改良育陰方對非洲豬瘟病毒感染PAMs的cGAS-STING通路影響

摘" 要： 旨在為評價中藥體外對非洲豬瘟病毒的抑制作用，本研究將5種試驗用藥：連翹、馬勃、改良育陰方（modified Yuyin decoction，MYY）、復方魚腥草（復方2）和銀翹馬勃散（復方3），通過qPCR檢測不同中藥在被非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）感染的豬肺泡巨噬細胞（porcine alveolar macrophages，PAMs）中，對ASFV編碼的衣殼蛋白p72的影響，篩選出可以顯著降低ASFV-p72基因表達的中藥為改良育陰方（MYY）。采用LC-MS分析檢測出改良育陰方的主要化學成分；采用CCK8法觀察改良育陰方對豬肺泡巨噬細胞（PAMs）活力的影響；熒光定量PCR檢測ASFV-p72基因的表達；Western blot和ELISA檢測CGAS-STING信號通路蛋白表達水平；RU.521作為cGAS抑制劑用于驗證MYY在cGAS-STING通路中對ASFV的作用。結果表明，在PAMs中，MYY可以顯著降低ASFV-p72基因表達，在ASFV感染2 h給藥效果最佳，對ASFV感染PAMs后的細胞活力具有濃度依賴性改善作用。攻毒后2 h，使用MYY發現PAMs細胞上清液中干擾素基因刺激蛋白（STING）、TANK結合激酶1（TBK1）、干擾素調節因子3（IRF3）、干擾素誘導跨膜蛋白3（IFITM3）表達量的下降，PAMs細胞內環狀GMP-AMP合成酶（cGAS）、干擾素β（IFNβ）蛋白量表達增加，MYY可激活cGAS-STING-TBK1-IRF3-IFNβ信號通路，促進IFITM3的表達。經RU.521處理后，MYY仍能提高細胞活力，降低ASFV-p72基因的表達。綜上所述，MYY具有抑制ASFV的潛在作用，可能與cGAS-STING信號通路的激活促進IFITM3的表達有關。

關鍵詞： 改良育陰方；非洲豬瘟病毒；ASFV-p72基因；CGAS-STING信號通路；LC-MS分析

中圖分類號： S853.1; S852.659.1

文獻標志碼：A

文章編號：0366-6964（2024）12-5839-15

doi： 10.11843/j.issn.0366-6964.2024.12.045

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

收稿日期：2024-01-02

基金項目：廣東省重點領域研發計劃 （2019B020211004）

作者簡介：陳曉麗（1992-），女，福建詔安人，博士生，主要從事中藥抗病毒研究，E-mail： xiaolichen@stu.scau.edu.cn

*通信作者： 郭世寧，主要從事中獸醫藥在畜禽健康養殖上的應用研究，E-mail：shining@scau.edu.cn；呂偉杰，主要從事中獸醫藥與動物腸道菌群關系研究，E-mail： lvwj@scau.edu.cn

Effect of Modified Yuyin Decoction on cGAS-STING Pathway of African Swine Fever

Virus Infected PAMs

CHEN" Xiaoli1， ZHOU" Jiahao1， ZHOU" Jing1， QU" Qian1， WANG" Zhihua1， XIONG" Ying1， ZHU" Yongqi1， JIA" Weixin1， L Weijie1*， GUO" Shining1，2*

（1.College of Veterinary Medicine， South China Agricultural University， Guangzhou 510642，" China;

2.International Institute of Traditional Chinese Veterinary Medicine， South China Agricultural University， Guangzhou 510642， China）

