異丙氧苯胍聯合黏菌素對肺炎克雷伯菌體外協同抗菌作用

摘" 要： 旨在研究異丙氧苯胍與黏菌素的協同抗菌能力及初步聯合作用機制，評估異丙氧苯胍是否能作為一種有效的黏菌素增效劑，增強黏菌素抗菌效果，以期為臨床上多重耐藥肺炎克雷伯菌感染提供有效治療的理論依據。本研究通過異丙氧苯胍與黏菌素對肺炎克雷伯菌的最低抑菌濃度、棋盤試驗、時間殺菌曲線、耐藥性誘導和熒光染料試驗對協同抗菌及初步聯合機制進行研究。結果顯示：異丙氧苯胍單用對肺炎克雷伯菌沒有抗菌活性，但與黏菌素聯用可對肺炎克雷伯菌產生協同作用，與阿莫西林聯用時具有相加作用。時間殺菌曲線表明，兩藥聯合使用時，異丙氧苯胍可增強肺炎克雷伯菌對黏菌素的敏感性，細菌數量與黏菌素單藥作用相比下降＞2 lg（CFU·mL-1），具有協同作用。在長期誘導耐藥性試驗中，較黏菌素單藥組、聯合用藥組中黏菌素更不易誘導產生耐藥性。協同作用機制試驗結果表明，黏菌素與異丙氧苯胍聯合使用時，可以破壞細胞質膜通透性，影響細胞膜電勢，消散質子動力勢能，使細胞膜難以發揮正常功能。本研究發現異丙氧苯胍與低濃度黏菌素聯用對肺炎克雷伯菌具有良好協同抗菌活性，增強黏菌素的抗菌作用。綜上表明，異丙氧苯胍可以恢復多重耐藥肺炎克雷伯菌對黏菌素的敏感性，可作為治療肺炎克雷伯菌感染的潛在治療方案。

關鍵詞： 肺炎克雷伯菌；mcr；異丙氧苯胍；黏菌素；協同抗菌活性

中圖分類號：S859.796

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）12-5792-10

doi： 10.11843/j.issn.0366-6964.2024.12.041

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

收稿日期：2024-01-26

基金項目：國家自然科學基金項目（32273057）

作者簡介：吳素娟（1999-），女，福建寧德人，碩士，主要從事獸醫藥理學與毒理學研究，E-mail：2411924405@qq.com

*通信作者：曾振靈，主要從事獸醫藥理學與毒理學、獸藥新劑型、獸藥殘留與食品安全等研究，E-mail：zlzeng@scau.edu.cn，Tel：020-85281204

Synergistic Antimicrobial Effect of Isopropoxy Benzene Guanidine Combined with Colistin on Klebsiella pneumoniae in vitro

WU" Sujuan1，2，3， LIN" Changcheng1，2，3， WAN" Peng1，2，3， LI" Jie1，2，3， LU" Yixing1，2，3， HU" Jianxin1，2，3，

PENG" Xianfeng4， ZENG" Zhenling1，2，3*

（1.College of Veterinary Medicine， South China Agriculture University， Guangzhou 510642，" China;

2.Guangdong Provincial Key Laboratory of Veterinary Pharmaceutics Development and Safety， Guangzhou 510642，" China;

3.National Risk Assessment Laboratory for Antimicrobial Resistance of Animal Original Bacteria， Guangzhou 510642，" China;

