基于腎主骨理論探討腎病與骨質疏松癥因果關系的孟德爾隨機化分析

〔摘要〕 目的 探索中醫腎主骨理論下，腎病與骨質疏松癥（osteoporosis， OP）的因果關系。方法 使用孟德爾隨機化方法，從全基因組關聯研究（genome-wide association study， GWAS）數據庫篩選腎病相關單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphisms， SNPs）作為工具變量，應用固定效應逆方差加權及多種敏感性分析以評估腎病與OP之間的因果關系。結果 5種孟德爾隨機化分析結果顯示，膜性腎?。∣R=1.000 6，95%CI：1.000 2～1.000 9，P=0.001 0）、慢性腎小球腎炎（OR=1.000 8，95%CI：1.000 1～1.001 5，P=0.038 0）、糖尿病腎?。∣R=1.001 0，95%CI：1.000 1～1.002 0，P=0.031 6）、血清肌酐升高（OR=1.013 0，95%CI：1.000 0～1.026 0，P=0.050 8）可顯著增加OP風險，估計的腎小球濾過率升高則與OP風險降低相關（OR=0.997 0，95%CI：0.995 3～0.998 6，P=0.000 3）。多重敏感性分析證實了結果的穩健性，未發現明顯的多效性（MR-Egger截距Pgt;0.05）和異質性（Cohran's Q檢驗Pgt;0.05）。結論 腎病與OP間存在正向因果關系，佐證腎主骨理論，為腎病相關OP預防和治療提供新證據。

〔關鍵詞〕 骨質疏松癥；慢性腎??；腎功能；孟德爾隨機化；中醫理論

〔中圖分類號〕R256.5" " " " "〔文獻標志碼〕A" " " " " 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.07.015

Mendelian randomization analysis of the causal relationship between kidney disease and osteoporosis based on the theory of kidney governing bones

KUANG Yulin1，2，3， WANG Yuhuang4， OU Liang3， LI Hongfang5， XIONG Luojie2，

GONG Zhichao1，2， SUN Shaoqiu1，2*

1. The Second Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410005， China; 2. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 3. Hunan Academy of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410013， China; 4. Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China; 5. Zunyi Medical University， Zunyi， Guizhou 563006， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To explore the causal relationship between kidney disease and osteoporosis （OP） under the Chinese medicine theory of kidney governing bones. Methods Using the Mendelian randomization approach， single nucleotide polymorphisms （SNPs） related to kidney disease were screened as instrumental variables from the genome-wide association study （GWAS） database. Additionally， the fixed-effect inverse variance weighted method and multiple sensitivity analyses were employed to assess the causal relationship between kidney disease and osteoporosis （OP）. Results Five kinds of Mendelian randomization analyses revealed that membranous nephropathy （OR=1.000 6， 95% CI： 1.000 2～1.000 9， P=0.001 0）， chronic glomerulonephritis （OR=1.000 8， 95% CI： 1.000 1～1.001 5， P=0.038 0）， diabetic nephropathy （OR=1.001 0， 95% CI： 1.000 1～1.002 0， P=0.031 6）， and elevated serum creatinine （OR=1.0130， 95% CI： 1.000 0～1.026 0， P=0.050 8） can significantly increase the risk of OP， while an estimated increase in glomerular filtration rate was associated with a lower risk of OP （OR=0.997 0， 95% CI： 0.995 3～0.998 6， P=0.000 3）. Multiple sensitivity analyses confirmed the robustness of the results， with no notable pleiotropy （MR-Egger intercept Pgt;0.05） or heterogeneity （Cohran's Q test Pgt;0.05） identified. Conclusion This study confirms a positive causal relationship between kidney disease and OP， supporting the theory of kidney governing bones. Thus， it provides new evidence for the prevention and treatment of kidney disease-related OP.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 osteoporosis; chronic kidney disease; kidney function; Mendelian randomization; Chinese medicine theory

