赤鳳迎源針刺法對面神經損傷模型大鼠Ras/MEK/ERK信號通路的影響

〔摘要〕 目的 探討赤鳳迎源針刺法對面神經超微結構、絲裂原活化的細胞外信號調節激酶（mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase， MEK）、細胞外信號調節蛋白激酶（extracellular signal-regulated kinase， ERK）及血清KRas蛋白表達的影響。方法 將SD大鼠隨機分為空白對照組、模型組、常規針刺組、赤鳳迎源針刺組，每組8只。除空白對照組大鼠正常飼養外，其他各組大鼠用面神經頰支壓榨法誘導面神經損傷模型。造模成功后，予以干預2周。干預結束后，行電鏡檢查觀察大鼠的面神經超微結構；通過HE染色觀察面神經組織形態組織學變化；ELISA法檢測血清KRas的表達水平；Western blot檢測面神經組織MEK、ERK蛋白的表達水平。結果 造模后，與空白對照組比較，另外3組大鼠動物行為學評分均明顯升高（P＜0.01）。針刺2周后，常規針刺組及赤鳳迎源針刺組大鼠評分明顯低于模型組（P＜0.01），且赤鳳迎源針刺組評分低于常規針刺組（P＜0.01）。針刺2周后，與模型組對比，常規針刺組及赤鳳迎源針刺組面神經軸突纖維排列較緊密，內質網較多，KRas蛋白表達明顯升高（P＜0.05），面神經MEK蛋白、ERK蛋白表達升高（P＜0.05），且赤鳳迎源針刺組均高于常規針刺組（P＜0.05）。結論 赤鳳迎源針刺法可改善面神經損傷模型大鼠動物行為學，上調KRas、MEK及ERK表達水平，可能與激活Ras/MEK/ERK信號通路有關，從而修復面神經損傷。

〔關鍵詞〕 面神經損傷；赤鳳迎源；大鼠；KRas蛋白；MEK蛋白；ERK蛋白

〔中圖分類號〕R245" " " " "〔文獻標志碼〕A" " " " " 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674－070X.２０24.07.019

Effects of Chifeng Yingyuan acupuncture method on Ras/MEK/ERK signaling pathway in a rat model of facial nerve injury

WU Jihuang1， QI Hongmei2， CHEN Hui2， WANG Zhiming2， ZHANG Wei1， GUO Jianjun2*

1. Hunan University of Chinese Medicine， Changsha， Hunan 410208， China;

2. Hunan Provincial Hospital of Integrated Chinese and Western Medicine， Changsha， Hunan 410006， China

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Objective To investigate the effects of the Chifeng Yingyuan acupuncture method on the ultra microstructure of facial nerves， mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase （MEK）， extracellular signal-regulated kinase （ERK）， and serum KRas protein expressions. Methods SD rats were randomized into blank control， model， conventional acupuncture， and Chifeng Yingyuan acupuncture groups， with eight rats in each group. Except for the rats in the blank control group， which were raised normally， other groups of rats were induced with facial nerve injury models using the facial nerve buccal branch pressing method. After successful modeling， intervention was given for two weeks. After intervention， electron microscopy was performed to observe the ultra microstructure of the facial nerve in rats; HE staining was employed to observe the morphological and histological changes of facial nerve tissues; ELISA was used to determine the expression level of serum KRas; Western blot was applied to examine the expression levels of MEK and ERK proteins in facial nerve tissues. Results After modeling， compared with the blank control group， the behavioral scores of the other three groups of rats significantly increased （Plt;0.01）. After two weeks of acupuncture treatment， the scores of rats in the conventional acupuncture and the Chifeng Yingyuan acupuncture groups were significantly lower than those in the model group （Plt;0.01）， and the scores in the Chifeng Yingyuan acupuncture group were lower than those in the conventional acupuncture group （Plt;0.01）. After two weeks of acupuncture treatment， compared with the model group， the conventional acupuncture and the Chifeng Yingyuan acupuncture groups had a tighter arrangement of facial nerve axon fibers， more endoplasmic reticulum， and a significant increase in KRas protein expression （Plt;0.05）. The expression of facial nerve MEK protein and ERK protein increased （Plt;0.05）， and the expression levels of these three proteins （KRas， MEK， and ERK） in the Chifeng Yingyuan acupuncture group were higher than in the conventional acupuncture group （Plt;0.05）. Conclusion The Chifeng Yingyuan acupuncture method can improve the behavioral outcomes of the rat model of facial nerve injury and upregulate the expression levels of KRas， MEK， and ERK， which may be related to the activation of the Ras/MEK/ERK signaling pathway， thereby repairing facial nerve injury.

