六味地黃湯對阿霉素腎病小鼠尿蛋白及腎小球p-p38 MAPK、α-actinin-4、synaptopodin的影響

〔摘要〕 目的 探討六味地黃湯對阿霉素腎病（adriamycin nephropaghy， ADRN）小鼠尿蛋白的干預作用及可能機制。方法 30 只SPF級雄性C57BL/6小鼠隨機選取5 只為空白組，余下小鼠以單次尾靜脈注射阿霉素（0.01 g·kg-1）復制ADRN模型，2 周后將造模成功的小鼠隨機分為模型組、貝那普利組及低、中、高劑量六味地黃湯組，每組5 只。空白組、模型組予等體積注射用水灌胃，貝那普利組予0.0013 g·kg-1貝那普利灌胃，低、中、高劑量六味地黃湯組分別予9.75、19.5、39 g·kg-1六味地黃湯灌胃，每日1次，連續8周。自動生化儀檢測小鼠24 h尿蛋白定量、血清白蛋白、血清肌酐、血清鉀；HE染色法、電鏡觀察小鼠腎臟病理改變及足突形態；免疫組織化學法、Western bolt檢測小鼠腎臟磷酸化p38 MAPK（phosphorylated p38 MAPK， p-p38 MAPK）、α-輔肌動蛋白-4（α-actinin-4）、突觸孔蛋白（synaptopodin）的表達；RT-PCR檢測小鼠腎臟α-actinin-4、synaptopodin mRNA表達。結果 與空白組比較，模型組小鼠體質量、24 h尿量、血清白蛋白降低，24 h尿蛋白定量升高（P＜0.05）；腎小球系膜細胞增生，部分系膜區擴大、腎小管蛋白管型，間質可見炎性細胞浸潤，足突廣泛融合；α-actinin-4蛋白及mRNA、p-p38 MAPK蛋白表達升高（P＜0.05），synaptopodin蛋白及mRNA表達降低（P＜0.05）。與模型組比較，各干預組病理改變及足突融合均得到不同程度改善，貝那普利組及中、高劑量六味地黃湯組24 h尿蛋白定量減少，高劑量六味地黃湯組p-p38 MAPK蛋白表達降低（P＜0.05），低、中、高劑量六味地黃湯組synaptopodin蛋白及mRNA表達均升高（P＜0.05）。貝那普利組及低、中、高劑量六味地黃湯組組間比較，各指標差異無統計學意義（P＞0.05）。結論 六味地黃湯可能通過抑制p38 MAPK通路活化和上調α-actinin-4、synaptopodin蛋白及mRNA表達，改善腎臟病理及足突融合，減輕足細胞損傷，減少ADRN小鼠尿蛋白。

〔關鍵詞〕 阿霉素腎病；六味地黃湯；尿蛋白；p-p38 MAPK；α-輔肌動蛋白-4；突觸孔蛋白

〔中圖分類號〕R285.5" " " " "〔文獻標志碼〕A" " " " " 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.07.002

Effects of Liuwei Dihuang Decoction on urine protein and glomerular

p-p38 MAPK， α-actinin-4， and synaptopodin in mice with

adriamycin nephropathy

XU Wenfeng1*， HE Zeyun1， LI Xuhua1， SUN Li3， TANG Qun2， PENG Yajun1， CHEN Haiying1

