培養2～3 h后，按1∶100的比例接種到含有卡那抗性的LB培養基中，37℃溫箱以200 r·min-1轉速培養，待菌液OD600 nm為0.6～0.8時，加IPTG至終濃度為1 mmol·L-1，37℃、200 r·min-1誘導3～5 h。收集菌液，4℃ 以10 000 r·min-1離心10min，取菌體沉淀用1/10表達體系體積的PBS緩沖液重懸，超聲破碎，4℃、10 000 r·min-1離心10 min后保留上清液，包涵體用8mol·L-1尿素溶解過夜。分別取菌體、上清液以及包涵體，加5×SDS上樣緩沖液，沸水煮10 min后，進行SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍顯色，同時進行Western blot，用HRP-小鼠抗His抗體（1∶2 000稀釋）和HRP-兔抗犬IgG抗體（1∶5 000稀釋）檢測scFv、scFv-Fc抗體的表達情況。

1.6" ELISA檢測方法

將純化的CDV全病毒以5 μg·mL-1包被ELISA板條，每孔100μl，4℃過夜，用PBST（含0.05%吐溫-20的PBS）洗3遍，拍干；加入10%小牛血清的PBST進行封閉，每孔200 μL，37℃作用2 h，用PBST洗3遍，拍干；將scFv、scFv-Fc和G12抗體分別進行2倍倍比稀釋，每孔100 μL加入到ELISA板中，37℃作用1 h，用PBST洗3遍，拍干；scFv孔加入HRP-小鼠抗His抗體（1∶2 000稀釋），scFv-Fc孔加入HRP-兔抗犬IgG抗體（1∶5 000稀釋），G12孔加入HRP標記的羊抗小鼠IgG（1∶1 000稀釋），37 ℃作用1 h，用PBST洗3遍，拍干；經TMB顯色以2 mol·L-1H2SO4終止反應后，用酶標儀讀取OD450 nm值，同步設立空載體轉化菌超聲破碎上清液作為空白對照。繪制抗體OD450 nm值與抗體濃度的曲線圖，分析間接ELISA方法檢測表達抗體的反應性和最小檢出濃度。

1.7" 免疫過氧化物酶單層細胞試驗（immunoperoxidase monolayer assay， IPMA）

將24孔板中轉染CDV H真核表達質粒的293T細胞，或接種CDV 823毒株的Vero細胞，棄去培養液，用PBS洗1遍。用預冷的無水乙醇固定，每孔300 μL，4℃作用30 min，棄去固定液，PBS洗3遍，最后一遍拍干；加入scFv、scFv-Fc、G12抗體，每孔300 μL，37℃溫箱孵育1 h，PBS洗3次，拍干；scFv孔加入HRP-小鼠抗His抗體（1∶2 000稀釋），scFv-Fc孔加入HRP-兔抗犬IgG抗體（1∶5 000稀釋），G12孔加入HRP標記的羊抗小鼠IgG（1∶1 000稀釋），每孔200 μL，37℃溫箱孵育1 h，PBS洗3次，每孔加入200 μL的AEC顯色液，室溫顯色30 min，用雙蒸水終止顯色，置于光學顯微鏡觀察，判定結果。

1.8" 細胞融合試驗

將生長狀態良好的293T細胞鋪到24孔細胞板中，待細胞密度為80%左右時，按照轉染試劑說明書進行轉染。具體為：每孔按pCA-H質粒（0.2 μg）、pCA-F質粒（0.2 μg），pCA-dogSLAM（0.2 μg）加入50 μL jetPRIME buffer中混合均勻；然后每孔加入1.8 μL的jetPRIME脂質體，混勻后靜置15 min，然后將混合物均勻滴加到細胞孔中，置37℃溫箱，繼續培養，同時設置正常293T細胞對照以及共轉染pCA-H和pCA-F質粒293T細胞對照。在轉染6 h后，更新上清液，分別加入2D9、G12、scfv、scFv-Fc（終濃度均為100 ng·μL-1），24 h后，在顯微鏡下觀察細胞融合情況。