〔Ｋｅｙｗｏｒｄｓ〕 facial nerve injury; Chifeng Yingyuan; rats; KRas protein; mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase protein; extracellular signal-regulated kinase protein

面神經損傷，亦稱周圍性面癱，是指創傷、非特異性炎癥、病毒感染、腫瘤、自身免疫疾病等各種原因損傷面神經，導致面神經功能障礙。其臨床表現主要有抬眉困難、眼瞼閉合不全、鼻唇溝變淺、口角歪斜等癥狀，當其損傷面神經顱內段時，可以合并出現味覺減退、腺體分泌障礙等癥狀[1]。據流行病學調查，面神經損傷在中國的發病率高達4.25%[2]。隨著現代生活節奏加快，人們生活工作壓力增大、勞逸失調、飲食結構不合理、體質逐漸下降，其發病率還在繼續增長[3]。目前，西醫治療本病尚無特效療法，主要是激素、營養神經、抗病毒及手術治療，以消除水腫、改善面部血運、降低面神經內壓[4]。面神經損傷后的修復仍舊是困擾醫學界的一大難題。面神經損傷后，局部微環境改變，面神經元細胞胞質濃縮，形成凋亡小體，神經元細胞開始凋亡，軸突數目減少[5]。面神經損傷后修復主要與神經元胞體的存活數目和軸突再生速度有關[6]。因此，增加神經元胞體存活率，加快軸突重生速度是促進損傷面神經恢復的關鍵。

赤鳳迎源針刺法，為古代針法飛經走氣四法之一，是臨床中常用的催氣行氣的針刺手法。赤鳳迎源針刺法為“復式”操作手法，其將三才理論與提插捻轉、飛法等手法相結合，因其行氣、調氣的效果而被歷代醫家所推崇。赤鳳迎源針刺法選穴以具有行氣、通絡作用的穴位為主，適用于治療痿證、氣滯類證、痹病等病證。但是其相關生物學機制研究尚不清楚，故而需要對其進行相關研究，為面神經損傷后修復提供理論支持。本研究通過觀察MAPK信號通路中KRas、MEK、ERK蛋白的表達及面神經超微結構形態變化，探討赤鳳迎源針刺法治療周圍性面癱的可能機制，現報道如下。

1 實驗材料

1.1" 實驗動物

選取成年雄性SD大鼠32只，體質量（250±20） g，來自湖南斯萊克景達動物實驗公司。大鼠自由攝食與飲水，飼養溫度24～26 ℃，相對濕度50%～70%，適應性喂養1周。本研究實驗動物及條件符合國家科學技術委員會的《實驗動物管理條例》相關規定，由湖南省中醫藥研究院動物實驗倫理審查委員會批準（審批號：SY2022-0028）。