Abstract：" In order to evaluate the efficacy of Chinese traditional medicine against African swine fever virus （ASFV） in vitro， five experimental drugs were used in this study. The effects of different Chinese herbal medicines on ASFV encored capshell protein p72 in porcine alveolar macrophages （PAMs） infected with African swine fever virus were detected by qPCR. Modified Yuyin decoction （MYY） was selected as a Chinese medicine that could significantly reduce the expression of ASFV-p72 gene. The main components of anti-ASFV were detected by LC-MS analysis. CCK8 method was used to observe the effect of modified Yuyin decoction on the activity of PAMs. The expression of ASFV-p72 gene was detected by fluorescence quantitative PCR. Western blot and ELISA were used to detect CGAS-STING signaling pathway protein expression. RU.521 was used as a cGAS inhibitor to verify the anti-ASFV effect of MYY in the CGAS-STING pathway. The results showed that MYY can significantly reduce the expression of ASFV-p72 gene in PAMs， and the best effect is given at 2 h after ASFV infection， and it has a concentration-dependent improvement effect on the cell viability after ASFV infection of PAMs. The expression levels of interferon gene stimulating protein （STING）， TANK binding kinase 1 （TBK1）， interferon regulatory factor 3 （IRF3） and interferon induced transmembrane protein 3 （IFITM3） in the supernatant of PAMs cells were decreased by MYY 2 h after the challenge. The expression of cyclic GMP-AMP synthetase （cGAS） and interferon β （IFNβ） protein in PAMs cells increased， and MYY could activate the cGAS-STING-TBK1-IRF3-IFNβsignaling pathway and promote the expression of IFITM3. After treatment with RU.521， MYY could still increase cell viability and decrease the expression of ASFV-p72 gene. In summary， MYY has a potential anti-ASFV effect， which may be related to the activation of cGAS-STING signaling pathway to promote the expression of IFITM3.

Key words： modified Yuyin decoction; African swine fever virus; ASFV-p72 gene; CGAS-STING signaling pathway; LC-MS analysis

*Corresponding authors：" GUO Shining， E-mail： shining@scau.edu.cn; L Weijie，E-mail： lvwj@scau.edu.cn

非洲豬瘟（African swine fever）被世界動物衛生組織（World Organisation for Animal Health， WOAH）列為法定報告動物疫病，我國將非洲豬瘟列為重點防范的一類動物疫病，是一種由外界傳入的烈性動物疫病，感染該病毒的豬死亡率接近100%［1］。從2018年8月，我國暴發第一例非洲豬瘟疫情，僅2019年就給我國造成嚴重的經濟損失，損失金額達1 110億美元。截至2023年5月，ASF已經影響18個國家，如中國、越南、韓國和蒙古國等［2］。迄今為止，尚未開發出安全有效的ASF疫苗和商品化抗病毒藥物，因此迫切需要開發針對非洲豬瘟的有效疫苗或抑制病毒藥物。

中醫將由病毒引起的傳染病被稱為“瘟疫”。在傳染病的防治方面，中醫已有幾千年的歷史，不僅經驗豐富，還有成熟的理論體系。傳統中醫防治疾病的基本原則：“未病先防、既病防變和標本兼治”。中醫藥作為我國幾千年流傳下來的瑰寶，并且在病毒病防治方面也積累了寶貴的經驗。從中醫的角度來看ASF屬于“溫病”，本研究選用5種具備清熱解毒功效的試驗用藥：連翹、馬勃、改良育陰方（MYY）、復方魚腥草（復方2）和銀翹馬勃散（復方3）進行抑制病毒篩選，其中3個復方中藥的組方中均含有金銀花、連翹藥物。研究發現，一些清熱類藥物，比如金銀花、板藍根等對流感病毒具有較好的抑制作用［3］。大青葉能夠抑制流感病毒的生物合成［4］。白及提取物能夠提高小鼠機體免疫力［5］。漢黃芩素和黃芩素是黃芩的主要組成成分，能夠抑制流感病毒囊膜與細胞膜的融合［6］。冰香散對流感病毒影響的體外試驗發現，流感病毒的復制能力受到了顯著抑制［7］。雙黃連能夠很好地修復由甲型H1N1流感病毒所引起的MDCK細胞損傷［8］。紅景天苷和黃芪甲苷具有抑制柯薩奇B組病毒復制的作用［9］。柴胡能夠在病毒感染早期，對小鼠的心肌細胞進行保護［10］。除此之外，中藥在防控ASF方面也起到了積極的影響。研究發現，黃酮類化合物芹菜素和金雀異黃素能夠在體外對ASFV的復制發揮抑制作用［11］。含金銀花的復方中藥提取物方劑可以在非洲豬瘟的防控中發揮作用，其主要作用表現在降低豬感染發病的機率［12］。中藥復方“新溫康”有清熱解毒、益氣生津、涼血散瘀的功效，配合有清熱解毒、益氣生津、涼血散瘀功效的佐劑“解霉紅景天”聯合使用對非洲豬瘟有獨特治療效果［13］。TSN能有效抑制ASFV體外復制。其抗病毒作用歸因于TSN上調宿主IFN刺激基因IRF1［14］。因此，開發防治非洲豬瘟的中藥制劑具有重要的現實意義和研究價值。