4.Guangzhou Insighter Biotechnology Co. Ltd， Guangzhou 510000，" China）

Abstract：" This work aimed to study the antibacterial synergistic ability and the preliminary combined mechanism of isopropoxy benzene guanidine （IBG） combined with colistin， and to evaluate whether IBG can act as an effective colistin synergist and enhance the anti-bacterial effect of colistin. The findings of this study will provide a theoretical basis for the effective treatment of multidrug resistant bacterial infections in the clinic. This study investigated the preliminary combined mechanism and synergistic effect of IBG with colistin against Klebsiella pneumoniae using the minimal inhibitory concentration， checkerboard test， time killing curves， resistance induction and fluorescent dye test. IBG has no antimicrobial activity against K. pneumoniae alone， but has a synergistic effect against K. pneumoniae in combination with colistin and an additive effect in combination with amoxicillin. Time killing curves indicate that when the two drugs are used in combination， IBG enhances the susceptibility of K. pneumoniae to colistin， with a synergistic decrease in bacterial counts of gt;2 lg（CFU·mL-1） compared to the effect of colistin alone. In the long-term induced resistance test， resistance was less likely to be induced by colistin in the combination group than in the colistin monotherapy group. The results of the synergistic mechanism test showed that colistin and IBG， when used in combination， can destroy the permeability of the cytoplasmic membrane， affect the potential of the cell membrane， and dissipate the proton kinetic potential energy， so that it is difficult for cell membranes to perform their normal functions. In this study， we found that the combination of IBG and low concentration of colistin， has good synergistic antibacterial activity against K. pneumoniae and enhances the antibacterial effect of colistin. It suggests that IBG can restore the susceptibility of multidrug resistant K. pneumoniae to colistin， and can be used as a potential therapeutic option for the treatment of K. pneumoniae infections.

Key words： Klebsiella pneumoniae; mcr; isopropoxy benzene guanidine; colistin; synergistic antimicrobial activity

*Corresponding author：" ZENG Zhenling， E-mail： zlzeng@scau.edu.cn

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KP）是一種常見的革蘭陰性菌，為條件致病菌，廣泛分布于自然界中，主要存在于動物及人的消化道、呼吸道和泌尿生殖道等［1］。根據其毒力可分為經典肺炎克雷伯菌（classical Klebsiella pneumoniae，cKP）和強毒肺炎克雷伯菌（hypervirulent Klebsiella pneumonia，hvKP），其中hvKP具有高侵襲性和易感染健康人群等特點，具有一定的致死率［2］，目前中國是hvKP感染高發地區［3］。由于臨床上抗生素的濫用，使原本對抗生素敏感的肺炎克雷伯菌不斷發生耐藥進化。隨著第三代頭孢類抗菌藥物的廣泛使用，肺炎克雷伯菌對廣譜β-內酰胺類抗生素逐漸形成耐藥，耐藥機制以產超廣譜β-內酰胺酶（ESBLs）為主，能水解青霉素類、氧亞氨基頭孢菌素及單環酰胺類氨曲南［4］。編碼ESBL的基因主要存在于與其他抗性基因相關質粒的轉座子或插入序列上，可以迅速擴散，導致肺炎克雷伯菌呈現多重耐藥表型［5］。目前，肺炎克雷伯菌耐藥與毒力逐漸加強，使其成為除大腸桿菌之外的另一重要致病菌，被認為是一種日益嚴重的全球性威脅［6-7］。

黏菌素作為治療多重耐藥革蘭陰性菌感染的“最后一道防線”藥物，肺炎克雷伯菌mgrB基因突變、三大調控系統改變以及質粒介導黏菌素耐藥mcr基因的廣泛流行都可能導致臨床感染治療的失敗。自2016年我國首次報道了mcr-1以來［8］，已經在動物、食物、農場、人類和環境分離的不同細菌中鑒定出10種略有不同的mcr-1基因變體（mcr-1～mcr-10）［9］。mcr基因的多樣性是細菌適應外界抗生素壓力的結果，導致黏菌素耐藥水平的增高和傳播能力的增強［10］。

新型抗菌藥物的開發周期長，且耗資巨大；相較于新藥開發，合理利用現有抗菌藥物，提高現有抗菌藥物的療效具有成本低與見效快等優點，更適合應用于我國畜牧養殖業［11］。聯合用藥可以擴大抗菌譜、減緩或抑制細菌耐藥性的產生，減少毒副作用［12］，從而有效控制多重耐藥和廣泛耐藥菌所致的嚴重感染；有效遏制耐藥菌的產生和傳播。為了增強最后一道防線藥物的療效，將黏菌素與其他抗菌藥物聯合使用可以克服細菌對黏菌素敏感性降低的問題，同時不會增加黏菌素的暴露，不易導致黏菌素耐藥［13］。