1.2" 主要試劑

GTP酶KRas ELISA試劑盒（伊愛博科技股份有限公司，批號：3C318U）；廣譜彩虹預染蛋白Marker（10～180 kDa）、三（羥甲基）氨基甲烷（Hydroxymethy aminomethane，Tris-HCl）緩沖液（1.5 mol/L，pH 8.8）、Tris-HCl緩沖液（1 mol/L，pH 6.8）、還原性蛋白上樣緩沖液（5×）、10%過硫酸銨（ammonium persulphate solution， APS）溶液、10%十二烷基磺酸鈉（sodium？鄄 dodecyl sulfate， SDS）溶液、四甲基乙二胺（tetra methyl ethylene diamine， TEMED）（1×，pH 7.5）、丙烯酰胺：亞甲基雙丙烯酰胺溶液（Acrylamide-Bisacrylamide，Acr-Bis）（30%，29∶1）、Tris-甘氨酸電泳緩沖液（1×）、Western轉膜緩沖液（10×）、麗春紅S染色液（10×）、脫脂奶粉、RIPA裂解液（強）、蛋白酶抑制劑混合液（100×PIC）、磷酸酶抑制劑（10×）、ECL Plus超敏發光液、鋨酸、戊二醛（艾碧維生物科技有限公司，批號：AWB0236、AWB0055、AWB0073、AWB0074、AWB0093、AWT0047、AWB0068、AWI0130、AWB0020、AWB0083、AWB0211、AWB0225、AWB0004、AWB？鄄0136、AWH0645、AWH0650、AWB0005、AWI0136、AWI0097）；顯影液、定影液（中國上海佳信照相用品有限公司，批號：BW-61、BW-62）；環氧丙烷（上海邁瑞爾化學公司，批號：M25514）；磷酸鹽緩沖液PBS（北京中杉金橋生物技術有限公司，批號：ZLI-9062）；Eponate 12包埋樹脂、DDSA、NMA、DMP30（美國Ted Pella Inc公司，批號：18005、18022、18032、18042）；醋酸雙氧鈾（中鏡科儀生物技術有限公司，批號：GZ02625）。

1.3" 主要儀器

臺式高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司，型號：H1650R）；全自動酶標洗板機、多功能酶標分析儀（深圳市匯松科技發展有限公司，型號：PW-812、MB-530）；電熱恒溫培養箱（北京市永光明醫療儀器有限公司，型號：DHP-500）；搖床（江蘇其林貝爾儀器制造有限公司，型號：TS-1）；電泳儀、電泳槽、轉膜儀（北京六一生物科技有限公司，型號：DYY-6C、DYCZ-24DN、DYCZ-40D）；旋渦混合器（江蘇其林貝爾儀器制造有限公司，型號：GL-88B）；磁力攪拌器、精密PH計（上海儀電科學儀器股份有限公司，型號：JB-13、PHS-3C）；電子天平（美國雙杰公司，型號：JJ224BC）；生物樣品均質儀（中國杭州奧盛儀器有限公司，型號：BioPrep-24）；化學發光成像系統（上海勤翔科學儀器有限公司，型號：ChemiScope6100）；萊卡切片刀（常州市飛勒斯儀器有限公司，型號：M199）；切片機（浙江金華益迪試驗器材，型號：YD-315）；包埋機（常州中威電子儀器有限公司，型號：BMJ-A）；Motic顯微鏡（合肥南達科學儀器有限公司，型號：BA210T）；透射電子顯微鏡（上海百賀儀器有限公司，型號：JEM1400）；EMSIS數碼相機（天津瑞利光電有限公司，型號：GMBHmorada G3）。

2 實驗方法

2.1" 實驗動物分組

SD大鼠32只隨機分為空白對照組、模型組、常規針刺組、赤鳳迎源針刺組，每組8只。

2.2" 造模及造模成功評判

空白對照組不做任何處理。模型組、常規針刺組、赤鳳迎源針刺組動物均制作右側面神經頰支壓榨性損傷的病理模型[7]，詳見圖1。大鼠稱質量后，采用腹腔注射3%（0.2 mL/100 g）戊巴比妥鈉溶液麻醉，等待大鼠角膜反射消失后，將大鼠側臥位于手術臺上，進行常規備皮、局部消毒，在右側耳屏前與嘴角連線、瞳孔正下方約1 cm位置，做一長約2 cm“弧形”切口，用止血鉗鈍性分離，暴露長1.0～2.0 cm面神經頰支，以止血鉗夾持，長度約1 cm，持續30 s，松開30 s，再夾持30 s，用長約1 cm縫合線綁在面神經壓榨部分作為標記，縫合皮下及皮膚層，3%碘酒傷口消毒后用青霉素軟膏涂抹傷口，待麻醉清醒后放回原來的籠子飼養。術后禁食禁水4 h，術后3 d內將注射用青霉素鈉放入食用水中。