1. The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410007， China; 2. Hunan University of Chinese

Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 3. Yinchuan Traditional Chinese Medicine Hospital， Yinchuan， Ningxia 750000， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To investigate the intervention effects of Liuwei Dihuang Decoction （LWDHD） on urine protein in mice with adriamycin nephropathy （ADRN） and its possible mechanism. Methods Five of 30 SPF-grade male C57BL/6 mice were randomly selected as the blank group， and the remaining mice were injected with adriamycin （0.01 g·kg-1） via the tail vein to replicate the ADRN model. Two weeks later， the successfully modeled mice were randomized into the model group， the benazepril group， and the low-， medium-， and high-dose LWDHD groups， with 5 mice in each group. The blank and model groups were given an equal volume of water for injection by gavage. The benazepril group was given 0.001 3 g·kg-1 benazepril by gavage， while the low-， medium-， and high-dose LWDHD groups were given 9.75， 19.5， and 39 g·kg-1 LWDHD by gavage respectively， once a day for 8 consecutive weeks. Automatic biochemical analyzer was used to check the 24-hour urine protein quantification， and the serum levels of albumin， creatinine， and potassium in mice. HE staining and electron microscopy were used to observe renal pathological changes and foot process morphology. Immunohistochemistry and Western blot were used to examine the expressions of phosphorylated p38 MAPK （p-p38 MAPK）， α-actin-4， and synaptopodin proteins in mice kidneys. RT-PCR was used to examine the expressions of α-actin-4 and synaptopodin mRNA in mice kidneys. Results Compared with the blank group， the body weight， 24-hour urine volume， and serum albumin level of the model group decreased， while the 24-hour urine protein quantification increased （Plt;0.05）; hyperplasia of glomerular mesangial cells， partial mesangial area expansion， renal tubular protein casts， and interstitial inflammatory cell infiltration were observed， with extensive fusion of foot processes; the expressions of α-actinin-4 protein and mRNA， and p-p38 MAPK protein increased （Plt;0.05）， while the expressions of synaptopodin protein and mRNA decreased （Plt;0.05）. Compared with the model group， the pathological changes and foot process fusion in each intervention group were improved to varying degrees. The quantitative reduction of 24-hour urine protein was observed in the benazepril group as well as the medium- and high-dose LWDHD groups. The expression of p-p38 MAPK protein decreased in the high-dose LWDHD group （Plt;0.05）， while the expressions of synaptopodin protein and mRNA increased in the low-， medium-， and high-dose LWDHD groups （Plt;0.05）. There was no statistically significant difference in various indicators among benazepril group and the low-， medium-， and high-dose LWDHD groups （Pgt;0.05）. Conclusion LWDHD may relieve renal pathological changes and foot process fusion， alleviate foot cell damage， and reduce urine protein in mice with ADRN， by inhibiting the activation of the p38 MAPK pathway and upregulating the protein and mRNA expressions of α-actin-4 and synaptopodin.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 Liuwei Dihuang Decoction; proteinuria; p-p38 MAPK; α-actinin-4; synaptopodin

世界衛生組織《2019年全球衛生估計報告》，全球十大死亡原因排序，腎臟疾病已從2000年世界第13位上升至第10位，預計2040年腎臟疾病將成為全球第五大死因。蛋白尿是慢性腎臟病（chronic kidney disease， CKD）的常見臨床表現，也是CKD進展的獨立危險因素之一，足細胞損傷是其發生的核心環節[1-2]。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases， MAPKs）亞家族p38 MAPK通路的活化與足細胞損傷、足突融合和蛋白尿的發生相關[3]，磷酸化p38 MAPK （phosphorylated p38 MAPK， p-p38 MAPK）是p38 MAPK信號通路中的關鍵分子。α-輔肌動蛋白-4（α-actinin-4）、突觸孔蛋白（synaptopodin）是重要的足細胞骨架蛋白，兩者表達異常參與足突融合介導的足細胞損傷。

中醫學無“蛋白尿”論述，多數學者認為蛋白質屬精微物質，“腎主封藏”理論源于《素問·六節藏象論》，其中載：“腎者，主蟄，封藏之本，精之處也，故腎主藏精，宜藏不宜泄”。足細胞損傷與腎失封藏均可見蛋白尿，本課題組認為足細胞是“腎失封藏、精微外泄”的微觀結構基礎。六味地黃湯滋陰補腎，是臨床治療慢性腎臟病的有效方劑，課題組前期研究顯示其可降低腎病模型大鼠蛋白尿水平。目前，從p38 MAPK通路活化及足細胞骨架蛋白角度研究六味地黃湯減輕尿蛋白的研究相對較少，本研究擬從足突融合角度觀察六味地黃湯對足細胞損傷的干預作用，初步探討六味地黃湯減少阿霉素腎病（adriamycin nephropathy， ADRN）小鼠尿蛋白的分子機制。

1 材料

1.1" 動物

30只SPF級雄性C57BL/6小鼠，4～6 周，體質量27～35 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（湘）2019-0004，飼養于湖南中醫藥大學第一附屬醫院實驗動物中心SPF級小鼠動物房，每籠5只，普通飼料喂養，自由飲水，隔日更換墊料。本實驗經湖南中醫藥大學第一附屬醫院實驗動物倫理委員會批準（編號：ZYFY20180616-07），符合實驗動物福利與倫理原則。

