六味地黃湯調控TGF-β及Smad家族蛋白表達對腎間質纖維化的影響研究

〔摘要〕 目的 探究六味地黃湯抑制腎間質纖維化（renal interstitial fibrosis， RIF）的干預作用及機制。方法 將30只SPF級SD大鼠隨機均分為假手術組、模型組、陽性藥物組、中藥高劑量組和中藥低劑量組，每組6只。除假手術組外，其余各組采用左側輸尿管結扎術制備RIF模型。造模結束后，假手術組和模型組予以蒸餾水灌胃，陽性藥物組予以醋酸潑尼松片0.2 mg/kg灌胃，中藥低、高劑量組分別予以六味地黃湯0.5、1 mg/kg灌胃，療程為21 d。治療結束后，采用HE染色法評估腎間質損傷，Masson染色法檢測腎間質膠原蛋白沉積和纖維化，RT-PCR測定腎間質轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1， TGF-β1）、針對半身不遂同源物2的重組母體（recombinant mothers against decapentaplegic homolog 2， Smad2）、Smad3、Smad7的mRNA表達，Western blot測定腎間質TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7的蛋白表達。結果 與假手術組相比，模型組的病理呈現系膜增生、間質增寬、膠原蛋白大面積沉積和明顯纖維化，且TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7的mRNA和蛋白表達均增加（Plt;0.05）。與模型組相比，陽性藥物組和中藥低、高劑量組的病理表現均減輕，且TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7的mRNA和蛋白表達均降低（Plt;0.05）。與中藥低劑量組相比，陽性藥物組和中藥高劑量組的TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7的mRNA和蛋白表達均降低（Plt;0.05）。結論 六味地黃湯能夠減輕RIF大鼠的腎間質纖維化程度，且高劑量效果更佳，其機制可能與調控TGF-β及Smad家族蛋白表達有關。

〔關鍵詞〕 六味地黃湯；腎間質纖維化；終末期腎病；腎間質損傷；TGF-β；Smad家族蛋白

〔中圖分類號〕R285.5" " " " " 〔文獻標志碼〕A" " " " " 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.07.001

Effects of Liuwei Dihuang Decoction on renal interstitial fibrosis by regulating the expressions of TGF-β and Smad family proteins

CAI Yahong， LIU Linquan， FENG Jin， CAI Zheyi， CHEN Juan， LI Sha， XIONG Dan*

The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To explore the intervention effects and mechanism of Liuwei Dihuang Decoction （LWDHD） on inhibiting renal interstitial fibrosis （RIF）. Methods A total of 30 SPF SD rats were randomly divided into sham-operated group， model group， positive drug group， high- and low-dose Chinese medicines groups， with six rats in each group. Except for the sham-operated group， all other groups were prepared with left ureteral ligation to establish RIF models. After modeling， the sham-operated group and model group were given distilled water by gavage， the positive drug group was given acetic acid prednisone tablets 0.2 mg/kg by gavage， and the high- and low-dose Chinese medicines groups were given LWDHD 1 mg/kg and 0.5 mg/kg by gavage， respectively， for a treatment course of 21 d. After treatment， renal interstitial injury was evaluated by HE staining， and renal interstitial collagen deposition and fibrosis were measured by Masson staining. The mRNA expressions of transforming growth factor-β1 （TGF-β1）， recombinant mothers against decapentaplegic homolog 2 （Smad2）， Smad3， and Smad7 were determined by RT-PCR. The protein expressions of TGF-β1， Smad2， Smad3， and Smad7 in the renal interstitium were determined by Western blot. Results Compared with the sham-operated group， the model group exhibited pathological features of mesangial proliferation， interstitial widening， and extensive collagen deposition and obvious fibrosis， as well as elevated mRNA and protein expressions of TGF-β1， Smad2， Smad3， and Smad7 （Plt;0.05）. Compared with the model group， the positive drug group， low- and high-dose Chinese medicines groups showed alleviated pathological changes， as well as a decrease in the mRNA and protein expressions of TGF-β1， Smad2， Smad3， and Smad7 （Plt;0.05）. Compared with the low-dose Chinese medicines group， the mRNA and protein expressions of TGF-β1， Smad2， Smad3， and Smad7 in the positive drug group and the high-dose Chinese medicines group decreased （Plt;0.05）. Conclusion LWDHD can reduce renal interstitial fibrosis in RIF rats， with higher doses exhibiting more pronounced effects. The mechanism may be related to the regulation of TGF-β1 and Smad family protein expression.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 Liuwei Dihuang Decoction; renal interstitial fibrosis; end-stage renal disease; renal interstitial injury; TGF-β; Smad family protein

