基于指紋圖譜的化學模式識別法和多指標測定評價枸杞不同部位的差異性

〔摘要〕 目的 研究枸杞植株不同部位中主要化學成分的整體信息和含量差異，綜合評價枸杞不同部位的質量和合理應用。方法 以3個主產區的枸杞子、枸杞葉和地骨皮藥材為研究對象，建立HPLC指紋圖譜，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統進行相似度評價；結合SIMCA 14.1軟件進行主成分分析等；采用分光光度比色法測定枸杞多糖和總黃酮含量；并利用HPLC方法對甜菜堿進行含量測定。結果 枸杞不同部位化學成分的種類和含量均存在明顯差異，葉和果實含有更豐富的化學成分，枸杞多糖、總黃酮和甜菜堿的含量均為枸杞葉＞枸杞子＞地骨皮。結論 枸杞葉含有更豐富的營養成分，其藥理功能和營養價值可能優于枸杞子。因此，可考慮多產地開發枸杞葉作為枸杞藥材來源之一，以促進枸杞資源的多途徑、多層次開發利用。

〔關鍵詞〕 枸杞子；枸杞葉；地骨皮；HPLC指紋圖譜；化學計量學；多糖；黃酮；甜菜堿

〔中圖分類號〕R284.1" " " " "〔文獻標志碼〕A" " " " " 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.07.007

Evaluating the differences in different parts of Lycium barbarum L. by fingerprint-based chemical pattern recognition method and multi-index determination

YAN Yan1， GE Yuzhu1， ZHANG Xiaoqian1， HUANG Shan1， ZHAO Quan2， WANG Jie1*， Yang Xiaofan1*

1. College of Chinese Medicine， Bozhou University， Bozhou， Anhui 236800， China;

2. Zhongke Kebo Testing Co.， Ltd， Bozhou， Anhui 236800， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To study the overall information and content differences of the main chemical components in different parts of Lycium barbarum L.， and comprehensively evaluate the quality and rational application of different parts of Lycium barbarum L.. Methods This study focused on Gouqizi （Lycii Fructus）， Gouqiye （Lycii leafy）， and Digupi （Lycii Cortex） from three major producing regions as the subjects of investigation. HPLC fingerprints were established for these samples， and similarity evaluations were performed using the chromatographic fingerprint similarity evaluation system for Chinese medicines. Clustering and principal component analysis were conducted using SIMCA 14.1 software. The polysaccharide and total flavonoid contents were determined through spectrophotometric colorimetric methods， while the betaine content was quantified using the HPLC method. Results Significant differences were observed in the types and contents of chemical components among different parts of Lycium barbarum L. Gouqiye （Lycii leafy） and Gouqizi （Lycii Fructus） were found to contain richer chemical components. The contents of polysaccharides， total flavonoids， and betaine were ranked in the order of Gouqiye （Lycii leafy） gt; Gouqizi （Lycii Fructus） gt; Digupi （Lycii Cortex）. Conclusion Gouqiye （Lycii leafy） are richer in nutrients， the pharmacological functions and nutritional value may be superior to those of Gouqizi （Lycii Fructus）. Therefore， the multi-origin development of Gouqiye （Lycii leafy） as high-quality Lycium barbarum medicinal herbs can be considered for the multi-path and multi-level development and utilization of Lycium barbarum L. resources.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 Lycii Fructus; Lycii leafy; Lycii Cortex; HPLC fingerprint; chemometrics; polysaccharides; flavonoids; betaine