1.9" 病毒中和試驗

采用細胞中和試驗測定scFv與scFv-Fc抗體的中和活性。將Vero細胞消化后，鋪于96孔細胞板中。用DMEM培養基對scFv和scFv-Fc進行2倍倍比稀釋，每個稀釋度設4個重復，將已稀釋好的不同稀釋度的抗體分別與等體積的CDV病毒液（200TCID50）混合均勻，37℃作用2 h，使抗原、抗體充分反應。然后將抗原、抗體混合液加入至Vero細胞孔，同步設置病毒陽性對照和正常細胞對照，37℃、5% CO2溫箱培養，逐日觀察細胞病變（CPE）情況。

2" 結" 果

2.1" 鼠源抗體可變區的擴增和測序

提取分泌單克隆抗體G12的鼠源雜交瘤細胞株的總RNA，并反轉錄成cDNA。以獲得的cDNA為模板，用小鼠抗體VH-F/R和VL-F/R引物分別進行PCR擴增，獲得的VH基因、VL基因均在250～500 bp范圍之內，與理論值相符（圖1 A、B）。將目的基因連接到T載體，挑取陽性克隆菌進行測序，獲得G12鼠源單克隆抗體VH和VL的序列信息，并在抗體可變區分析網站（http：//www.vbase2.org/）進行分析，結果VH和VL均存在CDR1、CDR2和CDR3高變區以及FR1、FR2、FR3和FR4骨架區，符合小鼠抗體重鏈和輕鏈可變區序列特征。

2.2" scFv與scFv-Fc抗體原核表達的鑒定及純化

將構建的scFv和scFv-Fc原核表達質粒分別轉化到E. coli BL21（DE3）、E. coli TSsetta（DE3），用IPTG誘導表達，菌體蛋白進行SDS-PAGE分析，結果顯示，與空載體轉化菌相比，表達的scFv和scFv-Fc抗體的分子量分別為33和66 ku，與預期相符合，如圖2A、3A所示；Western blot分析顯示，表達的scFv與HRP-抗His標簽的鼠抗體發生特異性反應，而scFv-Fc抗體與HRP-兔抗犬IgG抗體發生特異性反應，如圖2B、3B所示。以上結果表明，scFv和scFv-Fc抗體成功表達。用IPTG誘導表達的重組菌進行超聲破碎，離心后分離上清和沉淀，SDS-PAGE分析顯示，scFv和scFv-Fc抗體主要存在于沉淀中，表明主要以包涵體的形式表達（圖2A、3C）。將獲得的scFv和scFv-Fc包涵體經尿素梯度透析法純化，SDS-PAGE分析顯示，scFv和scFv-Fc抗體純化效果良好，如圖2C、3D所示。

2.3" scFv與scFv-Fc抗體的ELISA檢測

用純化的CDV抗原作為包被抗原，用間接ELISA測定純化的G12、scFv和scFv-Fc抗體的反應性，同時以超聲破碎的pET-28a（+）/BL21（DE3）上清作為對照。純化的G12、scFv和scFv-Fc抗體的初濃度分別為0.75、0.23、0.21 mg·mL-1，經2倍倍比稀釋成不同的梯度進行檢測，結果顯示，G12、scFv和scFv-Fc被檢測出的最低濃度分別為11.72、14.38和102.75 μg·mL-1（圖4），表明G12、scFv和scFv-Fc抗體與CDV具有良好的特異性。

2.4" scFv與scFv-Fc抗體的特異性鑒定

293T細胞轉染pCA-CDV-H真核表達質粒，48 h后將細胞固定；或Vero細胞接種CDV，48 h病變后，將細胞固定，同步設立正常細胞作為對照；分別加入純化的G12、scFv和scFv-Fc作用為一抗，G12孔加入HRP-標記的羊抗鼠IgG、scFv孔加入HRP-鼠抗His抗體，scFv-Fc孔加入HRP-兔抗犬IgG抗體作用為二抗，用AEC顯色液進行顯色。結果顯示，與G12相同，轉染H蛋白的293T細胞孔在加入scFv、scFv-Fc抗體后均呈現紅色，未轉染的293T細胞無特異性著色反應（圖5 A）；而接種CDV的Vero細胞孔在加入scFv、scFv-Fc抗體后均呈現紅色，未接種CDV的Vero細胞無特異性著色反應（圖5 B），表明，scFv、scFv-Fc均能夠與CDV H蛋白和CDV病毒發生特異性反應。