造模后第2天，參照費靜等[8]方法通過觀察造模大鼠動物行為學評估面神經功能，主要觀察大鼠瞬目反射、觸須運動、鼻尖位置，判斷其造模是否成功。（1）瞬目反射。用5 mL注射器的針頭對著大鼠眼睛吹氣，引起大鼠眨眼反射，對比兩側眨眼反射，隨后按照0～2的等級予以評分：若兩側無差距為0分；若與健側相比，眨眼反射延遲為1分；若眨眼反射完全消失為2分。（2）觸須運動。觀察大鼠觸須運動30 s，隨后按照0～2的等級予以評分：若兩側無差距為0分；若與健側相比，觸須運動減弱為1分；若觸須運動完全消失為2分。（3）鼻尖位置。觀察大鼠鼻尖位置，隨后按照0～1的等級予以評分：若鼻尖居中為0分；若鼻尖偏向健側為1分。若總得分超過3分，認為存在面神經損傷，則造模成功。

2.3" 干預方法

選用治療面癱常用的“地倉”“合谷”“頰車”“翳風”四穴，參照《實驗針灸學》《基礎醫學實驗動物操作基本技能》結合動物比較學方法定位[9]。地倉：口角旁開，瞳孔直下；翳風：耳垂后方，乳突與下頜角之間凹陷中；合谷：前肢第1與第2掌骨之間；頰車：下頜角前上方約1 mm。

2.3.1nbsp; 常規針刺組" 將大鼠固定于自制鼠板上，按上述方法定位，常規消毒后，使用一次性無菌針灸針（貴州安迪藥械有限公司，規格25 mm×0.30 mm）對右側翳風、頰車、地倉、合谷行針刺。其中，地倉向頰車方向透刺約5 mm，翳風直刺約3 mm，合谷直刺約3 mm。留針30 min后取針，隔日1次，總共治療7次。

2.3.2" 赤鳳迎源針刺組" 將大鼠固定于自制鼠板上，按上述方法定位，常規消毒后，使用一次性無菌針灸針（貴州安迪藥械有限公司，規格25 mm×0.30 mm）對翳風、頰車、地倉、合谷行赤鳳迎源針刺法，翳風、合谷直刺進針，地倉向頰車方向進針。先將毫針刺入深層約5 mm，待針下緊滯，上提至淺層（皮下），自覺緊滯感，再將其插入中層約2.5 mm，用捻轉手法及飛法，一捻一放，持續1 min。每10 min行針1次，留針30 min后取針，隔日1次，總共治療7次。

2.3.3" 其他組" 空白對照組不做任何處理；模型組只單獨固定大鼠于自制鼠板30 min，不行針刺治療，待其自愈。

2.4" 觀察指標

針刺治療結束后第2天，各組大鼠再次評價動物行為學。完成之后進行腹腔注射1%戊巴比妥鈉溶液過量麻醉處死大鼠后，分離腹主動脈采血，用肝素抗凝管采血，用以檢測血清KRas；消毒備皮，切開大鼠右側面頰部皮膚，暴露出大鼠面神經頰支，迅速切取面神經組織，分出一部分放入2.5%戊二醛中預固定，用于后期作透射電鏡檢測，其余部分立即放入液氮中冷凍儲存，用于Western blot檢測。

2.4.1" 評估大鼠動物行為學" 評分標準同上文造模后評分標準。若總得分超過3分，認為存在面神經損傷；若總分低于3分，認為恢復；總分為0分，認為恢復完全[8]。

2.4.2" 觀察大鼠面神經纖維的超微結構" 將面神經纖維組織固定到2.5%戊二醛6～12 h，然后將固定液棄掉，組織放入PBS緩沖液中1～6 h，再加入1%鋨酸后固定1～2 h；脫水后予以環氧丙烷與環氧樹脂1∶1浸泡1～2 h，然后使用純環氧樹脂浸泡2～3 h浸透，再包埋切片，予以鉛、鈾染色，用透射電子顯微鏡觀察，用數碼相機記錄圖像。