1.2" 主要藥物與試劑

六味地黃湯超微顆粒（熟地黃24 g，山藥12 g，山茱萸12 g，澤瀉9 g，茯苓9 g，牡丹皮9 g）購于湖南中醫藥大學第一附屬醫院門診中藥房。注射用水加熱后溶解中藥超微顆粒，水浴恒溫器濃縮1.5 g·mL-1（每毫升藥液含生藥1.5 g），離心后高壓滅菌，4 ℃冷藏備用。注射用鹽酸多柔比星（阿霉素，深圳萬樂藥業有限公司，10 mg/支）購自湖南中醫藥大學第一附屬醫院門診西藥房，1支溶解于注射用水5 mL中，每毫升藥液含2 mg阿霉素。貝那普利片劑（上海新亞藥業閔行有限公司，10 mg/片）購自湖南中醫藥大學第一附屬醫院門診西藥房。蘇木精（貨號：H8070，北京索萊寶科技有限公司）；曙紅Y[醇溶，貨號：A600190，生工生物工程（上海）股份有限公司]；p-p38 MAPK（貨號：WL03428，沈陽萬類生物科技有限公司）；α-actinin-4（貨號：Bs-1741R，北京博奧森生物技術有限公司）；synaptopodin（貨號：WL04397，沈陽萬類生物科技有限公司）；HRP標記山羊抗兔IgG（貨號：#31460，賽默飛世爾科技公司）；DAB顯色液（貨號：DAB-1031，福州市邁新生物技術開發公司）；全蛋白提取試劑盒（貨號：WLA019，沈陽萬類生物科技有限公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（貨號：WLA004，沈陽萬類生物科技有限公司）；β-actin（貨號：WL01372，沈陽萬類生物科技有限公司）等。

1.3" 主要儀器

QH01-9030A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；RM22354型石蠟切片機（德國萊卡公司）；7170型自動化分析儀、H-600型透射電鏡（日本日立公司）；NW10LVF型超純水系統（力康生物醫療科技控股有限公司）；H-2050R型超速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；Exicycler 96型熒光定量PCR儀（韓國BIONEER公司）；DYY-7C型電泳儀、DYCZ-40D型電泳槽、WD-9413B型凝膠成像系統（北京六一生物科技有限公司）；ELX-800型酶標儀（美國伯騰儀器有限公司）；BX53型顯微鏡、DP73型顯微鏡拍照系統（日本奧林巴斯公司）。

2 方法

2.1" 動物分組及造模

30只SPF級雄性C57BL/6小鼠適應性喂養1 周，棄去尿蛋白試紙陽性小鼠，以體質量編號，采用隨機數字表法分為空白組（5只，不做處理）、造模組（25只，尾靜脈注射阿霉素）。2周后將造模成功小鼠分為模型組、貝那普利組、低劑量六味地黃湯組（低六味組）、中劑量六味地黃湯組（中六味組）及高劑量六味地黃湯組（高六味組），每組5只。

ADRN小鼠模型的制備參考前期工作基礎[4]：以溫水紗布包裹造模組小鼠的鼠尾45 s，再以75%乙醇反復擦拭小鼠尾靜脈，消毒并使其充盈，以0.01 g·kg-1劑量一次性尾靜脈注射阿霉素，注射后快速抽出針頭，無菌紗布按壓針孔少許，防止藥液外滲，2 周后小鼠尿蛋白試紙陽性為模型復制成功。

2.2" 動物給藥

參照《中藥藥理研究方法學》[5]中動物與人體表面積等效劑量比值表，根據60 kg成人的用量，結合“小鼠藥量=成人劑量×0.0026”、臨床藥量及預實驗結果換算出小鼠等效劑量，貝那普利組（0.001 3 g·kg-1）及低、中、高六味組（9.75、19.5、39 g·kg-1），空白組、模型組以等體積注射用水灌胃，每日1次，連續灌胃8周。8周末將小鼠放入代謝籠，收集24 h尿液，稱重，以3%戊巴比妥鈉麻醉小鼠后心臟取血，分離血清-20 ℃凍存，腎臟標本-80 ℃凍存。