《素問·痿論篇》云：“腎者水臟也，今水不勝火。則骨空而髓虛，故足不任身，發為骨痿?！敝嗅t理論強調“腎藏精”“腎主骨生髓”，腎中精氣充盈，可生髓填骨，腎虛則導致骨痿。《外臺秘要方·卷十六·骨極論》亦載：“凡腎病則骨極，牙齒苦痛。”慢性腎臟?。╟hronic kidney disease， CKD）已成為一個全球性的公共衛生挑戰[1-2]。CKD患者的骨質疏松癥（osteoporosis， OP）風險呈上升趨勢[3-4]。CKD患者髖部骨折的風險相比非CKD患者顯著增加3～5倍[5]。與中醫“腎主骨”理論相符，CKD可能是導致OP的獨立危險因素，然而CKD與OP之間的因果關系尚不明確。孟德爾隨機化方法提供了探索暴露因素與結局指標之間因果關系的獨特視角[6]，通過孟德爾隨機化分析腎臟功能與骨骼健康的因果關系，有望為“腎主骨”理論提供佐證。本研究采用孟德爾隨機化方法，以4種代表性腎臟疾病或腎功能指標作為暴露因素，以OP作為結局指標，選取與各暴露因素明顯相關的單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphisms， SNPs）作為工具變量（instrumental variables， IVs），以分析腎病與OP之間的因果關系，旨在從現代流行病學角度驗證中醫“腎主骨”理論，為指導臨床腎病患者OP的防治提供新思路。

1 資料與方法

1.1" 研究設計

本研究采用孟德爾隨機化方法探討腎病及腎功能指標與OP之間的因果關系，從現代流行病學角度驗證中醫“腎主骨”理論。以估計的腎小球濾過率、血清肌酐、血清尿素及血清尿酸作為腎功能指標，以膜性腎病、慢性腎小球腎炎、糖尿病腎病及腎結石等作為代表性腎病，以OP作為研究的結果變量。利用公開發表的全基因組關聯性分析（genome-wide association studies， GWAS）數據，從中篩選與上述暴露因素顯著相關的SNPs作為IVs。通過兩樣本孟德爾隨機化方法，評估腎病及腎功能指標對OP發生風險的影響。為確保分析的準確性，采用Cochran's Q檢驗評估研究結果的異質性，并進行多種敏感性分析以驗證結果的穩健性。在選擇IVs進行因果關聯分析時，遵循以下3個核心假設：（1）IVs與暴露因素之間存在顯著的相關性；（2）IVs與任何潛在的混雜因素（包括結果變量）均無相關性；（3）IVs僅通過暴露因素對結果變量產生影響，不存在其他途徑的影響。詳見圖1。

1.2" 數據來源

本研究從IEU Open GWAS project數據庫中提取關于腎病及腎功能指標與OP的關聯數據，具體包括糖尿病胃病（GWAS ID：finn-b-DM_NEPHROPATHY，16 380 453 SNPs，樣本量213 746）、膜性腎病（GWAS ID：ebi-a-GCST010004，3 877 927 SNPs，樣本量7979）[7]、慢性腎小球腎炎（GWAS ID：ebi-a-GCST90018820，24 199 034 SNPs，樣本量475 821）[8]、腎結石（GWAS ID：ebi-a-GCST90038631，9 587 836 SNPs，樣本量484 598）[9]、腎小球濾過率（GWAS ID：ebi-a-GCST90018979，19 034 241 SNPs，樣本量344 104）[8]、血清肌酐（GWAS ID：ieu-a-1104，2 198 288 SNPs，樣本量118 460）[10]、血清尿素（GWAS ID：ebi-a-GCST90025991，4 231 983 SNPs，樣本量437 580）[11]、血清尿酸（GWAS ID：ebi-a-GCST90018977，19 041 286 SNPs，樣本量343 836）[8]、OP（GWAS ID：ebi-a-GCST90038656，9 587 836 SNPs，樣本量484 598）[9]。所有數據均來自公共數據庫，無須額外倫理審查。

1.3" IVs的選擇

從GWAS匯總數據中篩選與腎病和腎功能指標密切相關的SNPs為標準。設置連鎖不平衡系數“ｘ±s”，并限定距離范圍為10 000 kb，確保所選SNPs在遺傳學上相互獨立。為評估所選IVs的強度和有效性，本研究計算了每個SNP解釋的暴露變量方差R2和對應的F統計量。R2和F統計量的計算公式如下：