慢性腎臟病（chronic kidney disease， CKD）是臨床常見的腎臟疾病，也是終末期腎病（endstage renal disease， ESRD）的首要原因[1]。隨著生活節奏加快和飲食結構改變，CKD患病人數呈逐年增加趨勢[2]。腎小球硬化和腎間質纖維化（renal interstitial fibrosis， RIF）是CKD向ESRD進展的特征性病理改變[3]，RIF更是CKD患者腎功能喪失最為顯著的病理機制[4]。因此，CKD臨床治療的關鍵是減緩或逆轉RIF進展[5]。然而，由于缺乏規范化的治療方案和理想的治療藥物，CKD的治療并不樂觀，其預后往往較差[2]。臨床亟須一種能夠減緩或逆轉RIF進展的新型治療策略，因此，探索RIF的相關靶點和新型藥物是現階段CKD研究的重點與熱點。

RIF歸屬于中醫學“水腫”“腰痛”“癃閉”“虛勞”等范疇[6]。中醫理論認為，腎陰虧虛、濕濁阻滯是貫穿RIF全程的核心病機，臨證用藥當以滋補腎陰、利濕泄濁為基本治則[7]，方用六味地黃湯加減。六味地黃湯在多年的臨床實踐中展現出了可觀的療效和安全性，但尚不明確其作用機制[8-9]。轉化生長因子-β（transforming growth factor-β， TGF-β）及Smad家族蛋白調控的細胞外基質（extracellular matrix， ECM）代謝及肌成纖維細胞生成是RIF的重要環節，這可能是六味地黃湯抑制RIF進展的潛在機制[10]。因此，該研究以TGF-β及Smad家族蛋白調控作用為切入點，探究六味地黃湯治療RIF的作用效果和內在機制，旨在為六味地黃湯在臨床應用提供循證證據。

1 材料與方法

1.1" 實驗動物

50只健康SPF級SD大鼠雌雄各半，6～7周齡，體質量180～200 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，實驗動物許可證號：SCXK（湘）2013-0004，合格證號：43004700024725。50只SD大鼠被隨機分為假手術組、模型組、陽性藥物組和中藥高、低劑量組，每組10只。進行實驗前予以7 d適應性喂養，自由攝食與飲水，實驗全程按照動物倫理學標準進行（湖南中醫藥大學第一附屬醫院動物倫理批準號：2020JJA140143）。

1.2" 實驗藥物

六味地黃湯中藥材購于湖南中醫藥大學第一附屬醫院中藥房，使用劑量參考課題組前期研究[11]，具體藥物組成為：熟地黃24 g，山茱萸12 g，干山藥12 g，澤瀉12 g，茯苓9 g，牡丹皮6 g。上述中藥材經純凈水浸泡1 h后由本院制劑室根據人等效劑量進行水煎濃縮為浸膏劑，使其終濃度為1.0 g/mL，置于常溫下陰涼處儲存。醋酸潑尼松片（山東魯抗醫藥集團賽特有限責任公司生產，國藥準字H20033023），規格：5 mg/片，批號：20220912）。

1.3" 主要試劑與儀器

TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7抗體（美國Cell Signaling Technology公司，批號：20230407、20230211、20230510、20230313；PBS緩沖液（美國Hyclone公司，批號：BS20230519）。

光學顯微鏡（日本奧林匹斯公司，型號：8344-Ⅱ）；熒光PCR板（美國賽默飛世爾科技公司，型號：66347-A）；電動搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司，型號：IX73）；轉膜儀（美國賽默飛世爾科技公司，型號：XIII-23）。

