貓杯狀病毒VP1蛋白的單克隆抗體制備及抗原表位鑒定

摘" 要： 本研究旨在制備并鑒定針對貓杯狀病毒（feline calicivirus，FCV）VP1蛋白的單克隆抗體（monoclonal antibodies，mAbs）。本研究使用SH14株FCV全病毒作為免疫原，通過腹腔注射法免疫BALB/c小鼠，制備了針對VP1蛋白的mAb。通過ELISA篩選，成功獲得特異性單克隆抗體3A3C1株。對3A3C1株mAb進行了全面的生物學特性鑒定，3A3C1株mAb確認為IgG1型，輕鏈為κ鏈。Western blot和間接免疫熒光檢測的結果顯示，3A3C1株mAb能特異性地識別并結合FCV SH14株、F9株和GZ22。此外，本研究還深入探究了3A3C1株mAb的線性抗原表位。通過分段表達VP1蛋白并進行詳細的Western blot分析，最終確定3A3C1株mAb的線性抗原表位位于VP1蛋白的426PSRLTPAGDYAITSG440區域。本研究制備的3A3C1株mAb不僅是理解FCV免疫學特性的重要工具，也對發展FCV診斷方法和疫苗策略具有潛在應用價值。

關鍵詞： 貓杯狀病毒；單克隆抗體；抗原表位；衣殼蛋白

中圖分類號： S852.659.6

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）12-5784-08

doi： 10.11843/j.issn.0366-6964.2024.12.040

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

收稿日期：2024-01-23

基金項目：上海市自然科學基金（23ZR1477100）；中央級公益性科研院所基本科研業務費專項資金項目（2023JB05）

作者簡介：張澤宇（1998-），男，山東德州人，碩士生，主要從事預防獸醫學研究，E-mail： zhangzeyu0421@163.com

*通信作者：孟春春，主要從事貓科動物病毒發病機制研究，E-mail：mengcc@shvri.ac.cn；張" 偉，主要從事動物寄生蟲病及防治，E-mail：zw2017xjau@163.com

Preparation of Monoclonal Antibodies against Feline Calicivirus VP1 Protein and Identification of Antigenic Epitopes

ZHANG" Zeyu1， DONG" Ningning1， TAN" Xiaomei2， LI" Chuanfeng2， ZHU" Jie2， LIU" Guangqing2，

ZHANG" Wei1*， MENG" Chunchun1，2*

（1.College of Veterinary Medicine， Xinjiang Agricultural University， Urumqi 830000， China;

2.Team for Companion Animal Biosafety and Prevention Technology， Shanghai Veterinary Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Shanghai 200241，" China）

Abstract：" The purpose of this study was to prepare and identify monoclonal antibodies （mAbs） against the VP1 protein of feline calicivirus （FCV） strain SH14. In this study， the whole virus of the SH14 strain of FCV was used as an immunogen to immunize BALB/c mice through intraperitoneal injection， and mAbs against the VP1 protein were prepared. Through ELISA screening， a specific monoclonal antibody clone， 3A3C1， was successfully obtained. A comprehensive biological characterization of the 3A3C1 clone mAb was conducted， confirming it as an IgG1 type with a κ light chain. The results of Western blot and immunofluorescence assay （IFA） showed that the 3A3C1 clone mAb could specifically recognize and bind to FCV strains SH14， F9， and GZ22. In addition， this study further explored the linear antigenic epitope of the 3A3C1 clone mAb. By segmentally expressing the VP1 protein and conducting detailed Western blot analysis， the linear antigenic epitope of the 3A3C1 clone mAb was finally determined to be located in the426PSRLTPAGDYAITSG440 region of the VP1 protein. The 3A3C1 clone mAb prepared in this study is not only an important tool for understanding the immunological characteristics of FCV but also has potential applications in developing FCV diagnostic methods and vaccine strategies.

