河南省犬腺病毒Ⅱ型的流行情況調(diào)查及其分離鑒定

摘" 要： 旨在調(diào)查犬腺病毒Ⅱ型（canine adenovirus type 2，CAV-2）在河南地區(qū)的流行特征及變異情況，于2020—2021年，從河南省8個(gè)地區(qū)隨機(jī)采集790份犬糞便樣品，采用PCR方法開展CAV-2病原學(xué)檢測(cè)，并基于E3基因進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。同時(shí)，利用MDCK細(xì)胞分離病毒，并應(yīng)用負(fù)染透射電鏡、細(xì)胞敏感譜試驗(yàn)、紅細(xì)胞血凝譜試驗(yàn)以及理化特性分析進(jìn)一步鑒定分離毒株。結(jié)果顯示，CAV-2總陽性率為1.39%（11/790），地區(qū)、年齡和免疫情況能顯著影響CAV-2陽性率（Plt;0.05），其中周口市（3/40， 7.50%）感染率最高，6月齡內(nèi)和免疫不全的犬易感，陽性率分別為2.69%（8/297）和1.91%（10/524）；季節(jié)和犬的性別與病毒感染無顯著關(guān)系（Pgt;0.05）。11份陽性樣品測(cè)序后獲得5條序列，基于CAV-2 E3基因遺傳進(jìn)化分析表明，4條序列與國內(nèi)CAV-2 HB1株位于同一分支，1條與歐美株位于同一分支；陽性樣本經(jīng)蝕斑純化后進(jìn)行病毒鑒定，證實(shí)分離的病毒為CAV-2，命名為CAV2-HN21。本研究豐富了CAV-2分子流行病學(xué)數(shù)據(jù)，并成功分離出一株CAV-2毒株，為后續(xù)研究CAV-2的防治措施提供理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 河南地區(qū)；CAV-2；流行情況調(diào)查；病毒分離鑒定

中圖分類號(hào)：S855.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：0366-6964（2024）12-5866-07

doi： 10.11843/j.issn.0366-6964.2024.12.047

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

收稿日期：2023-10-26

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31402187）；河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目（2222102110053；92102110079）

作者簡介：郭金杰（1999-），女，河南商丘人，碩士生，主要從事小動(dòng)物疾病學(xué)研究，E-mail：18739942014@163.com

*通信作者：董海聚，主要從事小動(dòng)物疾病學(xué)研究，E-mail： dongju0528@163.com

Epidemiological Investigation and Isolation of Canine Adenovirus Type II in Henan Province

GUO" Jinjie， ZHENG" Liping， ZUO" Shoujun， SONG" Pengtao， LI" Liangliang， CHEN" Guizhen，

CHANG" Zhihai， DAI" Hongyu， LIU" Fang， DONG" Haiju*

（College of Veterinary Medicine， Henan Agricultural University， Zhengzhou 450046，" China）

Abstract：" In order to investigate the epidemic characteristics and variation of canine adenovirus type 2 （CAV-2） in Henan Province， a total of 790 dog fecal samples were randomly collected in eight regions of Henan Province from 2020 to 2021. The pathogen detection of CAV-2 was carried out by PCR method， and the genetic evolution analysis was carried out based on E3 gene. At the same time， MDCK cells were used to isolate the virus， and the isolated strain was further identified by negative staining transmission electron microscopy， cell sensitivity spectrum test， erythrocyte hemagglutination spectrum test and physical and chemical characteristics analysis. The results showed that the total positive rate of CAV-2 was 1.39% （11/790）. Region， age and immunization status could significantly affect the positive rate of CAV-2 （Plt;0.05）. Among them， Zhoukou City （3/40， 7.50%） had the highest infection rate. Dogs within 6 months old and immunocompromised were susceptible， and the positive rates were 2.69% （8/297） and 1.91% （10/524）， respectively. There was no significant relationship between season and sex of dogs and viral infection （Pgt;0.05）. Eleven positive samples were sequenced and 5 sequences were obtained. Based on the genetic evolution analysis of CAV-2 E3 gene， 4 sequences were located in the same branch as the domestic CAV-2 HB1 strain， and 1 sequence was located in the same branch as the European and American strains. The positive samples were identified by plaque purification and virus identification. It was confirmed that the isolated virus was CAV-2， named CAV2-HN21. This study enriched the molecular epidemiological data of CAV-2 and successfully isolated a CAV-2 strain， which provided a theoretical basis for the follow-up study of CAV-2 prevention and control measures.