胍類化合物具有較強的有機堿和親水性，在合成化學和藥物化學領域都有很好的應用前景［14］。胍類官能團帶正電，可與帶負電的細胞質膜或細胞壁組分結合，使磷脂喪失生物功能或膜破壞，最終導致細胞死亡［15］。本實驗室前期篩選出胍類衍生物——異丙氧苯胍（isopropoxy benzene guanidine，IBG）對多耐藥革蘭陽性菌具有很強的抑制活性，但對革蘭陰性菌沒有抗菌活性，作者通過聯合用藥發現異丙氧苯胍與黏菌素聯用對革蘭陰性菌具有良好的抗菌活性。所以本文旨在研究異丙氧苯胍與黏菌素聯用對肺炎克雷伯菌的體外協同抗菌作用，初步探究其聯合作用機制，以期為有效治療多重耐藥肺炎克雷伯菌感染提供理論依據。

1" 材料與方法

1.1" 菌株來源

本試驗中所使用的肺炎克雷伯菌標準菌株ATCC 700603和大腸桿菌質控菌株ATCC 25922均為本實驗室保存；4株黏菌素耐藥肺炎克雷伯菌臨床菌株分離自廣州不同動物糞便樣品，分別為P135、C14、C20和124C。

1.2" 抗菌藥物及主要試劑

主要試劑有水解酪蛋白肉湯（MHB）、水解酪蛋白瓊脂培養基（MHA）、胰酪大豆胨液體培養基（TSB）購自廣東環凱生物科技有限公司；LB肉湯、LB營養瓊脂、麥康凱肌醇阿東醇羧芐青霉素培養基（MIAC）購自青島高科技工業園海博生物技術有限公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、碘硝基四唑紫（iodonitrotetrazolium chloride，INT）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；碘化丙啶（propidium lodide，PI）、ΔpH熒光染料（BCECF-AM）購自碧云天生物技術有限公司。Disc3（5）購自MedChemExpress公司；主要抗菌藥物：異丙氧苯胍（isopropoxy benzene guanidine，IBG，純度99%）購自廣州英賽特生物技術有限公司。黏菌素（colistin，CL，效價19 000 U·mg-1）、阿莫西林（含量99%）、氨芐西林（含量96%）、美羅培南（98%）、環丙沙星（含量99%）、新霉素（含量92%）購自大連美侖生物技術有限公司；頭孢他啶（含量98%）、恩諾沙星（含量98.5%）、氟苯尼考（含量95%）、替加環素（含量98%）均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；甲氧芐啶（含量98％）購自廣東翔博生物科技有限公司；頭孢西丁（含量89%）購自海口市制藥廠有限公司。

1.3" 最低抑菌濃度

將肺炎克雷伯菌ATCC 700603、大腸桿菌ATCC 25922和實驗室保藏的黏菌素耐藥臨床菌株參照美國臨床和實驗室標準協會（CLSI M100-Ed30）抗生素藥敏試驗標準，通過微量肉湯稀釋法測定其對IBG和黏菌素的最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC），其中黏菌素對腸桿菌科細菌的耐藥折點為4 μg·mL-1。

1.4" 聯合藥敏測定

用MH肉湯將對數生長期的肺炎克雷伯菌ATCC 700603和各臨床菌株菌液稀釋至106 CFU·mL-1后備用。將異丙氧苯胍（A藥）兩倍倍比稀釋加到96孔板中的第1～9列，濃度梯度設置為256、128、64、32、16、8、4和2 μg·mL-1；B藥濃度梯度設置為16×MIC、8×MIC、4×MIC、2×MIC、1×MIC、0.5×MIC和0.25×MIC，吸取100 μL含不同B藥與菌液的混合液依次加入到第1～7行的前10列孔中。其中第8行作為B藥的單獨藥敏對照，第10列為A藥的單獨藥敏對照，第11列為細菌陽性對照，第12列為細菌陰性對照。因異丙氧苯胍不溶于水，溶于二甲基亞砜，高濃度的異丙氧苯胍本身的溶液顏色會對試驗結果產生干擾，先將96孔板置于37℃恒溫培養箱中培養16～20 h，取出后每孔加入INT，置于37℃恒溫培養箱中培養20 min，通過肉眼觀察96孔板的顏色變化。細菌生長判定標準：孔內液體顏色不變視為沒有細菌生長；孔內顏色變成紅色，表示孔內有大量細菌生長［16］，每個試驗進行3個生物學重復。結果判定：采用部分抑菌濃度指數（fractional inhibitory concentration index，FICI）對結果進行評價。FICI=（MICA藥聯用/MICA藥單用）＋（MICB藥聯用/MICB藥單用）。判定標準：當FICI＜0.5時為協同作用；當0.5≤FICI≤1時為相加作用；當1＜FICI≤4時為無關作用；當FICI＞4時為拮抗作用。

