基于網絡藥理學及實驗驗證探討補陽還五湯治療脊髓損傷的作用機制

〔摘要〕 目的 運用網絡藥理學及實驗驗證探討補陽還五湯治療脊髓損傷的潛在靶點及機制。方法 通過網絡藥理學相關數據庫篩選補陽還五湯和脊髓損傷相關靶點并進行映射，將共有靶點進行PPI網絡分析、GO和KEGG富集分析。構建大鼠脊髓損傷模型，并將造模成功的24只大鼠隨機分為假手術組、模型組和補陽還五湯組，每組8只探索和驗證補陽還五湯治療脊髓損傷的相關通路和靶點。結果 獲得214個補陽還五湯靶點、2 647個脊髓損傷相關靶點，取交集的58個共有靶點。PPI網絡篩選得到兩個核心子網絡，其中ALB、Akt1、HIF-1α、VEGFA和JUN為關鍵靶點。GO分析得到1 583個條目。KEGG分析表明補陽還五湯治療脊髓損傷與PI3K-Akt、NF-κB、P53等多條通路密切相關。補陽還五湯組Basso-Beattie-Bresnahan（BBB）評分高于模型組（P＜0.01， P＜0.0001）。補陽還五湯上調脊髓損傷后關鍵蛋白HIF-1α、ALB、VEGFA和JUN水平（P＜0.05， P＜0.01）；補陽還五湯下調脊髓損傷后通路蛋白p-PI3K/PI3K、p-Akt1/Akt1、p-NF-κB p65/NF-κB p65、P53水平（P＜0.05）。結論 補陽還五湯能夠抑制脊髓損傷后SD大鼠脊髓損傷節段PI3K-Akt、NF-κB、P53等通路和促進HIF-1α、ALB、VEGFA和JUN等關鍵蛋白表達，從而促進神經功能恢復，發揮治療脊髓損傷的作用。

〔關鍵詞〕 脊髓損傷；補陽還五湯；網絡藥理學；PI3K/Akt通路；NF-κB通路；P53通路

〔中圖分類號〕R285.5" " " " "〔文獻標志碼〕A" " " " " 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.07.017

Mechanism of action of Buyang Huanwu Decoction in treating spinal cord injury based on network pharmacology and experimental verification

YIN Jian1， LI Meili1， LI Liang1， PAN Bo1， JIN Zheng1， CHEN Miaomiao1， ZHAO Junjie1， TANG Xi2*

1. Department of Human Anatomy of School of Medicine， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China; 2. Department of Rehabilitation， Brain hospital of Hunan Province （Hunan Second People's Hospital），

Changsha， Hunan 410015， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To investigate the potential targets and mechanisms of Buyang Huanwu Decoction （BYHWD） in the treatment of spinal cord injury through a combination of network pharmacology and experimental validation. Methods Relevant targets for BYHWD and spinal cord injury were screened through network pharmacology databases and mapped. Common targets were subjected to PPI network analysis and GO and KEGG enrichment analyses. A rat model of spinal cord injury was established， and the successfully modeled rats were randomized into sham-operated， model， and BYHWD groups to explore and validate the relevant pathways and targets of BYHWD in the treatment of spinal cord injury. Results A total of 214 BYHWD targets and 2，647 spinal cord injury-related targets were obtained， with 58 common targets intersected. PPI network analysis identified two core subnetworks， with ALB， Akt1， HIF-1α， VEGFA， and JUN as key targets. GO analysis yielded 1，583 entries. KEGG analysis indicated that the treatment of spinal cord injury with BYHWD was closely associated with multiple pathways， including PI3K-Akt， NF-κB， and P53. The Basso-Beattie-Bresnahan（BBB） score of the BYHWD group was higher than that of the model group（P＜0.01， P＜0.0001）. BYHWD upregulated the levels of key proteins HIF-1α， ALB， VEGFA， and JUN after spinal cord injury （Plt;0.05， Plt;0.01）， and downregulated the levels of pathway proteins p-PI3K/PI3K， p-Akt1/Akt1， p-NF-κB p65/NF-κB p65， and P53 after spinal cord injury （Plt;0.05）. Conclusion BYHWD can inhibit the PI3K-Akt， NF-κB， and P53 pathways and promote the expressions of key proteins such as HIF-1α， ALB， VEGFA， and JUN in the injured segment after SD rat spinal cord injury， thereby promoting the recovery of neural function and exerting a therapeutic effect on spinal cord injury.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 spinal cord injury; Buyang Huanwu Decoction; network pharmacology; PI3K/Akt pathway; NF-κB pathway; P53 pathway