2.5" scFv與scFv-Fc抗體對H/F介導的膜融合的影響

SLAM是CDV感染宿主的主要受體，而CDV H/F誘導細胞融合依賴于SLAM受體［20］。將SLAM或空載體與CDV 823毒株H和F蛋白共轉染293T細胞，轉染6 h后，分別加入G12、scFv和scFv-Fc，同時加入具有抑制H/F介導膜融合作用的單克隆抗體2D9［21］作為陽性對照，24 h后，在倒置顯微鏡下觀察細胞融合情況。結果顯示，H/F共表達不能誘導293T細胞形成合胞體，但在過表達SLAM受體的293T細胞中，H/F共表達可觀察到合胞體的形成（圖6A）。與未加抗體的SLAM/H/F共轉染293T細胞孔相比，加入G12、scFv和scFv-Fc以及陽性對照2D9的細胞孔均未觀察到明顯的細胞融合現象（圖6A、B），表明，G12、scFv和scFv-Fc能夠抑制H/F介導的細胞膜融合。

2.6" scFv與scFv-Fc抗體的中和活性

采用細胞中和試驗測定scFv與scFv-Fc抗體對CDV的中和活性，并與單克隆抗體G12進行比較。結果顯示，接種CDV 823株的Vero細胞出現明顯的細胞病變，而未接毒的Vero細胞形態正常，scFv與scFv-Fc完全保護Vero細胞不出現明顯病變的最低濃度分別為0.72和0.64 μg·mL-1，而G12完全保護細胞不出現明顯病變的最低濃度為0.26 μg·mL-1。

3" 討" 論

CD是危害包括寵物犬在內的許多動物的重要傳染病之一。以疫苗為主的預防措施大大降低了該病的發生。但CDV病毒變異、新基因型的不斷出現以及生態環境改變等，給疫苗免疫預防為主的防控帶來挑戰，疫苗并不能提供完全的免疫保護［7-10］。近年來寵物產業迅猛發展，寵物犬與人的關系非常密切，成為家庭成員，在人類生活中的角色越來越重要。寵物犬一旦發生CD，需要進行積極有效地治療。因此，制備高效、安全的抗體藥物用于治療CD非常必要。傳統的鼠源單克隆抗體對于犬來說是異源蛋白，易引發過敏反應，難以反復重復使用。犬源化基因工程抗體研制是目前的研究現狀和未來的發展趨勢。

人源化基因工程抗體研究起步早，發展較為成熟，主要通過人轉基因小鼠雜交瘤融合技術、抗體噬菌體展示和特異性B細胞測序制備全人源單克隆抗體［22-23］。但是，犬源化單克隆抗體近幾年剛起步，研究較晚。目前已經有犬源化抗NGF、IL-31抗體藥物上市，用于治療犬骨關節炎疼痛和犬特異性皮炎。在犬細小病毒病治療方面，已有犬源化的犬細小病毒單克隆抗體可用。這些抗體是鼠源單克隆抗體的可變區犬IgG恒定區構建的嵌合抗體。前期，我們制備了多株抗CDV中和抗體的鼠源雜交瘤細胞株，本研究從雜交瘤細胞G12株中提取總RNA，將其反轉錄為cDNA，通過PCR擴增出抗體的輕鏈可變區（VL）和重鏈可變區（VH）基因。Luo等［24］的研究表明，單鏈抗體重鏈可變區（VH）和輕鏈可變區（VL）連接順序的不同在一定程度上可影響它的表達量和活性。與VL-VH相比，VH-VL的表達量相對較低，但其對抗原的親和力更強。因此，本研究選擇常用的15肽［（Gly4Ser）3］［19，25］，將鼠源單克隆抗體的可變區以VH-VL方式連接，構建單鏈抗體，進行原核表達、純化和鑒定。結果顯示，表達的scFv主要為包涵體，經純化后的scFv顯示良好的特異性和中和活性，表明獲得的抗體可變區序列正確。最近研究報道，P17標簽的33個殘基肽能將大腸桿菌SHuffle菌株中產生的多個scFv的溶解度提高了11.6倍［26］，為我們后期單鏈抗體的表達優化提供了一種思路和策略。