1.5" 時間殺菌曲線

將過夜培養的肺炎克雷伯菌ATCC 700603與肺炎克雷伯菌P135用MH肉湯稀釋100倍，放置37℃、180 r·min-1恒溫震蕩培養箱中，培養3～4 h至對數生長期，調節菌液濃度為106-7 CFU·mL-1。加入不同濃度藥物，分別設置空白生長對照組、異丙氧苯胍單藥組（64 μg·mL-1）、黏菌素單藥組（0.5×MIC）及異丙氧苯胍與黏菌素聯合組（64 μg·mL-1異丙氧苯胍＋0.5×MIC黏菌素）。將菌液放入37 ℃，180 r·min-1恒溫震蕩培養箱中培養。在特定的時間點吸取50 μL菌液，使用無菌生理鹽水進行10倍梯度稀釋后吸取20 μL各個梯度的稀釋液分別滴于四分區的LB瓊脂板上，正面放置等待菌液晾干，倒置于37℃培養箱培養10 h。對每個板的分區進行細菌計數。以細菌對數值為縱坐標，以時間為橫坐標，繪制不同藥物處理對細菌的動態殺菌曲線。結果判定標準為在細菌生長24 h時，將聯合用藥組與單獨用藥組中最有效的一組相比，細菌菌量下降≥2 lg（CFU·mL-1）定義為協同作用；下降菌量范圍為1 lg（CFU·mL-1）～2 lg（CFU·mL-1）則定義為相加作用；下降菌量＜1 lg（CFU·mL-1）則認為是無關作用；細菌菌量增加＞2 lg（CFU·mL-1）定義為拮抗作用［16］。

1.6" 連續傳代試驗

將培養至對數生長期的肺炎克雷伯菌ATCC 700603菌液用MH肉湯稀釋為OD600 nm約0.1。分別加入0.5×MIC黏菌素、2×MIC黏菌素、64 μg·mL-1異丙氧苯胍、0.5×MIC黏菌素與64 μg·mL-1異丙氧苯胍，在37 ℃、180 r·min-1恒溫震蕩培養箱培養24 h后，分別將菌液用MH肉湯稀釋100倍，對應加入0.5×MIC黏菌素、4×MIC黏菌素、64 μg·mL-1異丙氧苯胍、0.5×MIC黏菌素與64 μg·mL-1異丙氧苯胍繼續作用24 h，依次連續傳代30 d，每隔24 h的菌液測定黏菌素對傳代菌的MIC，其余菌液加入30%甘油后儲存至-80 ℃冰箱，依次添加藥物連續傳代30 d，30 d傳代結束后，再進行無藥物壓力下傳代10 d，最低抑菌濃度不變代表傳代成功。記錄各組每代MIC數據。在傳代過程中，每個藥物濃度設置3個生物學平行，同時設置不加藥物的正常生長作為對照組。

1.7" 協同作用機制

肺炎克雷伯菌ATCC 700603單菌落過夜培養，于5 000 r·min-1離心5min后，用無菌PBS/HEPES（pH 7.0＋5 mmol·L-1葡萄糖）洗凈并重懸，使其OD600 nm約為0.5，并與熒光染料孵育30 min。細菌用64 μg·mL-1異丙氧苯胍、0.5 μg mL-1黏菌素和不同異丙氧苯胍濃度（2～128 μg mL-1）＋黏菌素0.5 μg mL-1分別處理，37 ℃孵育1 h后，使用日立F-7000熒光光譜儀以相應的激發波長和發射波長測量熒光，通過對比各藥物處理組的熒光強度來判斷結果。