Key words： Henan province; CAV-2; prevalence survey; virus isolation and identification

*Corresponding author：" DONG Haiju，E-mail： dongju0528@163.com

犬腺病毒（canine adenovirus，CAV）是一種無囊膜的線狀雙鏈DNA病毒，屬于腺病毒科、哺乳動(dòng)物腺病毒屬，分兩個(gè)血清型（CAV-1和CAV-2）［1］，兩者的抗原性較為接近，具有75%左右的遺傳一致性［2-4］。1925年，首次在狐貍腦炎中發(fā)現(xiàn)CAV-1，并成功分離出病毒株［5］；犬腺病毒Ⅱ型（canine adenovirus type 2，CAV-2）在1962年首次獲得，命名為Toronto A26/61毒株［6］。

CAV-2感染可誘發(fā)犬的致命性腹瀉［7］和神經(jīng)系統(tǒng)紊亂［8］，還可引起犬、狐發(fā)生傳染性氣管支氣管炎、喉氣管炎和腸炎等疾病，在全球范圍內(nèi)分布廣泛，研究證實(shí)CAV感染常見于未免疫的幼犬，病死率高［9-10］，嚴(yán)重威脅犬的生命健康。CAV-2常與其他犬上呼吸道病原菌混合感染，引起“犬窩咳”，在秋冬季發(fā)病最為明顯［11］。目前，CAV-2以預(yù)防為主，缺乏有效治療藥物，其較強(qiáng)的傳染性對(duì)犬和毛皮經(jīng)濟(jì)動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，本研究開展河南省CAV-2流行情況調(diào)查，分析當(dāng)前流行特點(diǎn)，對(duì)CAV-2的防控具有重要意義。

1" 材料與方法

1.1" 樣品采集和主要試劑

2020—2021年，在河南省多個(gè)地區(qū)隨機(jī)采集790份犬糞便樣品（表1）。TaKaRa Ex Taq、DL 2000 DNA marker和RNA/DNA提取試劑盒購自TaKaRa公司；胎牛血清購自BI公司；胰酶、DMEM和TAE購自Solarbio公司；MDCK、F8、PK、Vero、DK和BHK-21細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2" PCR檢測(cè)及序列分析

利用RNA/DNA提取試劑盒提取樣品DNA，進(jìn)行病毒E3基因的PCR擴(kuò)增。PCR引物根據(jù)參考文獻(xiàn)［4］設(shè)計(jì)。反應(yīng)條件：95℃ 5 min；95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 80 s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min。將CAV-2陽性的菌液送至上海生工生物工程有限公司測(cè)序，并在GenBank上用Blast進(jìn)行同源性序列檢索，利用DNAStar進(jìn)行分析比對(duì)，獲得合格的序列。從NCBI檢索下載代表CAV-2的可用序列，利用MEGA7.0軟件，采用鄰接算法基于CAV-2 E3基因構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹。

1.3" 病毒分離及鑒別檢測(cè)

將CAV-2陽性樣品接種于MDCK細(xì)胞，觀察細(xì)胞病變（cytopathic effect，CPE）［12］情況。傳5代后收集病毒液，PCR擴(kuò)增檢測(cè)是否感染其他犬常見病毒。CPV引物利用Primer 5根據(jù)NCBI登錄號(hào)KR002793 VP2基因保守區(qū)設(shè)計(jì)，反應(yīng)條件參照參考文獻(xiàn)［13］；犬瘟熱病毒（canine distemper virus，CDV）、犬冠狀病毒（canine coronavirus，CCoV）和犬副流感病毒（canine parainfluenza virus，CPIV）引物及反應(yīng)程序分別參照參考文獻(xiàn)［14］、［13］和［15］。