脊髓損傷是一種由脊柱受重創或相關疾病引發的脊髓功能暫時或永久性改變的損傷[1]，具有發病率高、治療費用高、致殘率高、發病年齡低等特征[2]。脊髓損傷包括原發性損傷和繼發性損傷，然而其具體機制尚不明確，但大多數學者認為包括血液循環障礙、生化活性物質改變及能量代謝障礙等多個方面[3]。中醫學也認為，脊髓損傷屬于“體惰”“痿證”等范疇。正如《靈樞·寒熱病》載：“身有所傷，血出多，及中風寒，若有所墮墜，四肢懈惰不收，名曰體惰。”可見脊髓損傷多由外傷所致，督脈受損，導致氣血、經絡、臟腑功能失常而使軀體久而成痿，治療上以補益氣血、活血化瘀、健脾益腎、養血柔肝、補腎填精為原則[4]。隨著中醫藥的發展，中醫藥在脊髓損傷的治療領域得到廣泛研究與應用。其中，《醫林改錯·卷下·癱痿論》中的補陽還五湯具有補氣活血通絡之效，補陽還五湯由黃芪120 g、當歸8 g、赤芍5 g、川芎8 g、地龍3 g、桃仁3 g、紅花3 g組成。黃芪具有祛瘀通脈之功效，為君藥；當歸具有補氣生血、通絡化瘀等功效，為臣藥；赤芍與川芎能發揮活血通絡作用，可改善機體局部血液循環，地龍可助推藥力通達全身，具有祛瘀通絡之功效，紅花、桃仁則具有活血化瘀作用，可加快機體血液流動，為佐使藥[5]。大量補氣藥與少量活血藥相配，氣旺則血行，活血而又不傷正，共奏補氣活血通絡之功。本課題組前期研究已證實，補陽還五湯對脊髓損傷大鼠大腦運動皮質的神經具有保護作用[6-7]。然而其研究范圍相對狹窄，因此，本研究采用網絡藥理學方法，通過構建“補陽還五湯-靶點-脊髓損傷”網絡，初步預測補陽還五湯治療脊髓損傷的作用機制[8]，并結合實驗深入探討和驗證，旨在為補陽還五湯治療脊髓損傷的相關機制進行補充并提供新的理論依據。

1 材料和方法

1.1" 實驗動物

清潔級SD大鼠，雄性24只，周齡6～8周，體質量200～220 g，由湖南中醫藥大學動物實驗中心提供，動物合格證編號：430727221102825654，倫理審批號：SLBH-202210180006。飼養環境：飲食符合清潔級動物的衛生質量要求，環境溫度21～27 ℃，濕度45%～50%，每12 h光暗替換，墊料每2天更換一次，手術后每天進行觀察。

1.2" 主要藥品與儀器

補陽還五湯：黃芪120 g、當歸8 g、赤芍5 g、川芎8 g、地龍3 g、桃仁3 g、紅花3 g，由湖南中醫藥大學第一附屬醫院提供，符合中藥質量標準，水煎至150 mL，相當于含生藥1 g/mL水煎劑；兔抗ALB（批號：16475-1-AP）、HIF-1α（批號：20960-1-AP）、VEGFA（批號：19003-1-AP）、JUN（批號：24909-1-AP）、AKT（批號：10176-2-AP）、GAPDH（批號：10494-1-AP）、山羊抗兔二抗（批號：SA00001-2）均購自美國Proteintech公司；兔抗P53（批號：ab26）、PI3K（批號：ab191606）、NF-κB p65（批號：ab16502）、p-NF-κB p65（批號：ab76302）、p-Akt（批號：ab38449）、p-PI3K（批號：ab278545）均購自英國Abcam公司；ChemiDoc XRS+化學發光成像系統、Mini-PROTEAN Tetra蛋白電泳系統均購自美國Bio-Rad公司。