1.7.1" 細胞膜滲透性測定

使用PI熒光染料對細胞膜的通透性進行評價，添加PI至最終濃度為0.5 μmol·L-1，以535 nm激發波長和615 nm發射波長測量熒光強度。

1.7.2" 細胞膜電位Δφ測定

使用Disc3（5）熒光染料對細胞膜電位進行測定，添加Disc3（5）至最終濃度5 μmol·L-1，以622 nm激發波長和670 nm發射波長測量熒光強度。

1.7.3" 細胞膜ΔpH測定

使用BCECF-AM熒光染料對細胞ΔpH進行測定，添加BCECF-AM至最終濃度2 mmol·L-1，以488 nm激發波長和535 nm發射波長測量熒光強度。

1.8" 統計學分析

采用SPSS Statistics 25軟件進行統計分析，數據以“x-±s”表示。

2" 結" 果

2.1" 最低抑菌濃度

通過微量肉湯稀釋法對肺炎克雷伯菌標準菌株ATCC 700603以及4株黏菌素耐藥臨床菌株進行MIC測定，結果發現異丙氧苯胍對肺炎克雷伯菌標準和臨床菌株的MIC均大于1 280 μg mL-1；黏菌素對菌株的MIC見表1。

2.2" 聯合藥敏

通過棋盤法測定，發現IBG與黏菌素聯合使用對肺炎克雷伯菌ATCC 700603的FICI＜0.5，具有協同作用；與阿莫西林聯合使用的FICI=0.5，具有相加作用（表2）。

同時也測定了IBG聯用黏菌素對4株黏菌素耐藥的肺炎克雷伯菌臨床菌株的FICI，同樣＜0.5（表3），結果表明該聯合用藥對肺炎克雷伯菌的標準株或臨床株均具有協同作用。

由于IBG對所列肺炎克雷伯菌的MIC＞1 280 μg·mL-1，假設選取1 000 μg·mL-1作為IBG單藥對肺炎克雷伯菌的MIC值，則真實FICI均會小于表中結果，但仍＜0.5，為協同關系

Since the MIC of IBG against the listed Klebsiella pneumoniae is gt;1 280 μg·mL-1， if 1 000 μg·mL-1 is chosen as the MIC for single agent IBG， the true FICI would all be lower than the results in the table， but the FICI would still be lt;0.5， and function is synergistic

2.3" 時間殺菌曲線

時間殺菌曲線進一步評估異丙氧苯胍與黏菌素之間的作用關系，結果表明，異丙氧苯胍單獨用藥對細菌的生長幾乎沒有影響；在黏菌素亞抑菌濃度（0.5×MIC）作用下，肺炎克雷伯菌ATCC 700603（圖1）在0～2 h被明顯抑制生長；肺炎克雷伯菌臨床菌株P135（圖2）在1 h內被明顯抑制生長。當兩者聯用時，肺炎克雷伯菌ATCC 700603和P135細菌數量與黏菌素單藥作用相比均下降＞2lg（CFU·mL-1），表明兩者聯合使用具有協同抗菌增效的作用。肺炎克雷伯菌ATCC 700603與P135分別在2 h和1 h后出現負生長，無論是標準菌株還是臨床菌株在24 h的細菌菌量與空白組基本無差異。

2.4" IBG抑制黏菌素耐藥的發展

在不同濃度的黏菌素和聯合用藥的壓力下，對肺炎克雷伯菌ATCC 700603進行30 d連續傳代試驗。結果如圖3所示，在4×MIC濃度的黏菌素作用下，傳代至第11天，黏菌素對肺炎克雷伯菌達到最高MIC（1 024 μg·mL-1），后由于需添加的黏菌素濃度過大，導致細菌無法生長。4×MIC黏菌素在誘導肺炎克雷伯菌ATCC 700603耐藥的前期具有明顯大于0.5×MIC黏菌素和聯合用藥組誘導的能力。傳代至第26天時，亞抑菌黏菌素（0.5×MIC）濃度處理組對肺炎克雷伯菌ATCC 700603的MIC=2048 μg·mL-1；聯合用藥組的黏菌素對肺炎克雷伯菌ATCC 700603的MIC=512 μg·mL-1；兩者相差4倍。以上說明IBG與黏菌素聯合用藥可以減緩黏菌素耐藥肺炎克雷伯菌的產生。