1.4" RIF大鼠模型的建立

參考RIF動物模型經典制備方法[12]，具體為：大鼠適應性飼養7 d后，術前禁食不禁水1 d，使用0.3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉SD大鼠；待麻醉成功后，脫毛機除去左腎腹腰部腎區鼠毛，用聚維酮碘消毒皮膚3遍，鋪上無菌手術巾，在左側腎區切口；暴露腎臟，切除5/6腎，沿腎臟腎門找到半透明輸尿管，鈍鑷分離，將分離出的輸尿管兩端用4號線結扎，之后納于原位；逐一縫合切口，傷口消毒，連續3 d腹腔注射青霉素注射液0.8萬U/kg預防感染；造模后第7天隨機選取3只大鼠取腎臟組織行HE染色，見腎間質炎癥、腎小管擴張、上皮細胞空泡化，即視為造模成功。假手術組：大鼠打開腹腔后分離左側輸尿管但不結扎，然后逐層縫合切口關閉腹腔，具體操作同前。

1.5" 動物給藥

各組均于造模后第2天開始給藥。假手術組與模型組大鼠予以蒸餾水按照2 mL/100 g體質量灌胃。陽性藥物組予醋酸潑尼松片人等效劑量（0.2 mg/kg）溶液按照2 mL/100 g灌胃。給藥劑量按照成年人體質量60 kg每天30 mL計算，經體表面積折算，中藥低、高劑量組分別予以濃度0.5、1 mL/kg的等劑量溶液按照2 mL/100 g灌胃。以上各組每天灌胃1次，參照前期研究[12]給藥時間均連續給藥8周。

1.6" 取材方法

藥物干預結束后，斷頸處死大鼠，將左側腎組織行冠狀切面：一部分浸入10%中性福爾馬林中固定48 h；用于行HE及Masson染色檢查；另一部分立即置于-80 ℃冰箱，用于行Western blot及RT-PCR測定。

1.7" 指標檢測

1.7.1" HE染色觀察大鼠腎臟組織形態與病理" 完整取出各組大鼠的腎臟組織進行形態觀察；將左側腎組織行冠狀切面，一部分浸入10%中性福爾馬林中固定48 h，常規梯度乙醇脫水，石蠟包埋，行HE染色進行病理觀察。

1.7.2" Masson 染色觀察腎間質膠原蛋白沉積及纖維化情況" 取材及石蠟包埋按“1.7.1”步驟進行，并通過觀察 Masson 染色切片考察腎間質膠原蛋白沉積及纖維化情況，藍色為膠原纖維著色。

1.7.3" RT-PCR檢測腎間質TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7的mRNA表達" 鏡下篩選腎間質，根據TRIzol說明書提取各組大鼠腎間質組織進行總RNA提取，提取大鼠腎間質總RNA，逆轉錄為cDNA，特異性擴增TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7，使用β-actin為內參。反應條件為95 ℃，10 min變性；95 ℃，15 s；60 ℃，60 s；40次循環。采用2-△△Ct方法計算各蛋白的mRNA表達量，引物序列詳見表1。

1.7.4" Western blot檢測腎間質TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7的蛋白表達" 取腎臟組織，提取組織總蛋白，經凝膠電泳后將蛋白置于PVDF膜，5%脫脂奶粉完全封閉孵育60 min，添加一抗抗體，4 ℃環境下靜置12 h，棄去一抗，TBST洗膜3次，每次5 min。室溫孵育二抗2 h，洗滌后棄去二抗，TBST洗膜3次，每次5 min。顯色后以β-actin作為內參，計算各蛋白的灰度比值。

1.8" 統計學分析

采用SPSS 23.0軟件進行數據分析。本研究數據以“ｘ±s”描述，均進行正態分布以及方差齊性檢驗，組間比較滿足正態性者，采用單因素方差分析，方差齊時選擇LSD法，方差不齊采用Tamhanes' T2法，非正態分布采用秩和檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1" 各組大鼠的腎臟形態