其中，β為SNP的效應值，EAF為效應等位基因頻率，se（β）為β的標準誤，N為GWAS的樣本量，k為SNP的數量。F用于評估IV的強度，F＜10的SNP由于強度不足被排除[12]。對于每種暴露因素，本研究僅納入至少滿足2個上述標準的獨立SNP作為其IVs。

1.4" 效應評估

選擇逆方差加權法（inverse variance weighted， IVW）作為主要的統計方法，以其高效的檢測能力估計腎病及腎功能指標對OP風險的影響。

1.5" 敏感性與異質性分析

由于IVW方法可能會忽略基因多效性的問題，本研究采用MR-Egger截距法評估多效性的潛在影響。并采用“留一法”對研究結果進行敏感性分析，以評估單個SNP對整體因果估計的影響。此外，為檢測異質性，使用Cochran's Q統計量。當P＜0.05時，表明存在異質性，將進一步采用隨機效應模型進行深入分析。

1.6" 統計學處理

本研究以IVW方法為主，以MR-Egger和WM等方法作為補充，以確保因果推斷的準確性。MR-Egger截距法用于探測基因多效性，而“留一法”用于敏感性分析。所有統計分析均在R軟件（4.1.2版本）環境下，通過使用MendelianRandomization（0.5.0版本）和TwoSampleMR（0.5.6版本）包進行。

2 結果

2.1" IVs

本研究從全基因組關聯研究中篩選出與腎病及腎功能指標顯著相關的SNPs，作為IVs進行分析，具體包括膜性腎病（14個SNPs）、慢性腎小球腎炎（2個SNPs）、腎結石（4個SNPs）、糖尿病腎病（7個SNPs）、腎小球濾過率（608個SNPs）、血清尿素（269個SNPs）、血清尿酸（433個SNPs）和血清肌酐（45個SNPs）。所選IVs的F統計量均超過10，表明這些SNPs具有高度的統計效力，確保了孟德爾隨機化分析的可靠性且無明顯的弱IVs偏倚。

2.2" 兩樣本孟德爾隨機化分析

兩樣本孟德爾隨機化分析表明，多種腎臟疾病及腎功能指標與OP之間存在因果聯系（圖2）。其中，膜性腎病（OR=1.000 6，95%CI：1.000 2～1.000 9，P=0.001 0）、慢性腎小球腎炎（OR=1.000 8，95%CI：1.000 1～1.001 5，P=0.038 0）和糖尿病腎病（OR=1.001 0，95%CI：1.000 1～1.002 0，P=0.031 6）可顯著增加OP的風險。腎小球濾過率的升高與OP風險降低相關（OR=0.997 0，95%CI：0.995 3～0.998 6，P=0.000 3）。血清肌酐水平與OP呈現邊緣顯著的正相關（OR=1.013 0，95%CI：1.000 0～1.026 0，P=0.050 8）。血清尿酸（OR=0.999 8，95%CI：0.998 5～1.001 1，P=0.721 2）、血清尿素（OR=0.998 3，95%CI：0.996 2～1.000 5，P=0.132 3）、腎結石（OR=1.028 0，95%CI：0.831 7～1.271 0，P=0.797 3）與OP的相關性差異無統計學意義。詳見圖2。

2.3" 異質性和敏感性評估

在本研究中，除血清尿酸外，大部分腎臟因素的分析未顯示出顯著的多效性，在MR-Egger方法中顯示出顯著的負截距（β=-9.8×10-5，P=0.000 2），可能存在多效性（圖3）。Cochran Q檢驗結果表明，大部分SNPs之間無顯著的異質性，P值均大于0.05。然而，對于估計的腎小球濾過率、血清尿素和血清尿酸，Cochran Q檢驗結果的P值小于0.000 1，提示存在顯著的異質性（表1）。

大部分暴露因素的SNPs分布相對對稱（圖4），表明這些因素的SNPs選擇在進行孟德爾隨機化分析時受到的潛在影響較小。除慢性腎小球腎炎作為暴露因素篩選出的SNPs不足3個外，其余暴露因素強相關SNPs均有3個以上，故通過“留一法”，即依次排除各個SNP并重新分析，結果顯示排除任何單一SNP后，剩余SNPs的IVW分析結果與納入全部SNPs時的結果保持一致，以排除單一SNP對因果評估產生的過大影響（圖5）。