2.4.3" HE染色觀察大鼠面神經形態變化" 先將面神經切片置于二甲苯中20 min，重復3次，然后按順序在100%、95%、85%、75%乙醇中每級放置5 min。再用蒸餾水浸洗5 min；蘇木素染1～10 min，蒸餾水沖洗，PBS返藍；伊紅染1～5 min，蒸餾水沖洗；予以梯度乙醇（95%～100%）脫水，每級5 min。取出后置于二甲苯10 min，重復2次，再用中性樹膠封片、顯微鏡觀察。

2.4.4" ELISA法檢測血清KRas含量" 分離腹主動脈，用肝素抗凝管采血。將室溫血液自然凝固10～20 min，3 000 r/min、半徑130 mm離心20 min，取上清液進行檢測，然后依據試劑盒步驟檢測血清KRas的表達量。

2.4.5" Western" blot檢測MEK、ERK表達" 剪取0.025 g面神經纖維組織，用冰預冷PBS洗組織，配制10％分離膠及4.8％的濃縮膠，取200 μL蛋白上清進行凝膠電泳，然后將其轉移至NC膜，用5%脫脂奶粉，加NC膜進一步封閉，將一抗按比例稀釋后，將NC膜與一抗一起孵育，4 ℃過夜，次日室溫放置30 min，結束后予以PBST洗3次，每次15 min。用1×PBST稀釋HRP標記的二抗山羊抗鼠二抗（1∶5 000）、山羊抗兔二抗（1∶5 000）孵育90 min，然后用TBST洗3次，每次15 min，使用ECL Plus超敏發光液與膜孵育1 min，用濾紙吸盡液體，用塑封膜將膜包裹雜交膜，凝膠成像系統成像。

2.5" 統計學分析

采用SPSS 25.0統計學軟件進行處理。計量資料用“ｘ±s”表示，若數據符合正態分布和方差齊性，多組間比較采用單因素方差分析；若數據不符合正態分布和方差齊性，應用Kruskal-Wallis H檢驗。均以P＜0.05為差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1" 各組大鼠動物行為學評分

造模后，與空白對照組比較，另外3組大鼠行為學評分均明顯升高（P＜0.01），表明造模成功。針刺2周后，常規針刺組及赤鳳迎源針刺組大鼠評分明顯低于模型組（P＜0.01），且赤鳳迎源針刺組評分低于常規針刺組（P＜0.01）。詳見表1。

3.2" 各組大鼠面神經纖維的超微結構

空白對照組軸突纖維（髓鞘）排列緊密，內質網較多；模型組軸突纖維（髓鞘）排列疏松，內質網較少，表明面神經損傷；赤鳳迎源針刺組軸突纖維（髓鞘）排列較緊密，內質網較多；常規針刺組軸突纖維（髓鞘）排列及內質網數量介于模型組與赤鳳迎源針刺組之間。詳見圖2。

3.3" 各組大鼠面神經形態變化情況

空白對照組神經組織各層結構清晰，排列緊密，染色均勻；模型組神經組織細胞胞體腫大，胞質出現空泡變性，結構排列不規則；赤鳳迎源針刺組神經組織排列較緊密，染色較均勻；常規針刺組排列秩序介于模型組與赤鳳迎源針刺組之間。詳見圖3。

3.4" 各組大鼠血清KRas蛋白表達情況

與模型組相比，常規針刺組、赤鳳迎源針刺組大鼠血清KRas蛋白表達明顯升高（P＜0.05）；與常規針刺組比較，赤鳳迎源針刺組大鼠血清KRas蛋白表達升高（P＜0.05）。詳見表2。

3.5" 各組大鼠面神經MEK、ERK蛋白表達情況

與模型組相比，常規針刺組、赤鳳迎源針刺組大鼠面神經MEK、ERK蛋白表達升高（P＜0.05）；與常規針刺組比較，赤鳳迎源針刺組大鼠面神經MEK、ERK表達升高（P＜0.05）。詳見圖4、表3。