2.3" 指標檢測及方法

2.3.1" 觀察小鼠的一般情況" 觀察小鼠精神狀態、活動度、體質量、尿量、糞便性狀、背毛色澤等。

2.3.2" 檢測小鼠血、尿生化指標" 小鼠血液、尿液標本以自動化分析儀檢測24 h尿蛋白定量、血清白蛋白、腎功能、血鉀等。

2.3.3" HE染色法觀察小鼠腎組織形態學改變" 腎組織以4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋，腎組織切片脫蠟至水，依次進行蘇木精染色、伊紅染色、脫水封片，光鏡下觀察拍照，選擇視野觀察腎小球、腎小管、腎間質等形態及腎間質有無炎性細胞浸潤。

2.3.4" 透射電鏡觀察小鼠足細胞足突超微結構" 取新鮮腎皮質組織剪成1 mm3的組織塊，4 ℃ 2.5%戊二醛固定2 h，0.1 mol·mL-1磷酸緩沖液PBS（pH=7.4）漂洗3次，1%鋨酸室溫固定2 h，然后依次脫水、滲透、包埋、切片、染色后透鏡下觀察足細胞足突超微結構。

2.3.5" 免疫組織化學法檢測腎臟p-p38 MAPK、α-actinin-4、synaptopodin蛋白陽性表達" 腎組織蠟塊切片，厚度約4 μm，依次脫蠟至水，抗原熱修復、3%過氧化氫孵育后滴加1% BSA，室溫孵育15 min，一抗以1% PBS按1∶100稀釋，濕盒內4 ℃過夜，HRP標記二抗以1% PBS按1∶500稀釋，濕盒內37 ℃孵育60 min，DAB顯色、蘇木素復染，中性樹膠封片后顯微鏡下觀察、拍照，Image J 軟件分析積分光密度值（IOD），計算面積（Area），以IOD/Area表示蛋白陽性表達情況。

2.3.6" RT-PCR法檢測腎臟α-actinin-4、synaptopodin mRNA表達" 按照試劑盒說明抽提腎組織總RNA，紫外分光光度計NANO 2000測定各樣本中RNA的濃度，按照試劑盒說明將總RNA反轉錄為cDNA，將cDNA模板加入反應體系，反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸15 s，共40個循環，ExicyclerTM 96熒光定量儀進行熒光定量分析，本實驗分析方法利用2-△△CT法。引物序列詳見表1。

2.3.7" Western blot法檢測腎臟p-p38 MAPK、α-actinin-4、synaptopodin蛋白表達水平" 腎皮質剪碎后放入勻漿器，加入組織蛋白裂解液，冰上勻漿5 min，轉入離心管，4 ℃、12 000 r/min離心10 min得到蛋白提取液，BCA法測定蛋白濃度，取40 μg蛋白，根據目的蛋白分子量大小選用對應濃度的聚丙烯酰胺凝膠，本次實驗濃縮膠濃度為5%，分離膠濃度為8%、12%，將蛋白轉移至PVDF膜上，TBST緩沖液配制5%（M/V）脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入稀釋后的一抗[p-p38 MAPK（1∶500）、synaptopodin（1∶500）、α-actinin-4（1∶1 000）、β-actin（1∶1 000）]，4 ℃孵育過夜，次日孵育一抗后的PVDF膜從雜交袋中取出，浸入TBST中，搖床搖動5 min，重復4 次，加入二抗（羊抗兔IgG-HRP，1∶5 000）37 ℃孵育45 min，孵育二抗后的PVDF膜從雜交袋中取出，浸入TBST中，搖床搖動5 min，重復6次，ECL底物發光，將膠片進行掃描，凝膠圖象處理系統（Gel-Pro-Analyzer軟件）分析目標條帶的光密度值，以β-actin為內參對照，計算目的蛋白相對表達，統計分析。

2.4" 統計學方法

采用SPSS 22.0進行統計處理。計量資料符合正態分布和方差齊性者，用“ｘ±s”表示，多組間比較用單因素方差分析，組間比較用LSD檢驗，不符合正態性和方差齊性者用Tamhane's T2檢驗，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1" 各組小鼠一般情況比較