枸杞為茄科（Solanaceae）枸杞屬（Lycium L.）植物，是我國傳統的具有藥食同源功能的重要中藥資源[1-2]。枸杞果實、葉和根皮都有豐富的營養成分和廣泛的應用價值[3-9]，可用于制作枸杞干果、枸杞茶酒飲料類、枸杞保健品等[10-15]，如圖1所示。《本草綱目》記載[16]：“春采枸杞葉，名天精草；夏采花，名長生草；秋采子，名枸杞子；冬采根，名地骨皮。”枸杞子（Lycii Fructus）為茄科植物寧夏枸杞Lycium barbarum L.的干燥成熟果實，是重要的滋補肝腎、益精明目藥[17]。近年來上市的枸杞保健產品中，很大一部分的功效成分屬于生物堿、多糖和黃酮類化合物，涉及功能食品的重要方面，如抗衰老、防癌、提高免疫力、降脂、降壓食品等[18-21]。2020年版《中華人民國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）對枸杞子的質量評價以枸杞多糖和甜菜堿作為主要控制指標，其中規定多糖質量分數不得少于1.8%，甜菜堿不得少于0.5%。目前，地骨皮（Lycii Cortex）的質量標準中還沒有含量要求的規定。另根據研究，枸杞葉（Lycii leafy）中化學成分類型與果實相似，且部分成分含量高于果實，可作為優質枸杞藥材與果實同用[22-23]。然而，枸杞葉尚且未被藥典收錄，也缺乏相關的質量標準，同時枸杞葉的開發利用程度很低，大量的枸杞葉被當作無用的廢料處理，造成了枸杞資源的浪費和損失[24-25]。

對枸杞的化學成分類型及其含量進行研究，可初步推斷其藥用功效[26]，為其資源開發和利用提供依據。本實驗以寧夏、甘肅和青海3個枸杞主產區的枸杞子、枸杞葉和地骨皮為研究對象，比較不同產地和植株不同部位中化學成分的整體分布以及多糖、總黃酮的質量分數差異，研究結果可為枸杞資源的最大化利用和中藥質量標準的制定提供重要的理論支撐。

1 儀器與材料

1.1" 儀器

LC-20A型高效液相色譜、UV-1900i紫外可見分光光度計[島津企業管理（中國）有限公司]；MS105DU/A型精密電子天平（瑞士梅特勒-托利多）；TG16-WS臺式高速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；SB-4200DTD超聲波清洗機（寧波新芝生物科技有限公司）；DHG-9123A電熱恒溫鼓風干燥箱（上海靳瀾儀器制造有限公司）；BJ-150粉碎機（德清拜杰電器有限公司）；8JXFSTPRP-CL-48L低溫組織研磨儀（上海凈信實業發展有限公司）；ZGDCY-24干式氮吹儀（上海梓桂儀器有限公司）；JOANLABWB100-4F水浴鍋[群安科學儀器（浙江）有限公司]；Milli-Q超純水儀系統（美國Millipore公司）。

1.2" 主要藥物與試劑

蘆丁（純度≥98%，批號：DSTDL001701）、槲皮素（純度≥98%，批號：DSTDH002802）、木犀草素（純度≥98%，批號：DSTDM003202）、無水葡萄糖（純度≥98%，批號：DSTDW000501）、甜菜堿（純度≥98%，批號：DSTDT001202）對照品均購自成都德思特生物技術有限公司。甲醇、乙腈和冰乙酸均為色譜純（美國Fisher公司）；乙醚、苯酚、濃硫酸、無水乙醇、碳酸鈉等均為分析純（北京化工廠）。10個批次3個部位（共30批）枸杞子、枸杞葉和地骨皮樣本均購自亳州市中藥材交易市場，經亳州學院孟詳松教授鑒定為茄科植物寧夏枸杞Lycium barbarum L.的干燥成熟果實、葉和根皮，樣品信息詳見表1。

2 方法與結果

2.1" 樣品的制備和分析條件的建立

2.1.1" HPLC指紋圖譜對照品溶液的制備" 分別取蘆丁、槲皮素、木犀草素對照品各約1 mg，精密稱定，置于10 mL量瓶，加甲醇定容后配制成對照品儲備液；精密吸取1 mL對照品儲備液于10 mL量瓶，加甲醇定容即得蘆丁、槲皮素、木犀草素濃度分別為11.48、10.45、10.94 μg/mL的混合對照品溶液。