4 討論

4.1" 中醫學對面神經損傷的認識

面神經損傷根據其“口眼斜”等癥狀，符合中醫學“面癱”“吊線風”“口僻”等范疇。關于其記載最早見于《靈樞·經筋》：“足之陽明，手之太陽，筋急則口目皆僻。”關于本病病因病機，歷代醫家對其多有論述，認為本病位在頭面部，因邪氣侵襲面部經絡，致氣血痹阻、運行不暢、經絡不通、經筋功能失調而引起。《靈樞·經筋》載“頰筋有寒，則急引頰移口；有熱，則筋弛縱緩不勝收，故僻”，指出周圍性面癱因邪氣侵襲導致經脈凝滯、氣血不通、經筋不用，故而發為口角歪斜。喻嘉言《醫門法律·中風門》亦云“口眼喎斜，面部之氣不順也”，認為氣機不暢、經筋失用是導致口眼斜的關鍵。總之，中醫學認為本病病位在頭面部，因風寒、風熱或風痰等邪氣侵襲面部經絡，致經絡不通、經筋功能失調而引起[10-12]。

4.2" 選穴依據

依據循證針灸學原理，對針灸治療本病的古今文獻整理，總結出常用腧穴為地倉、頰車、合谷、翳風、太陽等穴位[13-14]。吳敬欣[15]通過數據挖掘分析針刺治療周圍性面癱的穴位，梳理出使用頻次超過100次的腧穴前三位為地倉、頰車、合谷。本研究結合周圍性面癱病因病機，循證針灸學原理、赤鳳迎源針刺法及數據挖掘規律，故而采用合谷、地倉、頰車、翳風四穴治療周圍性面癱。

合谷為手陽明經大穴，為經脈氣血匯聚之所，具有良好的調氣行血功能。從穴位局部解剖中可以看出，穴位下具有豐富的肌肉、血管、神經，具有良好地改善微循環的作用。“面口合谷收”是合谷穴生理功能的高度概括，其一直指導臨床實踐[16-17]。地倉和頰車都是足陽明胃經腧穴，且都分布在面部，在《扁鵲神應針灸玉龍經·一百二十穴玉龍歌·口眼斜篇》中記載到“中風口眼致斜，須療地倉連頰車”。翳風位于耳垂后方，耳后乳突與下頜角之間的凹陷處。從穴位解剖看其深部正對面神經干出莖乳孔處，因解剖結構的復雜性及其特殊的位置性為面癱治療的常用穴[18]。

綜上所述，周圍性面癱為經絡不通、經筋失用所致，病位在面部，與少陽、陽明相關。故近部取穴取地倉、頰車、翳風，直達病所，疏調陽明、少陽經筋，循經遠端取穴取合谷，取“面口合谷收”之意。

4.3" 赤鳳迎源針刺法的選擇及其對大鼠動物行為學評分影響

飛經走氣四法包括青龍擺尾、白虎搖頭、蒼龜探穴、赤鳳迎源。“赤鳳迎源”首見于《針灸大成·金針賦》：“赤鳳迎源，展翅之儀，入針到地，提到天，候針處搖籃，復進其元（指人部、中層），上下左右，四圍飛旋。”赤鳳迎源針刺法為“復式”操作手法，其將三才理論與提插捻轉、飛法等手法相結合，因其行氣、調氣的效果而被歷代醫家所推崇。面神經損傷病機為邪氣侵襲面部經絡，經絡不通，導致經筋功能失調。適用手法有蒼龜探穴及赤鳳迎源手法，但臨床上有“鳳補龜瀉”之談。現代研究發現，赤鳳迎源針刺法可以通過疏通經絡之氣，行氣活血通絡，加強面部經筋氣血灌注，從而改善局部微循環，促進周圍性面癱恢復[19-20]。綜上所述，選擇赤鳳迎源針刺法作為面神經損傷的干預手段。