ASFV是一種雙鏈DNA病毒，它可以通過內吞作用進入宿主細胞，形成內體。在這個階段，發揮作用的模式識別受體（pattern recognition receptors，PRR），主要是Toll樣受體（toll-like receptors，TLR）［15］，該通路被激活，進而激活了干擾素通路產生抗病毒蛋白，將病毒限制在內體結構中。當病毒毒力太強或者機體免疫功能下降時，ASFV可突破內體防線，病毒囊膜與宿主細胞膜發生融合，ASFV進入細胞質中。此時，細胞質DNA信號通路就會被激活，即cGAS-STING信號通路，進而激活下游干擾素通路，產生抗病毒蛋白，如IFITM3，發揮抗病毒功能［3］。機體發揮抗ASFV功能的主要通路：Toll樣受體通路和cGAS-STING通路。ASFV進入細胞之后，免疫系統監測到這種外來的PAMP信號，就激活了細胞質信號通路即cGAS-STING通路，對該通路研究發現，cGAS監測到細胞質中的dsDNA后，就會催化合成cGAMP，即GMP-AMP環二核苷酸，之后cGAMP離開內質網，到達高爾基體，在這里cGAMP與干擾素基因蛋白刺激器STING發生結合。隨后，招募大量的TBK1并使之磷酸化，同時也招募大量IRF3，隨后也會發生相應的磷酸化，然后IRF3就會向細胞核轉移，發揮其轉錄因子的作用，促使I型IFN-α/β基因的表達［16］。本試驗通過研究MYY對ASFV在APMs細胞中的抑制作用，以及MYY在天然免疫調節過程中（cGAS-STING）對I型IFN通路激活的影響，為中藥對病毒的調控機制提供依據。

1" 材料與方法

1.1" 藥物制備

本試驗共使用5種試驗用藥，包括2種單藥：連翹和馬勃；以及3種復方中藥：MYY、復方2、復方3，試驗所用中藥均購自北京同仁堂有限公司。稱取適量的中藥粉碎，稱取粉碎后的中藥20 g，加水400 mL，浸泡15 min后，武火煮沸，文火煎煮至200 mL，收集藥液至50 mL離心管，3 000 r·min-1離心5 min，旋轉蒸發（60 ℃）濃縮至40 mL，使藥液濃度為0.5 g·mL-1，濃縮后藥液高壓蒸汽滅菌（121.3 ℃，15 min）制得中藥原液，保存于-20 ℃備用。

1.2" 病毒與原代PAMs細胞的分離

非洲豬瘟病毒毒株（編號：ASFV GZ201801）（GenBank： MT496893.1）為華南農業大學張桂紅教授饋贈。原代PAMs細胞的分離：將斷奶仔豬安樂死后，取出完整肺用止血鉗鉗住氣管，置于含5％雙抗的PBS中清洗3遍，轉移至超凈工作臺。向支氣管中加入5％雙抗的PBS進行灌洗，每次加入500 mL PBS，灌洗4次。收集灌洗液至50 mL離心管中，將收集到的灌洗液在4℃離心機中300 g離心10 min，棄去上清液，加入1 mL含5％雙抗的1640吹打沉淀，收集至50 mL離心管內，同樣條件離心。棄去上清液，加入凍存液，用臺盼藍進行細胞計數，每管1 mL分裝至凍存管，存于液氮備用。本研究所有病毒相關試驗均在華南農業大學獸醫學院生物安全三級實驗室（BSL-3）進行。所有動物試驗均按照華南農業大學實驗動物中心動物實驗倫理審查的規定進行，批準號：2023c091。