2.1.2" HPLC指紋圖譜供試品溶液的制備" 分別取枸杞藥材粉末約1 g（過60目篩），精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質量，超聲處理（功率200 W、頻率40 kHz）45 min，取出放冷后，用甲醇補足減失的質量，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜后取續濾液即得。

2.1.3" HPLC指紋圖譜色譜條件" ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為85%甲醇水溶液（A）-0.05%乙酸水溶液（B），梯度洗脫，0～15 min，30%～45% A；15～50 min，45%～100% A；50～55 min，100% A；55～60 min，100%～30% A；60～65 min，30% A。流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃，檢測波長370 nm，進樣體積20 μL。

2.1.4" 精密度試驗" 取樣品粉末，按“2.1.2”方法制備供試品溶液，按“2.1.3”色譜條件連續測定6次。記錄色譜圖，并計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD。以7號峰木犀草素為參照峰（S），得到各主要共有峰相對保留時間的RSD為0.56%～1.18%，相對峰面積的RSD為1.26%～3.38%，表明儀器的精密度良好。

2.1.5" 重復性試驗" 取同一樣品粉末，按“2.1.2”項下方法平行制備6份，按“2.1.3”項下色譜條件進樣分析。記錄色譜圖，以7號峰木犀草素為參照峰（S），得到各共有峰相對保留時間的RSD為0.73%～1.24%，相對峰面積的RSD為3.51%～4.37%，表明方法的重復性良好。

2.1.6" 穩定性試驗" 取樣品粉末適量，依照“2.1.2”方法制備供試品溶液，于室溫保存，分別于溶液配制完成的0、4、8、16、24、48 h進樣，按“2.1.3”色譜條件測定。記錄色譜圖，以7號峰木犀草素為參照峰（S），計算各共有峰的相對保留時間的RSD為1.91%～2.37%，相對峰面積的RSD為4.50%～5.60%，表明供試品溶液在48 h內穩定性良好。

2.2" 多糖的含量測定

2.2.1" 標準曲線的制備" 根據《中國藥典》中苯酚-硫酸法測定枸杞多糖的含量[17]。以無水葡萄糖作對照品，繪制標準曲線并得其回歸方程為Y=57.737X-0.003 5（R2=0.999 7）。

2.2.2" 枸杞多糖含量測定" 30批枸杞樣品，依照標準曲線的制備方法，自“各精密加入5%苯酚溶液1 mL”起，依法在490 nm的波長處測定吸光度，從標準曲線上讀出供試品溶液中含葡萄糖的重量（mg）計算，即得。

2.2.3" 精密度試驗" 同一供試品溶液，按“2.2.2”方法連續測定6次，吸光度為0.510、0.516、0.508、0.520、0.512、0.519，RSD為0.96%，表明儀器的精密度良好。

2.2.4" 重復性試驗" 取同一樣品粉末（Y7），平行6份，分別按“2.2.2”方法制備和測定，吸光度為0.490、0.514、0.486、0.517、0.526、0.517，計算多糖含量為（35.51±1.09） mg/g，RSD為3.23%，表明方法的重復性良好。

2.2.5" 穩定性試驗" 取藥材粉末（Y7）適量，精密稱定，按“2.2.2”方法制備并于室溫條件下放置，分別于配制完成的2、4、6、8、12、24 h測定，吸光度為0.523、0.509、0.515、0.514、0.530、0.517，RSD為1.43%，表明供試品溶液在室溫下放置24 h內穩定性良好。

2.2.6" 加樣回收率試驗" 稱取已測定含量的枸杞藥材粉末（Y7）6份，分別按照約1∶1的質量比加入對照品溶液，按“2.2.2”方法制備和測定，計算總多糖的加樣回收率。結果如表2所示，多糖的平均回收率為99.7%，RSD為2.79%，表明該方法準確度良好。