3 討論

中醫學認為，腎虛是OP發病的核心病機?！端貑枴り庩枒蟠笳撈份d：“腎生骨髓。”《素問·痿論篇》載：“腎主身之骨髓”“腎氣熱則腰脊不舉，骨枯而髓減，發為骨痿。”《素問·脈要精微論篇》曰：“腰者腎之府，轉搖不能，腎將憊矣?！眲⑼晁亍端貑枴げC氣宜保命集》言：“腎為作強之官，得所養，則骨髓之氣，榮而不枯?！崩钪需鳌夺t宗必讀·痿》言：“腎痿者，骨痿也?！边@些醫家的觀點進一步闡釋了腎主骨生髓的理論內涵，認為腎精充盛則骨髓充滿，骨骼強?。环粗I精虧虛則骨失所養而發為骨痿[13]。本研究通過孟德爾隨機化分析，證實了多種腎臟疾病及腎功能指標與OP之間存在因果關系。其中，包括OP的危險因素（膜性腎病、慢性腎小球腎炎和糖尿病腎病）和保護因素（腎小球濾過率），為“腎主骨”理論提供了科學依據。本研究結果與先前的研究相互補充。有研究發現，慢性腎病可通過影響腎臟-甲狀旁腺激素通路、Wnt/β-catenin通路和骨形態發生蛋白通路，導致骨代謝紊亂[14]，從分子機制上證實了中醫“腎主骨”理論的科學性。動物實驗發現，OP小鼠模型可出現類似中醫“腎精虧虛”的癥狀[15]，提示骨病變可影響腎功能，體現了腎病與骨病之間的雙向因果關系。

中醫學提出“腎虛致痰瘀”學說，認為腎虛日久，氣血運行無力，痰濁瘀血內生，阻滯脈絡，骨失濡養，是導致OP的重要機制[16]。因此，補腎活血化瘀被認為是防治OP的重要治則。基礎研究表明，補腎中藥如骨碎補[17]、杜仲[18]等可通過促進成骨細胞增殖分化、抑制破骨細胞活性等機制改善OP大鼠模型的骨密度、骨強度等指標，調節骨代謝平衡。左歸丸等補腎復方也被證實可提高OP大鼠的雌激素水平和抗氧化能力，抑制炎癥反應，改善骨微結構[19]。臨床研究發現，補腎中藥可提高絕經后婦女等OP高危人群的骨密度，緩解疼痛等癥狀，療效優于單純西藥治療[20]。以上研究分別從實驗與臨床的維度為補腎法防治OP的可行性與有效性提供了科學依據，這些發現不僅驗證了中醫“腎主骨”理論的合理性，還可為基于該理論的OP防治策略提供實證支持。

孟德爾隨機化分析在循證醫學等級中與隨機對照試驗相當，當隨機對照臨床研究不可行或違反倫理時，孟德爾隨機化提供了高效、靈活的替代方案[21-22]。本研究通過孟德爾隨機化驗證了中醫“腎主骨”理論，但仍存在局限性。本研究使用的GWAS數據主要來自歐洲人群，可能限制了全球適用性[23]，未來研究可考慮納入更多樣化的種族和地理區域的人群，以提高研究的代表性和普適性。與西醫器官概念不同，中醫“臟腑”是一個包含多個生理功能相關器官的大系統。因此，中醫所指的“腎”具有廣泛的生理功能，涉及生殖、生長發育、消化、內分泌代謝等[24]。“腎虛”也是一個廣泛的概念，包括泌尿、生殖、內分泌、神經、精神、消化等多系統的異常[25]。此外，中醫理論還強調“乙癸同源”，即肝腎同源。而本研究側重于探討腎臟因素，對泌尿、生殖、內分泌、肝臟等功能的影響尚未涉及。

本研究利用孟德爾隨機化方法，從流行病學角度證實了腎臟功能與骨骼健康的因果關系，為中醫“腎主骨”理論提供了科學依據。未來研究可進一步拓展樣本人群，并結合肝腎同源等中醫理論，全面闡釋OP的發病機制，深入探索補腎中藥的作用機制，優化OP的防治策略。中醫理論與現代研究方法的融合，為揭示OP等疾病的本質，推動中醫藥現代化發展帶來了新的契機。

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