1.4" 病毒的純化及含量測(cè)定

將病毒液接種至MDCK細(xì)胞上，利用空斑純化方法進(jìn)行純化，并根據(jù)Reed-Muench法，計(jì)算TCID50。

1.5" 常規(guī)病毒學(xué)鑒定

將純化的病毒液磷鎢酸負(fù)染，透射電鏡觀察病毒形態(tài)；細(xì)胞敏感譜試驗(yàn)：將純化的病毒液分別接種于F81、Vero、DK、PK和BHK-21細(xì)胞，測(cè)定CPE細(xì)胞的TCID50；紅細(xì)胞血凝譜試驗(yàn)：將豬、雞、兔、小鼠、豚鼠、大鼠、人的“O”型血液配成0.5%紅細(xì)胞懸液，測(cè)定HA效價(jià)。

1.6" 病毒理化特性研究

參照參考文獻(xiàn)［12］的試驗(yàn)方法，將處理后的病毒液接種于MDCK細(xì)胞，測(cè)定TCID50。

1.7" 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用SPSS（version 20.0， Chicago， Illinois）軟件進(jìn)行卡方檢驗(yàn)。若Pgt;0.05，表示差異不顯著；若Plt;0.05，表示差異顯著。

2" 結(jié)" 果

2.1" PCR結(jié)果與分析

對(duì)2020—2021年河南不同地區(qū)的790份犬糞便樣品進(jìn)行基于E3基因的PCR擴(kuò)增，得到大小約為1 031 bp的目的條帶（圖略），陽性樣品有11份，河南省犬CAV-2總陽性率為1.39%，其中地區(qū)、年齡和免疫情況均能顯著影響CAV-2陽性率（Plt;0.05），其中周口市（7.50%）感染率最高，6月齡內(nèi)和免疫不全的犬易感，陽性率分別為2.69%和1.91%；季節(jié)和犬的性別與病毒感染無顯著關(guān)系（Pgt;0.05）（表2）。

2.2" CAV-2 E3基因同源性及遺傳進(jìn)化分析

本試驗(yàn)有11份樣品的條帶與CAV-2陽性條帶相符（圖1A）。經(jīng)測(cè)序，得到5個(gè)不同序列，均位于CAV-2分支，與GenBank中收錄的毒株具有較高的相似性（圖1B）。

基于CAV-2 E3基因構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹分析顯示，CAV2-HN1與CAV-2歐美株位于同一分支；其余4個(gè)與中國CAV-2 HB1株位于同一分支（圖1C）。

2.3" 病毒分離及鑒別檢測(cè)

糞便上清在MDCK細(xì)胞上盲傳至第4代時(shí)，出現(xiàn)明顯的細(xì)胞病變，細(xì)胞腫脹變圓、折光能力增強(qiáng)、呈典型“葡萄串”狀；收獲病毒液接種至MDCK細(xì)胞均穩(wěn)定出現(xiàn)上述病變（圖2A）。經(jīng)PCR擴(kuò)增，CDV、CCoV和CPIV均為陰性，僅在392和1 031 bp處存在特異性條帶（圖2B），經(jīng)測(cè)序比對(duì)確定該樣品為CPV和CAV-2混合感染。

2.4" 病毒純化及含量測(cè)定

挑選空斑進(jìn)行CAV-2和CPV鑒定，選擇只有CAV-2陽性的空斑繼續(xù)純化，成功分離出一株CAV-2，命名為CAV2-HN21株；根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算其TCID50為10-4.75。

2.5" 常規(guī)病毒學(xué)鑒定

負(fù)染透射電鏡觀察可見二十面體立體對(duì)稱、直徑約79 nm病毒樣粒子（圖2C）。病毒接種后，DK和PK細(xì)胞均出現(xiàn)CPE，TCID50為10-4.6～10-4.75，F(xiàn)81、Vero和BHK-21均未發(fā)生CPE。該病毒能使雞、大鼠和人的O型紅細(xì)胞發(fā)生凝集，HA效價(jià)分別為1∶8、1∶128和1∶512，豬、兔、小鼠和豚鼠的紅細(xì)胞未見凝集。