2.3" 總黃酮的含量測定

2.3.1" 標準曲線的制備" 取蘆丁對照品適量，精密稱定，加甲醇配成2 mg/mL的蘆丁對照品儲備液。精密量取10 mL，置100 mL量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得0.2 mg/mL的蘆丁對照品溶液。精密量取對照品溶液0.25、0.50、1、2、4、5 mL，分別置25 mL量瓶中，各加水至6 mL，加5% 亞硝酸鈉溶液1 mL，混勻后放置6 min，加10% 硝酸鋁溶液1 mL，混勻后放置6 min，加氫氧化鈉溶液10 mL，再加水至刻度，搖勻后放置15 min，以相應試劑為空白，在500 nm處測定吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線并得到回歸方程為Y=10.61 1X+0.001 6（R2=0.999 9）。

2.3.2" 枸杞總黃酮含量測定" 參考劉賽等[27]和《中國藥典》中規定的總黃酮的含量測定方法，稍有調整。分別取30批枸杞粗粉約1 g，精密稱定，置索氏提取器中，加乙醚適量，加熱回流至提取液無色，放冷，棄去乙醚液。再加甲醇90 mL，加熱回流至提取液無色，轉移至100 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。精密量取3 mL，置25 mL量瓶中，照標準曲線制備項下的方法，自“加水至6 mL”起，依法測定吸光度，從標準曲線上讀出供試品溶液中含蘆丁的重量（mg），計算，即得。

2.3.3" 精密度試驗" 同一供試品溶液，按照“2.3.2”方法連續測定6次，吸光度為0.243、0.238、0.240、0.253、0.240、0.241，RSD為2.22%，表明儀器的精密度良好。

2.3.4" 重復性試驗" 同一樣品粉末（G4）平行取6份，分別按“2.3.2”方法制備和測定，吸光度為0.239、0.247、0.228、0.250、0.230、0.244，計算總黃酮含量為18.69±0.39 mg/g，RSD為3.82%，表明方法的重復性良好。

2.3.5" 穩定性試驗" 取藥材粉末（G4）適量，精密稱定，按“2.3.2”方法制備并分別于室溫條件下放置2、4、6、8、12、24 h測定，吸光度為0.240、0.247、0.230、0.228、0.230、0.235，RSD為3.12%，說明供試品溶液在室溫下放置的24 h內穩定性良好。

2.3.6" 加樣回收率試驗" 取已知含量的枸杞藥材粉末（G4）6份，分別按照1∶1的質量比加入對照品溶液，按“2.3.2”方法測定，計算總黃酮的加樣回收率。結果如表2所示，總黃酮的平均回收率為99.1%，RSD為3.15%，表明該方法準確度良好。

2.4" 甜菜堿的HPLC含量測定

2.4.1 HPLC色譜條件" Agilent 1100高效液相色譜儀，Zafex Supfex GQ氨基色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為水∶乙腈=15∶85（V/V），等度洗脫。流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長195 nm，進樣體積10 μL。

2.4.2" 標準曲線的制備" 取甜菜堿對照品適量，精密稱定，加水制成每1 mL含1 mg的甜菜堿對照品儲備液。依次稀釋對照品儲備液，制成1、4、10、40、100、200、400 μg/mL的系列標準溶液。按“2.4.1”項下色譜條件依次檢測各標準溶液的峰面積，以峰面積為縱坐標，濃度為橫坐標，計算得到甜菜堿的標準曲線，線性范圍與相關系數為Y=1.149 1X-0.015 7（R2=0.999 9）。

2.4.3" 甜菜堿含量測定" 稱取約1 g樣本，精密稱定，加入50 mL甲醇，研磨儀研磨成漿，超聲提取45 min，離心后取上清液，殘渣加入50 mL甲醇復提一次，合并兩次上清液，甲醇定容至100 mL。取2 mL上清液氮吹吹干，加水定容至2 mL，過0.22 μm微孔濾膜后取續濾液即得。

2.4.4" 精密度試驗" 同一供試品溶液，按“2.4.1”方法連續測定6次，計算甜菜堿含量分別為1.33%、1.28%、1.30%、1.26%、1.35%、1.37%，RDS為3.22%，表明儀器的精密度良好。