1.3" MYY的LC-MS分析

本試驗篩選出的最佳抑制ASFV中藥為改良育陰方（MYY），作為一個復雜的方劑，使用液相質譜聯用（LC-MS）技術對其中藥成份分析進行分析是必要的。將“1.1”制備的MYY原液在0.22 μm濾膜過濾后，將過濾液置于上樣瓶中，用于LC-MS上機檢測，檢測后將數據進行以下處理和分析。首先，通過Proteowizard軟件包（v3.0.8789）［17］中MSConvert工具將原始質譜下機文件轉換為mzXML文件格式。采用R XCMS（v3.12.0）軟件包［18］進行峰檢測、峰過濾、峰對齊處理，參數設置為bw=2，ppm=15，peakwidth=c（5， 30），mzwid=0.015，mzdiff=0.01，method=”centWave”，得到代謝物定量列表。然后，通過總峰面積歸一化的方法實現數據矯正，消除系統誤差。采用公共數據庫HMDB［19］、massbank［20］、LipidMaps［21］、mzcloud［22］、KEGG［23］及諾米代謝自建標準品庫等譜圖數據庫進行物質鑒定（搜庫），得到代謝物定性結果。具體原理是根據一級質譜中母離子的質荷比（m/z）確定代謝物的分子量、加合離子等信息進行分子式預測，然后與數據庫進行比較、匹配，實現代謝物的一級定性鑒定；同時，在定量列表中，檢測到二級譜圖的代謝物與數據庫中每個代謝物的碎片離子等信息進行比較、匹配，實現代謝物的二級定性鑒定。

1.4" 中藥的細胞毒性評價

采用CCK8法評價5種中藥作用于PAMs細胞48 h對細胞活力的影響。簡單地說，在96孔板中接種PAMs，設置10個濃度的藥物干預（0.975、1.95、3.91、7.81、15.63、31.25、62.5、125、250和500 mg·mL-1）和空白對照組，每組設置4個重復孔。去除培養基后，加入100 μL 10% CCK8繼續孵育2 h。用酶標儀450 nm處測定吸光值。計算細胞存活率，確定中藥安全濃度。細胞活力的計算公式：細胞活力（％）=［A（加藥）-A（空白）］/［A（0加藥）-A（空白）］×100。

1.5" 不同濃度中藥抑制病毒分析

在96孔板中，PAMs在RPMI-1640培養基中培養24 h。試驗細胞分為空白組，模型組，不同濃度梯度中藥組。稀釋5種中藥濃度用于本試驗。細胞培養至貼壁后，棄去培養液。空白組加入維持培養基、模型組加入病毒進行造模、中藥組加入中藥和病毒的混合液，2 h后棄去每孔溶液，洗滌，加入維持培養基繼續培養至48 h。

1.6" 添加時間測定

將PAMs接種于RPMI-1640培養基中的96孔板中，在37℃和5%二氧化碳下孵育24 h，用于添加時間測定。試驗細胞分為空白組、模型組和不同時間給藥方式組。設計了攻毒前2 h給藥，同時給藥，攻毒后2、4、8、16、24 h給藥，共7種給藥方式用于本次試驗。試驗設計方案如圖1。

1.7" TCID50檢測

將PAMs接種于RPMI-1640培養基中的96孔板中，在37℃和5% CO2下孵育24 h，棄去96孔板中細胞培養液，加入100 μL PBS輕柔清洗2次，加入不含血清、不含雙抗、含不同病毒濃度的1640培養基（100 μL病毒+900 μL的1640培養基10倍稀釋），每個濃度8個重復，同時設置空白對照組。病毒37℃孵育2 h后，輕柔棄去病毒液，加入不含雙