2.6" 理化特性鑒定

經(jīng)過熱、酸、乙醚、胰酶和5-IUDR處理后，對(duì)于MDCK細(xì)胞的TCID50分別為10-4.6、10-4.6、10-4.75、10-4.6和10-2.75。與對(duì)照組相比，經(jīng)過5-IUDR處理后分離病毒對(duì)MDCK細(xì)胞的TCID50下降對(duì)數(shù)為2，差異顯著（Plt;0.05）；乙醚、胰酶、熱和酸分別處理的病毒對(duì)MDCK細(xì)胞的TCID50下降對(duì)數(shù)小于1，差異不顯著（Pgt;0.05）。

3" 討" 論

近年來，由于CAV疫苗的普及免疫，并未出現(xiàn)大規(guī)模CAV流行，但仍有對(duì)犬感染CAV-2的報(bào)道［16］。Balboni 等［17］對(duì)意大利未免疫犬進(jìn)行檢測(cè)，CAV-2陽性率58.8%；王俊等［18］檢測(cè)了2004—2009年蘭州市疑似病犬樣品，CAV-2陽性率為19.46%；Wright等［19］對(duì)Gauteng和KwaZulu-Natal兩個(gè)省未接種CAV-2疫苗的犬進(jìn)行血清抗體檢測(cè)，陽性率分別為45%和62%。錢方等［20］對(duì)犬血清進(jìn)行CAV中和抗體調(diào)查，農(nóng)村和北京市的陽性率分別為16%和69%。本研究犬CAV-2陽性率為1.39%，低于前期報(bào)道，且犬感染CAV-2受地區(qū)影響顯著，周口市和鄭州市的CAV-2陽性率高于其它地區(qū)，作者分析這與采樣地點(diǎn)、飼養(yǎng)環(huán)境、犬主免疫意識(shí)的強(qiáng)弱和動(dòng)物年齡等因素有關(guān)。

免疫情況對(duì)犬感染CAV-2的影響顯著，未完全免疫及未免疫的犬感染率高于完全免疫的犬，說明疫苗能有效控制CAV-2的感染；但由于流行毒株及接種后抗體效價(jià)的差異性，亦或是出現(xiàn)疫苗反毒現(xiàn)象，導(dǎo)致完全免疫的犬仍有感染，為改善這一情況，應(yīng)定期免疫含本地毒株的疫苗，并檢測(cè)抗體水平。年齡對(duì)犬CAV-2的感染情況差異顯著，幼齡犬CAV-2感染率明顯高于成年犬，為降低感染風(fēng)險(xiǎn)應(yīng)盡早免疫，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，增強(qiáng)抵抗力。季節(jié)和犬的性別對(duì)犬CAV-2的感染情況影響不顯著，說明CAV-2的感染無性別差異和季節(jié)選擇性，這與張發(fā)明等［21］的結(jié)論相一致。

本研究中CAV2-HN1與CAV-2歐美株位于同一分支，說明頻繁的商品貿(mào)易促進(jìn)了病毒在不同區(qū)域的傳播，提示應(yīng)做好疫苗接種和檢疫。然而，本研究僅分析了基于E3區(qū)的序列，因此，需要進(jìn)一步的研究以補(bǔ)充更多的序列數(shù)據(jù)，以便更深入地了解河南省不同地區(qū)CAV-2的流行情況。

本研究成功分離純化出一株CAV-2，并命名為CAV2-HN21，常規(guī)病毒學(xué)鑒定均符合腺病毒的特征，理化特性結(jié)果表明該毒株對(duì)乙醚、胰酶、熱和酸有一定的抵抗力，符合無囊膜病毒的特點(diǎn)，此研究結(jié)果與其他學(xué)者的結(jié)果［17］一致。多項(xiàng)鑒定結(jié)果證明成功分離出的病毒為CAV-2，以期為河南省進(jìn)一步研究CAV-2的變異情況和防治研究提供參考。

4" 結(jié)" 論

本研究調(diào)查了2020—2021年河南省8個(gè)地區(qū)的犬CAV-2流行情況，基于E3基因進(jìn)行了遺傳進(jìn)化分析，并成功分離出一株CAV-2毒株，命名為CAV2-HN21。

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（編輯" 白永平）