2.4.5" 重復性試驗" 取同一樣品粉末（G4），平行6份，分別按“2.4.3”方法制備和“2.4.1”方法測定，計算甜菜堿含量為（13.01±0.25） mg/g，RSD為4.13%，表明方法的重復性良好。

2.4.6" 穩定性試驗" 取藥材粉末（G4）適量，精密稱定，按“2.4.3”方法制備并于室溫條件下放置，分別于配制完成的2、4、6、8、12、24 h測定，計算甜菜堿含量分別為（13.01±0.25） mg/g，RSD為3.60%，表明供試品溶液在室溫下條件放置24 h內穩定性良好。

2.4.7" 加樣回收率試驗" 精密稱取已測定含量的枸杞藥材粉末（G4）6份，分別按照1∶1的質量比加入對照品溶液，按照“2.4.3”方法制備和“2.4.1”方法測定，計算甜菜堿的加樣回收率。結果如表2所示，甜菜堿的平均加樣回收率為96.4%，RSD為3.84%，表明該方法準確度良好。

3 結果與分析

3.1" HPLC指紋圖譜的建立與分析

3.1.1" 指紋圖譜的建立及共有峰的標定" 取枸杞果實、葉和根皮共30批樣本，分別按“2.1.2”方法制備供試品溶液，按“2.1.3”色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。將得到的樣品圖譜導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2012版）進行分析。分別以G1、Y1和P1作為參照圖譜，采用“中位數法”，時間寬度設定為0.1 min，進行多點校正和全譜峰匹配，生成對照色譜圖（R），最終分別建立枸杞果實、葉和根皮樣品指紋圖譜。其中，30批枸杞果實、葉與根皮指紋圖譜中均標定8個共有峰，通過與對照品圖譜對比，確定1、6、7號峰分別為蘆丁、槲皮素、木犀草素。其中，空白溶劑、混合對照品溶液和藥材溶液對照圖譜的HPLC色譜圖如圖2所示。枸杞果實、葉和根皮樣品的HPLC指紋圖譜瀑布圖詳見圖3。

3.1.2" 相似度評價" 30批枸杞果實（G1～G10）、葉（Y1～Y10）、根皮（P1～P10）指紋圖譜，以對照圖譜為參照，計算其相似度，結果見表3。由表3可知，枸杞果實、葉和根皮的HPLC指紋圖譜與其相應對照指紋圖譜的相似度均大于0.90，表明同一部位枸杞藥材在不同產地之間的差異較小，主要峰群的整體相似，各產地枸杞質量穩定。枸杞不同部位之間的相似度均小于0.63，表明共有峰在枸杞果實、葉及根皮中的差異較大。

3.2" 化學計量學分析

3.2.1" 主成分分析" 采用SIMCA 14.1軟件，以30批枸杞藥材8個共有峰的峰面積占比為變量，對原始數據進行標準化處理，以主成分特征值和貢獻率為依據（表4），進行主成分分析[28]。由表4可知，前2個主成分提取特征值均＞1，其累積方差貢獻率為84.0%，能較全面反映枸杞樣本信息。以前2個主成分建立坐標系，構建主成分得分圖，詳見圖4。由得分圖可知3個產地3個部位枸杞樣本可聚為3類，果實（G1～G10）、葉（Y1～Y10）、根皮（P1～P10）各聚為一類，說明枸杞不同植株部位之間的化學成分均存在一定差異。

3.2.2" 正交偏最小二乘法-判別分析" 為進一步比較10個批次3個部位枸杞樣本化學成分的不同并篩選分類的差異性標記物，將30批枸杞藥材8個共有峰的峰面積占比為變量進行OPLS-DA建模分析，結果如圖5所示。由模型參數可知，數據矩陣的模型解釋率R2X=0.922，R2Y=0.975，模型預測指數Q2 cum=0.969，均大于0.5，表示模型擬合良好，預測能力較強[29]。由OPLS-DA得分圖可以看出，10個批次3個部位枸杞樣品明顯分為3類，果實、葉和根皮各為一類。以變量重要性投影值（variable importance forthe projection，VIP）大于1為提取標準，由圖5（B）可看出，蘆丁和木犀草素是主要的差異性成分。