抗、含10％血清的1640培養基，每孔100 μL，繼續孵育24 h。加入20 μL豬紅細胞，培養24 h，觀察血凝現象并記錄。

1.8" 熒光定量PCR檢測

PAMs在6孔板中培養，每孔感染103 TCID50 ASFV，感染2 h后，用PBS洗滌細胞，并在添加所測中藥的RPMI-1640培養基中孵育。對處理過和模擬處理過的細胞進行DNA提取。使用離心柱式動物RNA抽提試劑盒提取樣本總RNA后，用HiScript III 1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）進行逆轉錄合成cDNA。根據NCBI基因庫中登錄的目的基因mRNA序列，引物由北京擎科生物科技有限公司設計，特異性引物序列見表2。按ChamQ SYBR qPCR Master Mix（南京諾唯贊生物科技股份有限公司）說明書配制反應體系，在Light Cycler480 型熒光定量PCR儀器上進行反應，應用2－△△Ｃｔ法對數據進行分析。

1.9" Western blot法檢測IFNβ和cGAS蛋白表達量

將收集的細胞按照每100 μL裂解液加入1 μL苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyL fluoride，PMSF）的比例配制適量裂解液。充分裂解后，在4 ℃、12 000 g離心5 min，并將離心后的上清液轉移至新的EP管。二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法測定細胞樣本的蛋白濃度，并用PBS將每份樣品調至相同濃度。根據蛋白濃度配制樣品，加入5×蛋白上樣緩沖液，用移液槍反復抽吸，充分混合，沸水加熱5 min使蛋白變性，-20 ℃保存備用。充分清洗玻璃板后按說明書步驟制備SDS-PAGE凝膠，按蛋白總量每孔10 μL等體積上樣，并加入蛋白maker。首先80 V恒定電泳30 min，然后100 V恒定電泳，至溴酚藍到底膠板下沿。切取凝膠中含目的蛋白的條帶，按照黑膠白膜的順序夾好聚偏氟乙烯（poly vinylidene fluoride，PVDF）膜與凝膠，PVDF膜使用前先用甲醇活化3 min。以150 mA轉膜90 min。用稀釋后的TBST清洗PVDF膜3次，每次10 min，隨后用含有5％脫脂奶粉的封閉液封閉90 min。封閉結束后TBST洗滌3次，每次10 min。孵育一抗IFNβ（1∶1 000），cGAS（1∶1 000），4℃ 16 h以上。一抗孵育結束后TBST清洗3次，每次10 min，孵育二抗（1∶5 000）室溫1 h；TBST清洗3次，每次10 min，加入發光液顯影。

1.10" ELISA檢測

將細胞上清樣品在2 500 r·min-1離心取上清，然后加樣：分別設標準孔、待測樣品孔、空白孔。根據說明書檢測豬干擾素調節因子3（IRF3）、豬干擾素誘導跨膜蛋白3（IFITM3）、豬干擾素基因刺激蛋白（STING）和豬TANK結合激酶1（TBK1），以上試劑盒均購自江蘇酶免生物科技有限公司。用酶標儀在450 nm波長處測量各孔的吸光值（OD值），根據標準曲線計算IRF3、IFITM3、STING和TBK1水平。

1.11" RU.521抑制劑試驗

根據上述試驗結果，將PAMs分為CON組，MOD組，MOD+RU.521組，MOD+RU.521+中藥組，MOD+中藥組。具體操作：細胞培養至貼壁后，棄去培養液。以加入病毒的時間定位0 h。CON組：加入維持培養基。MOD組：加入病毒進行造模，病毒作用2 h后，棄去毒液，洗滌，加入維持培養基，繼續培養至所需時間。MOD+RU.521組：提前加入RU.521對細胞預處理30 min，加入病毒進行造模，病毒作用2 h后，棄去毒液，洗滌，加入維持培養基，繼續培養至所需時間。MOD+RU.521+中藥組：提前加入RU.521對細胞預處理30 min，之后病毒作用2 h，棄去毒液，洗滌，加入含中藥的維持培養基，繼續培養至所需時間。MOD+中藥組：病毒作用2 h后，棄去毒液，洗滌，加入含中藥的維持培養基，繼續培養至所需時間。48 h后棄去每孔溶液，洗滌。