1.3" 實驗方法

1.3.1" 網絡藥理學研究" 通過TCMSP（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）及中國知網等分別以黃芪、當歸、赤芍、川芎、地龍、桃仁、紅花為關鍵詞檢索補陽還五湯的活性成分，以口服生物利用度≥30%且化合物類藥性≥0.18的標準篩選藥物成分[9]；將PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）檢索到的預測活性成分的3D結構導入pharmMapper（http：//www.lilabecust.cn/pharmmapper/）中，以最大生成構象為300、藥效團模型pKd≥ 6.0的條件進行成分靶點的預測；通過NCBI Gene（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）等獲取脊髓損傷相關靶點，并與補陽還五湯靶點相互映射，獲得共有靶點；通過STRING（https：//STRING-db.org）以“Multiple Proteins”為條件，對共有靶點進行蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction， PPI）網絡構建，建立PPI網絡模型，將該PPI網絡導入Cytoscape構建網絡模型，并使用MCODE軟件進行PPI網絡中的關鍵子網絡分析；通過DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）對共有靶點進行GO功能和KEGG通路富集分析。

1.3.2" 動物分組、造模、給藥及取材" （1）動物分組：將24只大鼠隨機化分組，分為假手術組、模型組和補陽還五湯組，每組8只。（2）動物造模：麻醉后暴露C3-C4之間的脊髓，確認右側脊神經背根，從背根相連處向外橫斷脊髓右外側索，再逐層縫合。動物蘇醒后可見患側前肢屈曲運動不協調表明手術成功[10]。并在術后2 h顯示大鼠脊髓損傷（Basso-Beattie-Bresnahan， BBB）評分為0時表明模型構建成功[11]；假手術組只打開椎板，模型組和補陽還五湯組進行手術造模。（3）動物給藥：術后第1天開始給藥，灌胃，10 mL/kg，1次/d，連續8周，假手術組和模型組給予生理鹽水，補陽還五湯組給予補陽還五湯水煎劑，給藥方式、劑量和補陽還五湯水煎劑制備按照該文獻進行[6-7]。（4）動物取材：大鼠麻醉后，以脊髓損傷處為中心，取長約1 cm的脊髓段，液氮速凍后于-80 ℃冰箱保存。

1.3.3" BBB評分" 造模前和造模后1、7、14、28 d分別進行BBB評分，評分標準按對脊髓損傷大鼠的后肢功能恢復情況進行評價[11]。將動物放入開口盆，輕敲盆壁，使其爬行，觀察動物的臀、膝、踝關節行走、軀干運動及其協調情況。評分者獨立觀察5 min后給出評分，結果取平均值。評分分為22級，21分為正常，0分為完全癱瘓。評分者為兩名對BBB評分熟悉的非本實驗參與人員。

1.3.4" Western blot檢測" 每組取3只-80 ℃冰箱保存的大鼠脊髓段，加入細胞裂解液提取總蛋白；BCA定量法測定蛋白濃度；配制上樣體系；以恒定電壓89 V電泳；以恒定電流290 mA、70 min轉膜；5%脫脂奶粉封閉3 h；TBST洗凈后加入一抗稀釋液配制的相應一抗：ALB（1∶10 000）、HIF-1α（1∶1 000）、VEGFA（1∶1 000）、JUN（1∶3 000）、PI3K（1∶500）、Akt（1∶10 000）、P53（1∶10 000）、NF-κB（1∶1 000）、p-Akt（1∶1 000）、GAPDH（1∶10 000），4 ℃孵育過夜；洗滌后室溫孵育二抗；洗滌后顯影；采用Image-Pro分析蛋白條帶吸光度，并以目標蛋白/GAPDH的吸光度反應該蛋白表達水平。