3.3" 枸杞多糖含量測定

3.3.1" 枸杞不同植株部位含量測定結果" 30批枸杞果實、葉和根皮中多糖的含量測定結果見表5。由表5可知，枸杞果實與葉中的含量，分別為2.74%～3.37%、2.82%～3.53%，高于根皮中的1.92%～2.68%，均大于1.8%，符合《中國藥典》對枸杞子中枸杞多糖的含量要求。此外，產地的土壤、氣候和其他環境因素也可能對多糖含量產生影響，總體來看，青海產的植株中多糖含量最高，其次是寧夏或甘肅，這與之前的研究結果是一致的[27]。因此，可考慮多產地開發高品質的枸杞葉作為枸杞子的優質補充資源。

3.3.2" 差異性分析" 30批枸杞果實、葉和根皮樣品中總多糖的質量分數、均值和差異性分析結果見圖6（A）。由圖6（A）可以看出，同一產地不同部位之間，枸杞多糖的含量為葉＞果實＞根皮，葉與果實之間的含量比較部分呈現顯著差異，根皮中的多糖含量與葉和果實相比均為極顯著差異。

3.4" 總黃酮含量測定

3.4.1" 枸杞不同植物部位含量測定結果" 30批枸杞果實、葉和根皮中黃酮的含量測定結果見表6。由表6可知，枸杞果實與葉中的含量分別為15.02～22.16 mg/g和18.10～25.07 mg/g，高于根皮中的4.50～5.89 mg/g。總體來看，青海產地的枸杞植株中黃酮含量更高，其次是寧夏或甘肅，這與枸杞多糖的含量分布是一致的。枸杞多糖和黃酮類化合物在免疫調節、抗腫瘤、抗氧化等方面具有重要作用，推斷枸杞葉在這些功能方面可能具有更優的價值。

3.4.2" 差異性分析" 30批枸杞果實、葉和根皮樣品中黃酮的質量分數、均值和差異性分析結果見圖6（B）。由圖6（B）可以看出，總黃酮的含量大小為葉＞果實＞根皮，且果實、葉與根皮之間的含量均有顯著差異。

3.5" 甜菜堿含量測定

3.5.1" 枸杞不同植物部位含量測定結果" 30批枸杞果實、葉和根皮中甜菜堿的含量測定結果見表7。由表7可知，枸杞葉中甜菜堿的含量為3.15%～3.64%，高于果實中的1.01%～1.32%和根皮中的0.60%～0.73%，且均大于0.5%，符合《中國藥典》對枸杞子中甜菜堿的含量要求。甜菜堿在肝臟和腎臟中的作用已被充分證明，對阿爾茨海默病、帕金森病和精神分裂癥也有積極作用[30]，推測枸杞葉在神經元變性和記憶損傷方面的作用將優于枸杞果實。

3.5.2" 差異性分析" 30批枸杞果實、葉和根皮樣品中甜菜堿的質量分數、均值和差異性分析結果見圖6（C）。由圖6（C）可以看出，甜菜堿的含量大小為葉＞果實＞根皮，且葉與果實、根皮之間的含量均有極顯著差異。

4 結論

本研究分別考察了提取溶劑、提取方法、料液比和提取時間對有效成分的提取效率，確定最優的提取條件，建立的HPLC分析方法簡單，方法學驗證結果良好。相似度評價結果反映了枸杞子、枸杞葉和地骨皮之間化學成分存在明顯差異，結合化學計量學分析，篩選出蘆丁和木犀草素作為主要的差異性成分。綜合枸杞多糖、總黃酮和甜菜堿的含量對比，凸顯了枸杞葉在功效成分上的優勢。因此，多產地并舉充分開發枸杞葉資源，有助于枸杞資源的充分利用，以及在制藥、保健品、食品工業的多元化開發。該研究結果也為枸杞不同藥用部位質量標準的完善和制定提供了數據參考。

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