1.12" 統計分析

所有試驗重復3次，試驗數據采用SPSS22.0軟件統計分析，結果以“平均數±標準差（x±s）”表示，兩組數據比較通過獨立樣本T檢驗進行分析，多組數據比較采用單因素ANOVA分析各組間差異性，通過最小顯著差數法（LSD）和Duncan’s新復極差檢驗法進行各組間的多重比較。

2" 結" 果

2.1" 5種中藥的細胞毒性

在本試驗中，CCK-8法分別檢測MYY、復方2、復方3、連翹和馬勃對PAMs細胞活力影響。如圖2所示，所有藥物在125～500 mg·mL-1濃度下對APM細胞均具有細胞毒性作用。相比之下，5種中藥各在以下濃度范圍內對細胞活性沒有毒性作用：MYYlt;62.5 mg·mL-1 （A）、復方2lt;31.25 mg·mL-1 （B）、復方 3lt;31.25 mg·mL-1 （C）、連翹lt;1.95 mg·mL-1 （D），馬勃lt;15.63 mg·mL-1 （E）。

2.2" ASFV的TCID50測定

如圖3A所示，觀察豬紅細胞吸附現象，記錄陽性孔，Karber法計算TCID50，Karber公式為lgTCID50=L-d（s-0.5），其中，L=最高稀釋度的對數；d=稀釋度對數之間的差；s=陽性管比率總和。ASFV的TCID50的測定結果為TCID50 = 10-5.625，后續試驗攻毒劑量為103 TCID50。如圖3 B所示，在ASFV病毒滴度大小為103 TCID50時，對PAMs細胞活力影響接近半數致死（P＜0.05）。

2.3" 抑制非洲豬瘟病毒的中藥篩選

從試驗結果可以看出，連翹、馬勃、MYY、復方2和復方3在ASFV大小為103 TCID50時，MYY具有較好的抑制效果，后續以MYY作為主要抑制ASFV用藥進行深入研究。

2.4" MYY的UPLC-MS分析

MYY作為復雜的方劑，對MYY中的化合物進行鑒定是很有必要的。采用UPLC-MS技術分析了MYY的成分，其陰性和陽性基峰色譜圖如圖5A和5B所示，可以看出MYY物質成分豐富。經過數據庫生信分析，共鑒定出9 307個化合物，其中次生代謝產物776個。根據峰面積大小排序，排在前面的物質主要有1， 2-benzoquinone、L-prolinamide、1-O-（4-coumaroyl）-β-D-glucose、D-octopine、nopaline、deoxycytidine、androst-5-ene-3，17-dione、androstanedione、11-dehydrocorticosterone、cholesterol sulfate（表3）。如圖5C所示，776種次生代謝物中，包括109種羧酸及其衍生物，85種苯類，萜類，57種脂肪酸酰基，49種類固醇，48種醇類，45種碳水化合物，41種酚類，類固醇類25種，戊烯醇脂類23種，17種糖苷，16種有機氮化合物，13個有機氧化物、12種咪唑嘧啶、12種吡啶、11種醇及其衍生物、10種香豆素、9種氮環化合物、7種苯丙酸、6種重嗪、5種喹啉及其衍生物、4種嘧啶核苷、4種萜烯（圖5C）。進一步總結了MYY組方中，每個單藥所含化學物質的數（圖5D）。綜上所述，MYY對ASFV病毒具有良好的抑制作用，可能是因為其豐富的天然化合物可以抑制該病毒。

2.5" MYY對非洲豬瘟病毒的作用

在細胞顯微觀察中，空白組細胞狀態良好，模型組細胞折光性增加、變圓、黏連、破碎、脫落、死亡，中藥組細胞相比較于模型組狀態有所好轉。MYY在不同濃度對ASFV的影響研究中，與病毒模型組相比，MYY濃度在7.8 mg·mL-1時差異顯著，PAMs細胞活力呈升高趨勢（圖6A）。MYY在不同時間給藥對ASFV的研究中，結果顯示在攻毒后2 h給藥具有較好的增強PAMs細胞活力效果（圖6B）。