尾靜脈注射阿霉素2 d后，小鼠相繼出現團縮、腹瀉、脫毛、爛尾、飲食飲水減少等，1周后逐漸改善，2周后可見部分ADRN小鼠陰囊水腫，空白組未出現上述情況。灌胃4周，ADRN小鼠活躍度減低，喜團縮、拱背，墊料氣味穢濁，脫毛明顯，飲食飲水減少；灌胃8周，ADRN小鼠倦怠，形體消瘦，扎堆團縮。

3.2" 各組小鼠體質量、24 h尿量及血、尿生化指標比較

與空白組比較，模型組、貝那普利組、低六味組、中六味組及高六味組小鼠體質量、24 h尿量、血清白蛋白均降低（P＜0.05），24 h尿蛋白定量升高（P＜0.05）；與模型組比較，貝那普利組、中六味組及高六味組24 h尿蛋白定量降低（P＜0.05）；貝那普利組及低六味組、中六味組、高六味組組間比較，體質量、24 h尿量、血清白蛋白及24 h尿蛋白定量差異均無統計學意義（P＞0.05）；各組間血鉀、血肌酐差異無統計學意義（P＞0.05）。詳見表2。

3.3" 各組小鼠腎組織病理形態改變

空白組小鼠腎小球、腎小管、腎間質形態基本正常，其余五組ADRN小鼠腎臟病理見不同程度的腎小球系膜細胞增生，部分系膜區擴大、腎小管蛋白管型，間質可見炎性細胞浸潤。詳見圖1。

3.4" 各組小鼠足細胞足突超微結構改變

電鏡下空白組小鼠足突結構整齊清晰，基底膜結構完整。模型組可見足細胞足突增寬、回縮、融合甚至消失。灌胃8周，與模型組比較，各干預組上述結構改變均得到不同程度改善。詳見圖2。

3.5" 各組小鼠腎臟p-p38 MAPK、α-actinin-4、synaptopodin蛋白陽性表達水平的影響

與空白組比較，模型組及各藥物干預組小鼠腎臟p-p38 MAPK、α-actinin-4蛋白表達升高（P＜0.05），synaptopodin蛋白表達降低（P＜0.05）；與模型組比較，貝那普利組、高六味組p-p38 MAPK蛋白表達降低（P＜0.05），貝那普利組、中六味組及高六味組synaptopodin蛋白表達升高（P＜0.05）。貝那普利組及低六味組、中六味組、高六味組組間比較，p-p38 MAPK、α-actinin-4、synaptopodin蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05）。詳見圖3、表3。

3.6" 各組小鼠腎臟α-actinin-4、synaptopodin mRNA表達比較

與空白組比較，模型組及各藥物干預組小鼠腎臟α-actinin-4 mRNA表達升高（P＜0.05），synaptopodin mRNA表達降低（P＜0.05）；與模型組比較，貝那普利組、中六味組及高六味組synaptopodin mRNA表達升高（P＜0.05）。貝那普利組及低六味組、中六味組、高六味組組間比較，α-actinin-4、synaptopodin mRNA表達差異無統計學意義（P＞0.05）。詳見表4。

3.7" 各組小鼠腎臟p-p38 MAPK、α-actinin-4、synaptopodin蛋白表達比較

與空白組比較，模型組及各藥物干預組小鼠腎臟p-p38 MAPK、α-actinin-4 蛋白表達升高（P＜0.05），synaptopodin 蛋白表達降低（P＜0.05）；與模型組比較，貝那普利組、高六味組 p-p38 MAPK表達降低（P＜0.05），貝那普利組、低六味組、中六味組及高六味組synaptopodin蛋白表達升高（P＜0.05）；貝那普利組及低六味組、中六味組、高六味組組間比較，p-p38 MAPK，α-actinin-4，synaptopodin蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05）。詳見圖4、表5。