研究期間無大鼠死亡。觀察各組大鼠腎臟形態，可見：假手術組大鼠左腎臟形態完整，色澤紅潤且表面光滑；模型組大鼠左腎體積明顯增大，表面顆粒化嚴重，顏色灰白且缺血，剖開后可見腎內有大量積液潴留，腎皮質明顯變薄，皮髓質界限不清晰；陽性藥物組和中藥低、高劑量組大鼠左腎改變相對模型組較輕，但腎表面仍呈現缺血狀態。詳見圖1。

2.2" 各組大鼠腎臟的HE、Masson染色結果

HE染色結果顯示，假手術組大鼠腎小球形態規則，腎小管結構排列整齊，無系膜增生，間質正常，未見炎性細胞浸潤；模型組大鼠可見系膜增生，腎小管擴張或萎縮，腎小球硬化且形態不規則，球囊粘連，間質增寬，可見炎性細胞浸潤；陽性藥物組和中藥低、高劑量組大鼠腎小管擴張或萎縮減輕，炎性細胞減少，病變減輕。詳見圖2。

Masson染色結果顯示，假手術組大鼠腎間質組織僅有少量膠原蛋白沉積，未見腎間質纖維化，膠原染色呈藍色；模型組大鼠腎間質組織有膠原蛋白大面積沉積，存在明顯的纖維化；陽性藥物組和中藥低、高劑量組大鼠腎間質組織中膠原蛋白沉積及纖維化得到了不同程度的改善。詳見圖2。

2.3" 各組大鼠的腎間質TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7的mRNA表達

與假手術組相比，模型組大鼠的腎間質TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7的mRNA表達增加（Plt;0.05）；與模型組相比，陽性藥物組和中藥低、高劑量組大鼠的腎間質TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7的mRNA表達降低（Plt;0.05）；與陽性藥物組和中藥高劑量組相比，中藥低劑量組的TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7的mRNA表達均增加（Plt;0.05）。詳見表2。

2.4" 各組大鼠的腎間質TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7的蛋白表達

與假手術組相比，模型組大鼠的腎間質TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7的蛋白表達增加（Plt;0.05）；與模型組相比，陽性藥物組、中藥低劑量組、中藥高劑量組大鼠的腎間質TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7的蛋白表達降低（Plt;0.05）；與陽性藥物組和中藥高劑量組相比，中藥低劑量組的TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7的蛋白表達均增加（Plt;0.05）。詳見表3、圖3。

3 討論

RIF歸屬于中醫學“水腫”“腰痛”“癃閉”“虛勞”等范疇[6]，腎陰虧虛、濕濁阻滯是貫穿其全程的核心病機[7]。一方面，腎陰虧虛是指腎臟本身的陰液不足，導致機體失去平衡。腎臟是主要的生殖和排泄器官，同時也是人體的先天之根，其為人體提供精、血、津、液，掌管生長發育、繁衍后代等重要功能。腎陰虧虛會影響腎臟的正常功能，導致腎臟不能正常調節水分代謝，進而引起腎間質的水腫和纖維化。另一方面，濕濁阻滯是指機體內濕氣和毒素積聚，阻塞了氣血的正常循環。濕邪可以從外部進入，也可以由內部產生，主要表現為水腫、厭油、黏膩、困倦等癥狀。濕邪阻滯經絡，使得氣血運行不暢，進而導致腎間質的水腫和纖維化。因此，臨證用藥需以滋補腎陰、利濕泄濁立法，方用六味地黃湯加減。方中，熟地黃甘溫，有補腎填精、滋陰養血之用，為治腎陰虛之要藥；山茱萸甘溫，有滋補肝腎、固攝腎精之功；山藥甘平，有平補肺脾腎氣陰之效。三藥合用，共填腎精，以養元陰。茯苓淡平，利水滲濕、健脾寧心；澤瀉淡寒，利濕泄濁，兼以瀉熱；牡丹皮苦寒，活血祛瘀、以瀉濁瘀。三藥合用，共泄濕濁，以除留邪。上六味合用，共為滋補腎陰、利濕泄濁之用，使腎陰得養、濕濁得除，則RIF向愈。因此，六味地黃湯的理法方藥與RIF的中醫病機相契合，是一種治療RIF的潛在策略。本研究結果顯示，經左側輸尿管結扎術的大鼠出現了典型的RIF病理表現，呈現出系膜增生、間質增寬、膠原蛋白大面積沉積和明顯的纖維化，提示RIF模型制備成功。與模型組相比，六味地黃湯中藥低、高劑量組的RIF病理改變顯著減輕，表明六味地黃湯具有減輕RIF進展的潛力。