2.6" MYY對豬 cGAS-STING 信號通路的影響

試驗結果顯示（圖7），與空白組相比使用中藥復方后cGAS、STING、TBK1、IRF3表達量上升，說明中藥復方通過激活cGAS-STING信號通路。此外，對IFNβ蛋白表達檢測試驗中，發現與空白組相比，中藥組明顯增加了PAMs細胞內IFNβ蛋白表達，說明中藥可以激活細胞產生大量的IFNβ，并且中藥組抗病毒蛋白IFITM3蛋白表達量也顯著升高，說明該中藥復方會直接增加PAMs細胞內的抑制病毒功能，在后面ASFV入侵時，可能會發揮出更好的抑制效應。

2.7" MYY在ASFV感染后對cGAS-STING信號通路的影響

在本試驗結果中，ASFV組PAMs細胞cGAS、STING、TBK1、IRF3表達量降低，說明ASFV通過抑制cGAS-STING信號通路來增強自身的復制能力；使用中藥復方后，cGAS、STING、TBK1、IRF3表達量上升，說明中藥復方通過激活cGAS-STING信號通路，從而抑制ASFV復制。此外，對IFNβ蛋白表達檢測試驗中，發現與空白組相比，模型組IFNβ蛋白表達量升高，說明病毒本身也會刺激PAMs細胞產生IFNβ來對抗病毒的入侵；使用中藥后，與模型組相比，中藥組明顯增加了PAMs細胞內IFNβ蛋白表達，說明中藥可以激活細胞產生大量的IFNβ，發揮抑制ASFV作用（圖8）。

2.8" MYY在RU.521作用下對PAMs中cGAS-STING通路蛋白表達的影響

在本試驗結果中，CON組細胞狀態良好；MOD組細胞產生大量病變，細胞活力降低 （圖9）；MOD+RU.521組細胞病變進一步加重，活力進一步降低；MOD+RU.521+中藥組細胞活力有所改善，ASFV-p72基因表達量降低；MOD+中藥組細胞細胞活力進一步改善，ASFV-p72基因表達量降低。MOD+RU.521+中藥組ASFV-p72基因表達量高于MOD+中藥組。這就說明了中藥復方產生的抑制ASFV效果受到了RU.521的抑制。

3" 討" 論

ASF對豬的危害是巨大的，主要臨床癥狀是高熱和多器官生理功能下降，這是一種死亡率很高的病毒性疾病。目前，還沒有安全有效的ASFV疫苗可以對其進行防控。為了預防和控制ASFV，開發對該病毒有效的藥物尤為重要。PAMs是ASFV繁殖的主要細胞類型，是研究抗ASFV藥物的良好模型［23］。在哺乳動物中，肺泡巨噬細胞占支氣管肺泡灌洗液中免疫細胞的90%，它們在對抗呼吸道感染性疾病中發揮重要的作用［24］。

中獸醫辯證非洲豬瘟屬“瘟病”范疇［25-26］，溫病的病因是溫邪，是指由外界中具有溫熱性質的致病之邪引起的一類疾病，主要包括“六淫”外邪中的風熱病邪、暑熱病邪、濕熱病邪、燥熱病邪以及“伏寒化溫”的溫熱病邪、溫毒病邪、癘氣等［27］。按照傳統中醫藥理論，可認為非洲豬瘟病毒是中醫病因中的“癘氣”。癘氣為害頗似火熱之邪致病，具有一派熱盛之象，其毒熱較火熱為甚，而且常夾有濕毒等穢濁之氣，防控“治未病”宜采取清熱解毒、補中益氣、芳香化濕等法來實現［28］。MYY主要是由12種中草藥組成，主要具有滋腎陰、清胃火、清熱、止痛的作用，是在傳統育陰方的基礎上，減少寸冬、赤芍、黃芩、白芷、懷牛膝、大黃，添加金銀花、連翹、紫蘇葉、大青葉、甘草進行改良的方劑，起到增強方劑清熱解毒的效力，以及做到方證對應、藥病相當的作用。育陰方已被證實對小鼠實驗性肝損傷模型有一定的保護作用［29］。在肝纖維化大鼠模型中，育陰方顯著抑制了TGF-1的表達，提示這可能是其機制之一［30］。有研究發現，育陰湯治療原發性干燥綜合征時可下調TLR-IFN-BAFF信號通路，抑制異常B淋巴細胞激活［31］。改良育陰方體外對ASFV的抑制作用尚未見報道，在本研究中，首先關注了MYY在體外抑制非洲豬瘟病毒感染的作用。