單鏈抗體（single chain Fv，scFv）是具有抗體活性的最小功能結構單位，與傳統抗體相比，具有分子量小（僅為完整抗體的1/6）、穿透力強、靶向性好、免疫源性低、可在原核細胞系統表達，便于體外大規模生產的能力以及易于進行基因工程操作等特點。近年來已在生物學、醫學領域、實驗室研究及疾病的診治方面顯示出良好潛在的應用價值［27-30］。scFv抗體與酶或報告蛋白融合表達的方式可以制備高靈敏度的單分子檢測試劑，具有放大微弱信號的能力，提高敏感性，其特異性也超出了傳統抗體技術［31］。本研究制備的scFv抗體與多克隆和單克隆抗體相比，在特異性和敏感性上可能具有優勢，有望為CD診斷提供更強大和靈活的工具。CDV侵入大腦引起神經癥狀。傳統的單克隆抗體分子太大，不易穿過血腦屏障（blood brain barrier，BBB），單鏈抗體分子量小，穿透性強，提供更好的組織滲透/生物利用度，更容易進入血腦屏障發揮作用；scFv與抗病毒藥物相連可增強對CDV的靶向性；體外scFv連接到T細胞上，構建成嵌合抗原受體T細胞，增強T細胞對CDV的靶向殺傷作用。本研究制備的scFv為以上CD治療策略的實施和應用提供生物材料和奠定基礎。

scFv與抗體恒定區（Fc）相連，既可減少scFv功能單一、穩定性較差、體內清除過快等不足，又能利用抗體Fc的生物學功能，如ADCC、ADCP、CDC。根據抗體藥物的靶點和作用機制不同，對Fc效應功能的需求和選擇也不同。靶向T細胞PD-1分子的單克隆抗體抗腫瘤藥物設計要避免Fc介導的ADCC效應對T細胞的殺傷作用，而抗病毒抗體需要依賴Fc介導的效應功能對受感染靶細胞進行殺傷和清除，特別是針對中和能力差或缺乏的抗體，Fc效應功能顯得尤為重要。另外，新生兒Fc受體（neonatal Fc receptor，FcRn）可以和IgG的Fc結合，阻止IgG分子被溶酶體裂解，起到延長IgG體內半衰期的作用［32-33］。本研究制備抗CDV的犬源化基因工程抗體，犬IgG抗體的Fc功能至關重要。犬IgG分為A類、B類、C類和D類，其中C類是唯一不與犬FcRn結合的類型，因此，相對于其它三個亞類，IgG C類在體內的半衰期可能較短；IgG B類和C類與犬FcγR I受體、FcγR III受體的結合能力最強，與補體蛋白C1q的結合能力也最強，而IgG A類的結合活性較弱［34］。因此，本研究將scFv與犬IgG B類抗體重鏈恒定區相連構建抗CDV犬源化嵌合單鏈抗體scFV-Fc，既能減少scFv對犬的異源性，又能發揮IgG-B類Fc介導的ADCC等免疫學功能，以及延長scFv在體內的半衰期。試驗結果表明，構建的scFv-Fc仍然具有良好的CDV特異性和病毒中和能力。

4" 結" 論

本研究從雜交瘤細胞G12株中擴增鼠源抗體可變區，制備了抗CDV的scFv和犬源化嵌合單鏈抗體scFv-Fc，具有良好的CDV特異性和病毒中和活性，有望避免鼠源單克隆抗體的缺陷，提高CD發病犬的治療效果。

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（編輯" 白永平）