1.4" 統計學方法

用GraphPad Prism 9.0和SPSS 26.0軟件進行統計學分析。數據以“ｘ±s”表示，兩組間數據分布的正態性和方差齊性分別以Kolmogo-rov-Smirnov和Levene檢驗確定；兩組間均數比較采用t檢驗，多組間均數比較采用單因素方差分析，組間有差異進一步采用SNK-q檢驗進行兩兩比較。以Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1" 網絡藥理學研究

2.1.1" 補陽還五湯-脊髓損傷共有靶點的預測" 通過TCMSP和知網等數據庫，獲得補陽還五湯所含活性成分，并根據成分進行靶點預測，刪除冗雜，得到214個成分相關靶點。通過NCBI Gene等數據庫得到2 647個脊髓損傷相關靶點。并構建韋恩圖預測補陽還五湯-脊髓損傷共有靶點（圖1）。

2.1.2" 補陽還五湯-脊髓損傷共有靶點的網絡構建

采用Cytoscape 3.9.1軟件中的網絡分析功能進行分析，得到補陽還五湯-成分-靶點-脊髓損傷網絡（圖2），該網絡涉及58個靶點節點和36個成分節點。此外，將PPI導入Cytoscape 3.9.1進行可視化（圖3），發現1個關鍵的子網絡，其中，ALB、Akt1、HIF-1α、VEGFA和JUN為補陽還五湯治療脊髓損傷的關鍵靶點。

2.1.3" 補陽還五湯-脊髓損傷共有靶點的GO功能富集分析" 通過對補陽還五湯治療脊髓損傷的作用及機制進行GO功能富集分析，分別涉及對活性氧、對氧化應激和細胞對氧化應激的反應等1 404個生物進程，膜筏、膜微區和小凹等65個細胞組成，DNA結合轉錄因子結合、泛素樣蛋白連接酶結合和轉錄共調節因子結合等69個分子功能，根據Plt;0.05，選出排名前10的條目。詳見圖4。

2.1.4" 補陽還五湯-脊髓損傷共有靶點的KEGG通路富集分析" 補陽還五湯治療脊髓損傷相關靶點的KEGG通路涉及143條，根據Plt;0.05，選出排名前15的通路與靶點。KEGG結果表明，補陽還五湯治療脊髓損傷與PI3K-Akt、HIF-1α、P53、NF-κB等信號通路密切相關。詳見圖5。

2.2" 動物實驗驗證

2.2.1" 補陽還五湯對脊髓損傷大鼠BBB評分評價

與假手術組比較，模型組BBB評分降低（P＜0.000 1）表明脊髓損傷造模成功。采用補陽還五湯干預，并分別于1、7、14、28 d四個時間點進行BBB評分。結果顯示，造模后1 d，模型組與補陽還五湯組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；造模后7、14、28 d，補陽還五湯組BBB評分大于模型組，差異有統計學意義（P＜0.01，P＜0.000 1）。結果表明，補陽還五湯能夠改善脊髓損傷大鼠的雙后肢運動功能。詳見圖6。

2.2.2" 補陽還五湯對脊髓損傷大鼠部位ALB、HIF-1α和VEGFA等關鍵蛋白的影響" 與假手術組相比，模型組HIF-1α、ALB和VEGFA水平升高（P＜0.05），JUN水平顯著降低（P＜0.001）；與模型組相比，補陽還五湯組HIF-1α、ALB、VEGFA和JUN水平升高（P＜0.05，Plt;0.01）。詳見圖7。

2.2.3" 補陽還五湯通過調控PI3K-Akt、NF-κB、P53等通路治療脊髓損傷" 與假手術組相比，模型組p-PI3K/PI3K、p-Akt1/Akt1、p-NF-κB p65/NF-κB p65、P53水平升高（P＜0.05，Plt;0.01）；與模型組相比，補陽還五湯組p-PI3K/PI3K、p-Akt1/Akt1、p-NF-κB p65/NF-κB p65、P53水平降低（P＜0.05）。詳見圖8。