4 討論

1994年，Williams指出蛋白尿是判斷CKD病情進展的關鍵指標之一[6]。此后多項研究均表明蛋白尿是CKD進展的獨立危險因素之一，可促進腎小管間質纖維化、腎小球硬化[7]。大量蛋白尿的持續存在也是導致腎組織損傷進行性加重的重要因素[1]。因此，蛋白尿成為腎臟病治療和療效判斷的重要指標之一。足細胞損傷是導致蛋白尿及腎功能受損的關鍵[8-9]，隨著對足細胞損傷相關疾病發病機制的了解，“保護足細胞”是當前腎臟病領域研究熱點之一。足突融合是足細胞損傷最主要的改變，可引起腎小球對大分子物質通透性的增加，蛋白大量漏出，融合的足突與腎小球基膜（glomerular basement membrane， GBM）粘連，足突下間隙面積減小，腎小球濾過率下降[10-11]。足細胞特殊結構的維持依賴于肌動蛋白為主的細胞骨架系統，最重要的肌動蛋白調控蛋白是α-actinin-4與synaptopodin[12]。α-actinin-4是細胞骨架F-肌動蛋白（actin）交聯蛋白，保持足突的形態、賦予足細胞韌性和強度，維持足細胞細胞骨架穩定[13-16]，編碼α-actinin-4的基因ACTN4突變可導致常染色體顯性家族遺傳性局灶階段性腎小球硬化[17]。synaptopodin蛋白表達于成熟的足細胞足突，調節足突形狀和足突運動，在微小病變、局灶節段性腎小球硬化和膜性腎病患者，腎小球足細胞synaptopodin的表達明顯減少[18-20]。MAPK通路參與調節足細胞細胞骨架聚合及穩定性，其異常活化與足細胞損傷、足突融合和蛋白尿的發生密切相關[21]。在伴有足細胞損傷的臨床腎小球疾病、嘌呤霉素氨基核苷（puromycin aminonucleoside， PAN）腎病大鼠、ADRN小鼠，均發現腎臟p-p38 MAPK表達增加，伴隨有肌動蛋白重組，使用p38 MAPK抑制劑可改善PAN腎病、ADRN模型動物腎臟足細胞損傷，減輕蛋白尿及腎小球硬化[22]。

中醫學無“蛋白尿”論述，《素問·金匱真言論篇》曰：“夫精者身之本也。”中醫之“精”與西醫之“蛋白質”均是構成人體和維持機體生命活動的物質基礎。《素問·六節藏象論篇》曰：“腎者，主蟄，封藏之本，精之處也。”《素問·上古天真論篇》曰：“腎者主水，受五臟六腑之精而藏之。”故腎主藏精，宜藏不宜泄。《諸病源候論·虛勞病諸候》指出：“勞傷腎虛，不能藏于精，故因小便而精微出也。”因此，足細胞是“腎失封藏、精微外泄”的微觀結構基礎，足細胞損傷導致蛋白“精”泄而不藏。六味地黃丸記載于宋代錢乙《小兒藥證直訣》，亦可為湯劑，由熟地黃、山茱萸、山藥、澤瀉、牡丹皮、茯苓6味中藥組成，方中熟地黃滋腎陰、益精髓，山茱萸滋腎、益肝、澀精，山藥滋腎、補脾，是為“三補”；澤瀉利濕泄濁，茯苓淡滲脾濕，牡丹皮清瀉相火，是為“三瀉”。應用數據挖掘技術研究當代中醫治療慢性腎炎蛋白尿的證治方藥規律，結果顯示核心中藥主要為補氣健脾藥與補腎澀精藥，六味地黃湯是臨床使用頻率較高的方劑[23]。六味地黃湯聯合來氟米特、潑尼松能明顯減低IgA模型大鼠尿蛋白，減輕腎組織病理損害，與上調足細胞裂孔膜蛋白nephrin、podocin的表達有關[24-25]。

本研究采用的ADRN小鼠模型為局灶節段性腎小球硬化的一個經典動物模型，主要是對腎小球足細胞的損傷，亦是目前公認的能較好的模擬腎小球疾病的模型之一[26]。本研究結果顯示，與空白組對比，模型組小鼠血清白蛋白降低，24 h尿蛋白定量升高；HE染色可見腎小球系膜細胞增生，部分系膜區擴大、腎小管蛋白管型，間質可見炎性細胞浸潤；透射電鏡可見明顯的足突融合，足細胞骨架蛋白α-actinin-4 mRNA及蛋白表達增加，synaptopodin mRNA及蛋白表達降低，提示ADRN小鼠足突融合與骨架蛋白α-actinin-4、synaptopodin表達異常相關，而p-P38 MAPK蛋白表達增加，提示p38 MAPK通路活化參與足突融合。六味地黃湯干預8周后，ADRN小鼠24 h尿蛋白定量下降，足突融合改善，上調α-actinin-4、synaptopodin蛋白及mRNA的表達，下調p-p38 MAPK蛋白表達，表明六味地黃湯可能通過抑制p38 MAPK通路活化，穩定足細胞骨架蛋白，干預足突融合，減輕足細胞損傷，減少尿蛋白漏出。