Key words： feline calicivirus; monoclonal antibody; antigenic epitope; capsid protein

*Corresponding authors：" MENG Chunchun， E-mail：mengcc@shvri.ac.cn;ZHANG" Wei，E-mail：zw2017xjau@163.com

貓杯狀病毒（feline calicivirus，FCV）是一種引起貓科動物傳染性疾病的重要病原體，其感染可導致口腔潰瘍、上呼吸道疾病和慢性胃腸炎等臨床癥狀［1］。FCV屬于嵌杯病毒科（Calicivirdae）的水皰性病毒屬（Vesivirus），無囊膜，基因組為單股正鏈RNA。該病毒在全球范圍內廣泛流行，對家貓及其他貓科動物的健康構成嚴重威脅［2］。尤其是在一歲以內的幼貓中，FCV感染的發病率和死亡率較高，死亡率高達67%［3］。

FCV的衣殼蛋白VP1是研究其病原性和開發診斷工具的關鍵分子［4］。VP1蛋白是病毒的主要結構蛋白，也是病毒與宿主細胞相互作用的主要場所。研究表明，FCV的VP1蛋白對病毒的生物學特性具有重要影響［5］。VP1蛋白由A～F 6個區域組成，每個區域都具有其獨特的功能和特性［6］。A區位于蛋白的氨基末端，是高度保守的區域，在衣殼蛋白成熟過程中，A區通常被裂解。B區含有肉豆蔻化甘氨酸和ATP/GTP結合位點，是病毒核心結構的一部分［7］。C區為一短的高變序列，與病毒的變異性有關。D區是另一個高度保守的區域。E區是中和性單克隆抗體（monoclonal antibody，mAb）的結合位點［8］，是另一個高變區。而F區位于衣殼蛋白的高度保守羧基端，是非中和mAb的結合位點［9］。因此，制備針對VP1蛋白的單克隆抗體（mAbs）不僅對研究FCV的生物學特性至關重要，也對診斷工具和疫苗策略的發展具有直接應用價值［10］。

本研究旨在制備針對FCV VP1蛋白的單克隆抗體，并對其抗原表位進行鑒定。本研究使用實驗室保存的SH14株FCV作為免疫原，通過全病毒免疫BALB/c小鼠，再通過酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）篩選法成功制備特異性抗VP1蛋白的單克隆抗體。本研究的工作為深入理解FCV的免疫學特性和發展新的診療方法奠定了基礎。此外，本研究獲得的單克隆抗體為進一步FCV研究提供了重要工具，特別是在檢測方法和疫苗開發方面。

1" 材料與方法

1.1" 材料及實驗動物

本研究所使用的細胞系和病毒株包括貓腎細胞系（CRFK）、人胚胎腎細胞系（293T），以及FCV毒株SJ14、XA20、SH14、F9和GZ22，質粒pCMV-3*Flag-14、pCold-SUMO，截短VP1蛋白（330-668 aa）及其表達質粒，均由中國農業科學院上海獸醫研究所伴侶動物生物安全風險預警及防控技術團隊保存。試劑和材料包括完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑、PEG SOLUTION 50%、辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG（IgG-HRP）、山羊抗小鼠IgG-FITC、anti-His tag mAb、紅外熒光標記的山羊抗小鼠IgG（IgG-RBITC）、山羊抗貓IgG（H+L）-HRP、蛋白Marker、IgG抗體亞類鑒定試劑盒等，分別購自Sigma公司、QIAGEN公司、Beyotime公司、Jackson Immuno Research公司和Southern Biotech公司。實驗動物為6～8周齡的雌性SPF BALB/c小鼠，購自上海杰思捷實驗動物有限公司。

1.2" 雜交瘤細胞的制備

1.2.1" 病毒純化

將FCV毒株SH14使用蔗糖梯度離心純化方法進行純化，純化后添加β-丙內酯至終濃度為0.025%，使病毒滅活作為免疫原。

1.2.2" 小鼠免疫

首次免疫時，將純化的SH14與等量完全弗氏佐劑混合，每只小鼠腹腔注射含100 μg病毒的共200 μL混合物。首免2及4周后，分別采用等量FCV全病毒與不完全弗氏佐劑進行加強免疫。加強免疫后1周，眼球采血，采用間接ELISA法測定血清中針對FCV VP1（330-668 aa）蛋白的抗體效價［11］。

1.2.3" 細胞融合

選擇針對截短VP1（330-668 aa）蛋白血清抗體效價最高的小鼠進行細胞融合試驗。增強免疫后，收集小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞按比例混合，以PEG1000為融合促進劑進行細胞融合。