3 討論

全球范圍內脊髓損傷發病率呈逐年上升趨勢[12]，脊髓損傷不僅本身呈現高危險性，還伴隨著嚴重的繼發性損傷，使得患者生活質量低下，目前臨床仍然缺乏行之有效的治療藥物。因此，尋找行之有效的藥物并探索其治療機制至關重要。基于中醫理論和臨床實踐，脊髓損傷的病機可概括為督脈瘀阻，治療上應活血化瘀、疏通督脈[4]。補陽還五湯始載于清代王清任所撰《醫林改錯》，方中重用黃芪補氣通絡，當歸尾、川芎養血行氣不傷本，地龍善于通經活絡，赤芍、桃仁、紅花助當歸尾活血通絡，使氣旺血行以固本、散淤通絡以治標，終得標本兼治[13]。

補陽還五湯治療脊髓損傷具有較好的臨床療效，但其具體作用機制尚未明確。其相關機制研究主要包括改善脊髓組織缺血狀態、抑制炎癥反應、減少神經細胞死亡、改善軸突再生的微環境、抑制膠質瘢痕的形成以及抑制脂質過氧反應[14]。但未有補陽還五湯治療脊髓損傷的系統性研究。基于此，本研究通過構建脊髓損傷大鼠模型發現，假手術組BBB評分無統計學差異，而補陽還五湯組在經過補陽還五湯灌胃治療7、14、28 d后BBB評分均高于模型組，表明補陽還五湯可促進脊髓損傷后大鼠的雙后肢運動功能，然而其相關機制還需進一步探索。因此，在此基礎上，進一步通過網絡藥理學和脊髓損傷大鼠模型探索了補陽還五湯治療脊髓損傷的作用機制。