2.5" 協同作用機制

利用PI檢測細胞內膜滲透性變化，結果發現隨著IBG濃度的增大PI熒光值增加，表明細胞質膜滲透性受到破壞（圖4）；利用Disc3（5）檢測菌體細胞膜電勢的變化，結果發現熒光值隨著IBG濃度的升高而降低，在高濃度的IBG作用下，菌體細胞膜電勢難以維持正常水平（圖5）。使用BCECF-AM檢測菌體細胞的ΔpH變化，結果發現隨著IBG濃度增大而熒光值降低，表明IBG破壞了肺炎克雷伯菌的pH（圖6）；以上結果表明IBG與黏菌素聯用可以改變肺炎克雷伯菌細胞質膜的通透性，破壞細胞膜電位，消散質子動力勢能，影響細胞膜發揮正常功能。

3" 討" 論

含胍的化合物已被證明在藥物聯合抗菌治療中是有效的，具有廣闊的開發前景［17］。Ogunniyi等［18］表明NCL195是一種新型廣譜抗菌劑、化學先導化合物，可以破壞細菌細胞膜電位對肺炎鏈球菌

和金黃色葡萄球菌發揮抗菌效果。Pi等［19］研究表明NCL195聯合外膜透化劑（EDTA、PMBN或PMB）對臨床多重耐藥革蘭陰性病原菌具有良好協同抗菌活性，是治療革蘭陰性菌感染的有效手段［20］。靶向誘導宿主損傷和疾病所必需的毒力因子是抗菌治療的一種新范式，具有多種可能導致耐藥性降低的潛在益處。Mshafik等［21］報道亞抑菌濃度下二甲雙胍對肺炎克雷伯菌的毒力因子具有強大的抑制作用，除了對耐藥肺炎克雷伯菌具有抗菌活性（MIC=8 mg·mL-1）外，還可以作為傳統抗生素的佐劑，提高療效。

本研究中胍類化合物IBG與黏菌素聯用對多重耐藥肺炎克雷伯菌具有協同抗菌作用，這與本課題組前期研究該聯用組合對含有mcr-1的大腸桿菌、沙門菌、肺炎克雷伯菌等菌株具有協同作用的結果一致［22］。連續傳代試驗結果表明黏菌素在亞抑菌（0.5×MIC）濃度下極易誘導肺炎克雷伯菌對黏菌素耐藥；而黏菌素與IBG的聯合用藥降低了肺炎克雷伯菌對黏菌素耐藥發展的程度。前人研究表明IBG可以破壞耐藥腸球菌和金黃色葡萄球菌細胞膜；與黏菌素聯合用藥可使大腸桿菌細胞膜滲透性增強，干擾大腸桿菌的代謝，從而發揮抗菌作用［14，16，23］。本研究中通過熒光染料試驗初步探究兩藥聯合使用的抗菌機制，表明IBG與黏菌素聯合使用可以使肺炎克雷伯菌細胞膜通透性發生改變，內容物泄露，導致菌體死亡，與上述前人的研究結果一致。Li等［22］經過進一步研究表明黏菌素與IBG聯合使用是通過與磷脂酰甘油（PG）和心磷脂（CA）結合，造成細胞質膜損傷，導致質子動力的耗散和細胞內ATP的積累。Kong等［24］通過腸道感染模型評估IBG聯合黏菌素抗mcr-1陽性沙門菌的藥代動力學/藥效學（PK/PD）模型，表明AUC0-24 h/MIC靶向腸道，可以實現不同程度殺滅細菌。這些學者的研究結果均表明IBG可作為潛在的黏菌素佐劑，增強黏菌素對耐藥革蘭陰性菌的抗菌活性，減緩黏菌素耐藥菌的產生。后期應進一步研究其對動物感染肺炎模型的治療效果以及補充蛋白質組學等相關內容，為開發該化合物提供相應數據。

4" 結" 論

本研究發現異丙氧苯胍與低濃度黏菌素聯用對肺炎克雷伯菌具有良好協同抗菌活性，可增強黏菌素的抗菌作用。表明異丙氧苯胍是有效的黏菌素佐劑，可以恢復多重耐藥肺炎克雷伯菌對黏菌素的敏感性，可作為治療肺炎克雷伯菌感染的潛在治療方案。

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（編輯" 白永平）