1.2.4" 陽性雜交瘤細胞的篩選與克隆純化

培養14 d后，采用ELISA技術篩選能持續產生針對FCV VP1（330-668 aa）蛋白特異性抗體的陽性雜交瘤克隆。對陽性克隆進行有限稀釋培養，直至獲得一株穩定分泌針對VP1蛋白（330-668 aa）特異性單克隆抗體的細胞株。

1.2.5" 腹水制備及純化

BALB/c雌鼠腹腔注射0.5 mL液體石蠟，1周后注入約2×106對數生長期單克隆細胞株。待小鼠腹部明顯膨大，抽取腹水，10 000 r·min-1離心10 min收集上清，采用硫酸銨沉淀法純化抗體。

1.3" 單克隆抗體的鑒定

1.3.1" 亞型鑒定

用商業免疫球蛋白亞型鑒定試劑盒，通過ELISA法對從腹水中提取的單克隆抗體進行亞型分類，確定其免疫球蛋白的亞型［12］。

1.3.2" 間接免疫熒光（IFA）鑒定

以FCV SH14、GZ22、F9株感染的貓腎細胞系（CRFK）為靶細胞，用腹水作為一抗，FITC標記的山羊抗小鼠IgG作為二抗，用熒光顯微鏡觀察特異性結合情況。

1.3.3" Western blot分析

將FCV SH14、F9、GZ22、SJ14、XA14株分別感染CRFK細胞，16、24 h收集細胞，用Ripa裂解液裂解，進行SDS-PAGE及轉膜。采用腹水為一抗，山羊抗小鼠IgG-RBITC為二抗，通過Western blot分析檢測抗體與不同FCV株VP1蛋白的反應性。

1.3.4" 中和活性測定

將200 TCID50病毒與等體積不同稀釋度（1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64）腹水混合，37 ℃孵育1 h促進病毒-抗體結合。每種混合物接種CRFK細胞96孔板（200 μL·孔-1，8次重復），設未感染對照組。37℃、5%CO2條件下培養72 h，觀察細胞病變（CPE），據此計算單克隆抗體（mAb）中和效價。

1.4 "抗原表位的鑒定

1.4.1" VP1蛋白區域劃分與真核表達

FCV VP1蛋白A區于感染過程中被切除，故研究重點為其他區域：126-426 aa（B、C、D區）和426-668 aa（E、F區）。構建真核表達質粒pCMV-3Flag-14-VP1（126-426 aa）、pCMV-3Flag-14-VP1（426-668 aa）和pCMV-3*Flag-14-VP1全長，分別轉染293T細胞。采用Ripa裂解細胞，提取蛋白樣品，Western blot初步確定陽性區域［13］。

1.4.2" 抗原區域的細化與原核表達

依據Western blot初步結果，采用3對引物（表1）將陽性區域分為4個片段，克隆入pCold-SUMO原核表達載體表達蛋白。收集蛋白樣品，Western blot分析進一步確定抗體抗原表位。

1.4.3" 抗原表位的精確鑒定

基于 “1.4.2” 中Western blot結果，設計3對引物（表1）將陽性區域分為4段，克隆入pCold-SUMO載體進行原核表達。收集蛋白樣本，Western blot分析，最終將抗體抗原表位限定于15個氨基酸內。

2" 結" 果

2.1" mAb亞類鑒定

通過3次克隆純化，本研究獲得了一株能夠穩定分泌針對VP1截短蛋白的mAb的雜交瘤細胞株，命名為3A3C1。經過亞型鑒定，該mAb屬于IgG1型，輕鏈為κ鏈。

2.2" mAb Western blot、IFA及中和活性鑒定

Western blot結果顯示，mAb 3A3C1能夠與SJ14、XA20、SH14、F9、GZ22 5株FCV的VP1蛋白發生特異性結合（圖1A），選取具有代表性的F9（經典疫苗株）、SH14（Ⅰ型流行毒株）、GZ22（Ⅱ型流行毒株）進行二次Western blot驗證，其結合強度隨著病毒感染時間的延長而增強（圖1B～D）。IFA結果顯示，3A3C1株mAb作為一抗分別與F9、SH14、GZ22感染的CRFK細胞反應后出現了特異性的綠色熒光信號，陰性對照組無任何熒光（圖2）。中和試驗結果顯示，mAb 3A3C1原液亦不能夠中和SH14株的感染，表明該mAb沒有中和活性。綜上所述，本研究制備的mAb 3A3C1可以特異性地識別多種基因型的FCV毒株感染后的細胞樣品，適用于FCV的檢測。