綜上所述，六味地黃湯是臨床治療慢性腎臟病的有效方劑，本課題組前期研究顯示六味地黃湯可減輕5/6腎切除大鼠蛋白尿[27]，與調控凋亡相關蛋白B細胞淋巴瘤-2（B-cell lymphoma-2， Bcl-2）和Bcl-2相關X蛋白（Bcl-2 associated X protein， Bax）的表達，減輕腎臟固有細胞凋亡有關[28]，亦可通過降低轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1），促進補體受體1（complement receptor， CR1）的表達，減少IgA腎病大鼠蛋白尿[29]。本研究探究了六味地黃湯對ADRN小鼠尿蛋白的作用及調控機制。結果顯示，六味地黃湯可有效抑制p38 MAPK通路活化，上調α-actinin-4、synaptopodin蛋白及mRNA的表達，改善足突融合，減輕足細胞損傷，發揮減少尿蛋白的作用。其具體調控機制及關鍵分子有待進一步研究。

參考文獻

[1] LE W B， LIANG S S， HU Y L， et al. Long-term renal survival and related risk factors in patients with IgA nephropathy： Results from a cohort of 1155 cases in a Chinese adult population[J]. Nephrology， Dialysis， Transplantation， 2012， 27（4）： 1479-1485.

[2] FENG D. Phosphorylation of key podocyte proteins and the association with proteinuric kidney disease[J]. American Journal of Physiology Renal Physiology， 2020， 319（2）： F284-F291.

[3] 應" 蓓， 楊" 勤， 邵曉珊， 等. SB203580抑制p38 MAPK信號通路對阿霉素干預大鼠足細胞損傷及凋亡的影響[J]. 貴州醫藥， 2019， 43（3）： 342-344.

[4] 徐文峰， 何澤云， 唐" 群， 等. 豬苓湯對阿霉素腎病大鼠血清AVP及腎臟γ-ENaC的影響[J]. 中國實驗方劑學雜志， 2013， 19（15）： 280-284.

[5] 陳" 奇. 中藥藥理研究方法學[M]. 北京： 人民衛生出版社， 2011： 28.

[6] WILLIAMS J D， COLES G A. Proteinuria： A direct cause of renal morbidity？[J]. Kidney International， 1994， 45（2）： 443-450.

[7] 李" 丹， 丁" 潔. 蛋白尿加速慢性腎臟病進展的分子機制[J]. 北京大學學報（醫學版）， 2010， 42（5）： 608-611.

[8] POLLAK M R. Inherited podocytopathies： FSGS and nephrotic syndrome from a genetic viewpoint[J]. Journal of the American Society of Nephrology， 2002， 13（12）： 3016-3023.

[9] JIANG H， SHEN Z R， ZHUANG J， et al. Understanding the podo？鄄

cyte immune responses in proteinuric kidney diseases： From path？鄄ogenesis to therapy[J]. Frontiers in Immunology， 2023， 14： 1335936.

[10] CELLESI F， LI M， RASTALDI M P. Podocyte injury and repair mechanisms[J]. Current Opinion in Nephrology and Hypertension， 2015， 24（3）： 239-244.

[11] WHARRAM B L， GOYAL M， WIGGINS J E， et al. Podocyte depletion causes glomerulosclerosis： Diphtheria toxin-induced podocyte depletion in rats expressing human diphtheria toxin receptor transgene[J]. Journal of the American Society of Nephrology， 2005， 16（10）： 2941-2952.

[12] KANNAN N， TANG V W. Synaptopodin couples epithelial contractility to α-actinin-4-dependent junction maturation[J]. The Journal of Cell Biology， 2015， 211（2）： 407-434.