p72蛋白具有極高的抗原性和免疫原性［32］，ASFV-p72蛋白占病毒粒子的31%～33%［33］，作為病毒的主要結構抗原蛋白［34］，是ASFV抗原檢測的重要指標。此外，p72蛋白在病毒感染時，對病毒吸附到宿主細胞起促進作用［35］。本研究通過ASFV-p72 mRNA表達的檢測結果，評價了5種中藥對ASFV的療效。結果顯示，在5種中藥中MYY的抑制ASFV效果最佳，MYY顯著抑制了ASFV-p72 mRNA的表達，并在添加2 h時顯著提高的APMs的細胞活性，這說明MYY的抗病毒作用可能作用于病毒的入侵階段，抑制ASFV與豬肺泡巨噬細胞細胞膜的融合。

病毒感染后，宿主體內會發生各種基因變化，誘導機體產生大量的I型和III型干擾素，然后產生數千種抗病毒基因ISG，發揮抗病毒作用。ISGs將進一步表達相應的抗病毒蛋白，這些蛋白不僅可以抑制病毒復制過程，還可以以負反饋調節IFN的表達水平，從而發揮間接抗病毒作用［36］。IFITM家族中的4個蛋白，IFITM1、IFITM2、IFITM3和IFITM5，被發現可以抑制流感病毒感染。研究人員確定了該家族中通過基因組參與各種病毒復制的蛋白質［37］。對于不同類型的病毒感染，IFITM家族顯示不同的能力抑制病毒復制［38］，IFITM3主要對流感病毒有強拮抗作用，而IFITM1主要抑制冠狀病毒和線性病毒的復制［39］。本研究采用的給藥方法是對病毒進行攻毒2 h，然后加入MYY，這與病毒復制過程中的入侵階段密切相關。因此，本研究檢測在病毒入侵階段起關鍵作用的抗病毒蛋白IFITM3。MYY的使用上調了PAMs細胞中IFITM3的水平，表明中藥復合物可能在病毒復制過程的早期激活IFITM3，阻斷病毒包膜與細胞膜的融合。MYY對ASFV感染后cGAS-STING通路的影響，提示MYY可通過激活cGAS-STING通路增加抗病毒干擾素IFITM3的產生。

RU.521作為cGAS的特異性抑制劑，已在自身免疫性疾病模型的體外和體內研究中得到證實［40］。RU.521抑制劑試驗表明，中藥顯著改善了ASFV引起的PAMs細胞活力下降，抑制了ASFV-p72基因的表達。在RU.521處理后，MYY仍能提高細胞活力，使ASFV-p 72基因表達下降，效果不如沒有添加抑制劑組好。這些結果表明，MYY通過激活cGAS-STING信號通路發揮抑制ASFV的作用.

MYY可以增強PAMs細胞活力，降低ASFV-p72基因表達，濃度依賴性發揮抑制病毒效果，并且中藥復方能夠通過激活PAMs細胞內cGAS-STING信號通路并誘導產生I型IFN，表達抗病毒蛋白IFITM3干擾ASFV的復制過程，但是cGAS-STING通路并不是該中藥復方產生抑制ASFV作用的唯一通路。

4" 結" 論

MYY具有抑制ASFV的潛在作用，可能與cGAS-STING信號通路的激活促進IFITM3的表達有關。

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（編輯" 白永平）