2.3" 3A3C1株mAb線性抗原表位的精確鑒定

將VP1蛋白全長序列劃分為VP1-126-426 aa和VP1-426-668 aa兩個主要區域（圖3A）。這兩個片段在真核表達系統中表達后，經Western blot鑒定，發現3A3C1株mAb僅與426-668 aa片段特異性結合（圖3B）。根據VP1-426-668 aa序列將其分為P1、P2和P3 3個小片段（圖3C）。P1、P2和P3片段經原核表達系統表達后，通過Western blot方法鑒定，顯示3A3C1株mAb特異性地與P1片段反應，故而將潛在抗原表位縮減至426-486 aa區間（圖3D）。為進一步精確定位，根據VP1-426-486 aa序列，將其劃分為P4、P5和P6 3個部分（圖3E）。P4、P5和P6經原核表達并進行Western blot分析后，結果表明3A3C1 mAb僅與P4片段反應（圖3F），表明3A3C1 mAb識別VP1蛋白序列426PSRLTPAGDYAITSG440。使用ChimeraX軟件對該表位在VP1蛋白三聚體上的位置進行定位，結果發現該抗原表位位于VP1三聚體結構的頂端，即病毒粒子的表面（圖4）。選取國內外共計185株FCV的 VP1對應位置氨基酸序列進行比對，通過Weblogo3網站制作426-440 aa的Weblogo，圖示內容表明該表位保守性較高，且431-435 aa極其保守（圖5）。

3" 討" 論

貓杯狀病毒（FCV）的VP1衣殼蛋白是該病毒的關鍵結構蛋白，其復雜的結構對病毒的生物學特性和免疫反應起決定性作用。VP1蛋白主要由兩個主要結構域組成：殼（S）結構域和突出（P）結構域［14-15］。S結構域提供了病毒顆粒的基本框架，是組成病毒衣殼的主要部分，而P結構域則位于病毒顆粒的外部，直接暴露于宿主免疫系統前［16］。

P結構域細分為P1和P2兩個亞結構域，其中P2亞結構域尤為重要。它位于病毒顆粒的最外層，是病毒與宿主細胞受體相互作用的主要界面，同時也是免疫系統識別的關鍵區域［17］。P2亞結構域的高變異性是FCV逃避宿主免疫系統的主要機制之一，盡管FCV只有1個血清型，但VP1的高變異性使FCV的毒株之間的交叉反應性不高這都極大加劇了使用疫苗后免疫失敗的概率［16，18］。VP1蛋白的抗原區域分為A～F 6個區域，其中E區域位于P2亞結構域，是誘發免疫反應的關鍵區域，包含了多個免疫原表位［19-20］。這些表位是病毒與宿主免疫系統相互作用的關鍵區域，對于病毒的識別和中和至關重要。因此，對E區域的深入研究，特別是對其中免疫原表位的精確識別和定位，對于理解FCV的免疫學特性、發展有效的診斷工具和疫苗具有重大意義。

主要抗原蛋白VP1的保守性表位在不同的FCV毒株中保持相對穩定，因此能夠誘導產生廣泛的免疫反應。而FCV疫苗的有效性主要依賴于激發高保守性中和表位的免疫應答，因此使用單抗篩選FCV的保守且具有中和作用表位對于開發可有效防止病毒感染和傳播的疫苗至關重要［20］。

此外VP1蛋白的多樣性也是FCV抗原檢測產品效果不佳的主要原因。本研究的3A3C1株mAb所針對的表位相對保守但無中和活性，然而這為克服VP1抗原多樣性導致的FCV抗原有效試劑不足的現狀提供了潛在的新解決方案。

4" 結" 論

本研究成功制備了針對FCV VP1蛋白的單克隆抗體（mAb）3A3C1株，3A3C1株mAb為IgG1型，輕鏈為κ鏈，能特異性地識別并結合多個FCV毒株，但沒有中和活性。3A3C1株mAb針對的線性抗原表位位于VP1蛋白的426PSRLTPAGDYAITSG440區域，使用國內外共計185株FCV的 VP1對應位置氨基酸序列進行比對，結果表明該表位保守性較高，可作為FCV通用抗原檢測的候選抗體。

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（編輯" 白永平）