[13] MARTIN C E， PHIPPEN N J， KEYVANI CHAHI A， et al. Complementary Nck1/2 signaling in podocytes controls α actinin-4-mediated actin organization， adhesion， and basement membrane composition[J]. Journal of the American Society of Nephrology， 2022， 33（8）： 1546-1567.

[14] FENG D， KUMAR M， MUNTEL J， et al. Phosphorylation of ACTN4 leads to podocyte vulnerability and proteinuric glomerulosclerosis[J]. Journal of the American Society of Nephrology， 2020， 31（7）： 1479-1495.

[15] ODENTHAL J， DITTRICH S， LUDWIG V， et al. Modeling of ACTN4-based podocytopathy using Drosophila nephrocytes[J]. Kidney International Reports， 2023， 8（2）： 317-329.

[16] TSENG C C， ZHENG R H， LIN T W， et al. α-Actinin-4 recruits Shp2 into focal adhesions to potentiate ROCK2 activation in podocytes[J]. Life Science Alliance， 2022， 5（11）： e202201557.

[17] SHAO H S， WINGERT B， WEINS A， et al. Focal segmental glomerulosclerosis ACTN4 mutants binding to actin： Regulation by phosphomimetic mutations[J]. Scientific Reports， 2019， 9（1）： 15517.

[18] ZENG L F， SZETO C C. Urinary podocyte markers in kidney diseases[J]. Clinica Chimica Acta， 2021， 523： 315-324.

[19] 蘇彩霞， 嵇雅茹， 虞" 飛， 等. 阿霉素誘導的局灶節段性腎小球硬化小鼠足細胞損傷的機制研究[J]. 國際泌尿系統雜志， 2023， 43（1）： 125-129.

[20] WANG X K， QI D， FU F H， et al. Therapeutic and antiproteinuric effects of salvianolic acid A in combined with low-dose prednisone in minimal change disease rats： Involvement of PPARγ/Angptl4 and Nrf2/HO-1 pathways[J]. European Journal of Pharmacology， 2019， 858： 172342.

[21] NI Y L， WANG X， YIN X X， et al. Plectin protects podocytes from adriamycin-induced apoptosis and F-actin cytoskeletal disruption through the integrin α6β4/FAK/p38 MAPK pathway[J]. Journal of Cellular and Molecular Medicine， 2018， 22（11）： 5450-5467.

[22] KOSHIKAWA M， MUKOYAMA M， MORI K， et al. Role of p38 mitogen-activated protein kinase activation in podocyte injury and proteinuria in experimental nephrotic syndrome[J]. Journal of the American Society of Nephrology， 2005， 16（9）： 2690-2701.

[23] 王" 健， 王耀光. 基于數據挖掘的當代中醫治療慢性腎炎蛋白尿證治方藥規律研究[J]. 上海中醫藥雜志， 2019， 53（4）： 17-21.

[24] 賈利寧， 楊" 陽， 高" 明， 等. 六味地黃湯聯合來氟米特、潑尼松治療大鼠IgA腎病的研究[J]. 陜西中醫， 2016， 37（3）： 372-375.

[25] 張瑞義， 舒" 適， 李志杰， 等. 六味地黃丸對阿霉素腎病小鼠足細胞nephrin和podocin表達的影響[J]. 數理醫藥學雜志， 2017， 30（6）： 795-798.

[26] LEE V W S， HARRIS D C H. Adriamycin nephropathy： A model of focal segmental glomerulosclerosis[J]. Nephrology， 2011， 16（1）： 30-38.

[27] 陳" 麗， 周忠志， 何澤云， 等. 六味地黃湯對5/6腎切除大鼠致慢性腎衰竭模型的影響[J]. 時珍國醫國藥， 2013， 24（12）： 2869-2871.

[28] 胡" 爽， 何澤云， 徐文峰， 等. 六味地黃湯對慢性腎衰竭大鼠Bax和Bcl-2表達的影響[J]. 中國中醫急癥， 2020， 29（9）： 1524-1527， 1564.

[29] 何澤云， 何雅琴， 廖春來， 等. 六味地黃湯對IgA腎病模型大鼠轉化生長因子-β1和補體調節蛋白CR1表達的影響[J]. 中國中醫藥信息雜志， 2015， 22（11）： 54-57.