RIF是現階段的臨床難題，其受多個因素如氧化應激、炎性反應、血管生成、細胞外基質沉積、成纖維細胞及結締組織增生、瘢痕形成等的影響[12]。RIF形成機制較為復雜，其具體機制尚未完全闡明。董翔等[13]研究發現，RIF多數與ECM合成增多或降解減少密切相關。ZHU等[14]研究顯示，CKD患者的腎小管上皮細胞能夠表達肌成纖維細胞的特征性標志物α-平滑肌動蛋白，并且腎小管上皮細胞能夠在特定條件下轉化為肌成纖維細胞。相關研究表明，CKD患者的腎小管上皮細胞發生上皮-間質細胞轉分化是RIF發生的關鍵生物學過程，而該過程與TGF-β1存在極為密切的聯系[15-16]。目前的研究普遍認為，TGF-β1是誘發纖維細胞產生膠原、纖維連接蛋白和糖蛋白的最重要的蛋白之一，早期實驗研究也證實，TGF-β1是RIF發生和發展過程中的關鍵蛋白[17]。在本研究中，六味地黃湯可明顯抑制TGF-β1的表達水平，從而改善RIF的進展。此外，HEBERT等[18]研究發現，TGF-β1通過激活其下游信號分子Smad2/3，抑制Smad7來實現其調節腎纖維化的生物學效應。PARKER等[19]研究表明，Smad可通過TGF-β途徑加速RIF的發生發展，在各種因素的作用下激活Smad蛋白，直接或間接激活TGF-β及Smad家族蛋白。Smad7是RIF的雙刃劍，一方面其活化可加速RIF的發生[20]，另一方面其過表達又可阻斷Smad2/3活化，進而緩解各種促纖維化因素所致的RIF[21]。因此，TGF-β1及Smad家族蛋白與RIF的發生和發展密切相關，該通路可能是RIF藥物治療的切入點。本研究結果顯示，與假手術組相比，模型組的TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7的mRNA和蛋白表達顯著增加，提示RIF的發生與TGF-β及Smad家族蛋白的激活有關。與模型組相比，六味地黃湯中藥低、高劑量組的TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad7的mRNA和蛋白表達顯著降低，表明六味地黃湯具有抑制TGF-β及Smad家族蛋白表達的作用，這可能是其減輕RIF進展的機制。本研究結果證實，六味地黃湯通過調控TGF-β及Smad家族蛋白表達改善RIF預后的作用，為護理實踐提供了新的思路和方法。一方面，六味地黃湯作為一種傳統中藥方劑，具有被廣泛用于腎臟疾病臨床治療的潛力，這為醫護提供了一個新的藥物選擇，可以結合現有的治療方案，幫助RIF患者延緩疾病的發展并改善腎功能。另一方面，RIF是一個復雜的生物學過程，涉及多個細胞和分子的相互作用，通過研究六味地黃湯調控TGF-β及Smad家族蛋白表達的機制，醫護人員可以更好地理解腎間質纖維化的發生發展過程。這有助于護理人員提前識別患者的風險因素，并采取針對性的干預措施，以減緩纖維化的進展，保護患者的腎功能。此外，該研究也提醒護理人員注重中醫藥在腎病治療中的潛力。六味地黃湯作為中藥方劑，具有調節多個靶點的特點，可以綜合調理機體的整體狀態，從而對腎臟疾病產生綜合效應。在臨床實踐中，護理人員可以與中醫師密切合作，根據患者的具體情況，制定個性化的中西醫結合治療方案，以達到最佳的護理效果。

綜上所述，六味地黃湯能夠減輕RIF模型大鼠的腎間質纖維化程度，其機制可能與調控TGF-β及Smad家族蛋白有關。六味地黃湯可能是一種潛在的RIF治療策略，未來需要有更多的研究探索六味地黃湯的臨床應用價值。

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