脊髓損傷的病理過程可分為原發性損傷和繼發性損傷兩個階段，其中原發性損傷是在機械外力的作用下脊髓組織和神經細胞直接損傷和壞死，而繼發性損傷則是在原發性損傷的基礎上進一步出現繼發性脊髓出血、水腫、自由氧損傷和炎癥等事件導致細胞凋亡，進而出現進行性組織損傷[15]。原發性損傷是不可逆轉的，而繼發性損傷是一個動態調節過程，因此，干預這一階段的脊髓損傷的病理過程具有重要意義[16]。本研究PPI網絡發現，補陽還五湯治療脊髓損傷涉及ALB、HIF-1α、VEGFA和JUN等關鍵靶點。已有研究表明，補陽還五湯能促進脊髓損傷后SD大鼠脊髓損傷節段HIF-1α、VEGF表達，改善局部缺血缺氧環境，減輕因脊髓損傷缺血缺氧時對脊髓造成的損傷，從而促進神經功能恢復[3]。因此，本文主要討論ALB與JUN等關鍵靶點。脊髓損傷后機體會出現炎癥反應和細胞凋亡等過程，進而導致血液-脊髓屏障被破壞和神經組織損傷，而ALB作為血液中最豐富的蛋白質之一，具有維持血漿滲透壓、運輸營養物質等多種生理功能，不僅能夠通過抗氧化和抗炎等作用減輕損傷，還能進一步提供營養和神經保護因子[17]。JUN是轉錄因子家族成員之一，對細胞生長分化和炎癥反應等生物學過程密切相關。研究發現，脊髓損傷后損傷部位JUN蛋白表達降低與炎癥反應、細胞凋亡及神經再生受阻等密切相關[18]。本研究顯示，模型組JUN水平低于假手術組，模型組ALB、HIF-1α和VEGFA水平高于假手術組，表明機體為了適應脊髓損傷部位的環境變化以及啟動自我修復功能使其表達增加，通過補陽還五湯干預能進一步促進上述蛋白的表達，從而改善損傷部位缺氧缺血環境，減少繼發性損傷，恢復神經功能。此外，補陽還五湯治療脊髓損傷還與IL-1β、IL-6、MMP-9等其他靶點密切相關，上述研究均表明，補陽還五湯治療脊髓損傷與多靶點相關。目前，補陽還五湯治療脊髓損傷的相關研究主要涉及PI3K/Akt和JAK2/STAT3信號通路[19-20]。本研究通過KEGG通路富集分析發現，補陽還五湯治療脊髓損傷除了涉及PI3K/Akt信號通路外，還與P53和NF-κB等其他信號通路密切相關。補陽還五湯通過調控PI3K-Akt信號通路治療脊髓損傷的相關研究已較為深入，因此，本研究主要探討P53和NF-κB等信號通路。P53信號通路在調控細胞周期、DNA損傷、凋亡等發面發揮關鍵作用。研究發現，脊髓損傷發生后，在炎癥因子的刺激下，損傷部位細胞通過激活P53信號通路誘導細胞凋亡，并且由于脊髓壓力的逐步增加，壓迫時間持續延長，也會進一步刺激P53的表達，誘導細胞發生凋亡[4]。另有研究發現，脊髓損傷大鼠損傷部位總P53和磷酸化P53水平增加，并且P53信號通路的激活與中樞神經系統多種類型的促氧化活性相關，這也會進一步加劇與氧化應激相關的細胞損傷[21]。NF-κB是一種具有多種活化信號的核因子，在組織細胞的炎癥反應、增殖和凋亡等方面發揮關鍵調控作用。脊髓損傷發生后，NF-κB信號通路在損傷部位的膠質細胞和神經元等細胞中呈過度激活狀態，其主要作用是調節損傷后的高度炎癥反應，同時還參與細胞凋亡、瘢痕生成和細胞毒性反應等過程[22]。本研究顯示，模型組p-PI3K/PI3K、p-Akt1/Akt1、p-NF-κB p65/NF-κB p65和P53水平高于假手術組，表明脊髓損傷大鼠損傷部位上述通路均被激活，而補陽還五湯干預后，補陽還五湯組PI3K-Akt、NF-κB和P53水平顯著降低，表明補陽還五湯主要通過抑制PI3K/Akt、NF-κB、P53等信號通路治療脊髓損傷。此外，KEGG通路分析表明，補陽還五湯治療脊髓損傷還與NOD樣受體信號通路和MAPK信號通路密切相關。NOD樣受體信號通路與炎癥及細胞焦亡密切相關，并且李亞峰等[23]研究表明，補陽還五湯聯合脊髓減壓治療急性脊髓損傷效果明顯，作用機制可能是通過抑制NLRP1/Caspase-1通路以減少細胞焦亡。然而，補陽還五湯通過抑制細胞焦亡治療脊髓損傷的研究極少，并且脊髓損傷、細胞焦亡和炎癥三者密切相連。因此，深入探索補陽還五湯、細胞焦亡與脊髓損傷的關系具有重要的意義。MAPK信號通路與增殖、炎癥和抑制凋亡密切相關。邵楊等[24]研究發現，甘草苷可通過抑制MAPK通路抑制炎癥和神經元凋亡，減輕小鼠脊髓損傷。綜上，目前關于補陽還五湯治療脊髓損傷的相關靶點和通路研究依舊較少，且研究主要集中于特定的靶點與通路，基于上述網絡藥理學結果，后續的研究可深度探索其他的靶點和通路，進而完善補陽還五湯治療脊髓損傷的研究。

補陽還五湯的臨床應用廣泛，但用藥不應局限于藥方本身，而應該依據病人的實際情況進行加減方[25]以及與其他治療方法聯用，使其具有更佳的治療效果。已有研究表明，補陽還五湯加麝香后治療效果顯著提高[26]。此外，補陽還五湯還可聯合針灸和骨髓間質干細胞移植等治療脊髓損傷[27-28]。不僅如此，為了方便臨床使用，也應在保證補陽還五湯療效的基礎上對其劑型進行創新，并利用網絡平衡常數拓撲學、定量譜學和超分子印跡技術等理論和技術創制出作用機制清楚、制劑工藝可行、量-時-效關系明確、毒與效整合的補陽還五湯處方[29]。

本研究通過網絡藥理學及實驗表明，補陽還五湯能夠改善脊髓損傷大鼠的雙后肢運動功能并促進脊髓損傷部位的修復，其機制可能與上調HIF-1α、ALB、VEGFA和JUN等關鍵蛋白的表達、抑制PI3K/Akt、NF-κB、P53等信號通路有關。本研究為補陽還五湯治療脊髓損傷的機制研究奠定了基礎，并為補陽還五湯的臨床應用提供理論依據。

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