本實驗通過對大鼠動物行為學觀察，發現模型組、常規針刺組、赤鳳迎源針刺組大鼠評分較之前均有改善，模型組評分較造模后改善，其原因可能與面神經損傷后自身有一定修復能力有關；與模型組大鼠相比，赤鳳迎源針刺組和常規針刺組評分較低（P＜0.05）；且赤鳳迎源針刺組低于常規針刺組（P＜0.05）。上述結果說明，常規針刺法和赤鳳迎源針刺法均可以改善大鼠行為學評分，且赤鳳迎源針刺法療效優于常規針刺法。

4.4" 赤鳳迎源針刺法對面神經損傷模型面神經超微結構的影響

施旺細胞具有營養神經元的功能，其參與神經損傷后修復及再生[21]。神經損傷后，施旺細胞可髓鞘化并且為軸突的生長延長提供微環境，是神經再生修復的關鍵細胞[22]。有研究發現，周圍神經損傷后施旺細胞增殖并遷移到損傷部位，成為修復細胞，增殖的施旺細胞在基膜所圍成的神經膜管內有序地排成一條實心的細胞索，稱Bungner帶，為軸突的再生提供生長通道[23-24]。施旺細胞具有高度可塑性，可以與巨噬細胞共同清理損傷后的細胞碎片[25]，并且可以通過分泌大量的神經再生所需的生長因子，從而為軸索損傷后再生提供微環境[26]。HU等[27]發現，重復電刺激使外周血干細胞、骨髓間充質干細胞增殖并誘導其向施旺細胞分化，具體機制可能為調控Ras/MEK/ERK信息通路，從而促進施旺細胞的可塑性和髓鞘再生。

本實驗通過電鏡觀察大鼠面神經超微結構發現：空白對照組大鼠面神經超微結構并未出現明顯病理改變；模型組大鼠其神經纖維髓鞘排列疏松，施旺細胞細胞器減少，線粒體腫脹；赤鳳迎源針刺組大鼠其神經纖維髓鞘排列緊密，脫髓鞘較輕，施旺細胞細胞器改變不明顯；常規針刺組改變介于模型組和赤鳳迎源針刺組之間。因此推測，赤鳳迎源針刺法可以促進面神經功能恢復，從而改善面神經損傷，治療周圍性面癱。

4.5" 赤鳳迎源對面神經損傷模型Ras/MEK/ERK信號通路的影響

Ras/MEK/ERK信號通路是參與細胞增長、生殖、分化及凋亡等的一條經典信號通路。Ras/MEK/ERK信號通路中除了含有Ras和ERK蛋白外，Ras和ERK之間還存在著2個蛋白激酶，即Raf、MEK，以此形成一條完整的Ras/MEK/ERK信號通路[28-29]。

該通路可以被激素、生長因子等各種刺激因素所激活，各種刺激因素作為激活信號通路的配體，與細胞膜上受體結合，從而激活細胞內第二信使Ras、Raf、MEK、ERK等[30]，通過一系列的級聯反應最后激活效應分子，調控細胞生長、增殖、分化及凋亡等程序。Ras/MEK/ERK信號通路中各級信號分子及效應分子的表達，在調節該信號通路的活性中都發揮著至關重要的作用[31]。

Ras蛋白為信號傳遞蛋白，是信號通路的上游信號分子。Ras一般情況下處于失活狀態，當細胞受到外界刺激，配體與受體結合，隨之產生一系列反應，Ras則由原來的失活狀態轉換為激活狀態[32]。活化后的Ras能夠進一步磷酸化Raf并使其激活，Raf被激活后，和MEK相結合，磷酸化MEK激活MEKs[33-34]。MEKs是MAPKK家族的重要成員，MEK可磷酸化下游靶蛋白ERK，使ERK成為活性形式，活化的ERK可留在細胞質激活其他蛋白激酶，也可進入細胞核磷酸化一些轉錄因子，調控基因表達，最終參與細胞功能調節[35]。總而言之，Ras/MEK/ERK信號通路能促進神經元生長、分化，抗神經細胞凋亡，加速神經損傷的修復[36]。

本實驗結果顯示，在面神經損傷模型大鼠經治療后，與模型組相比，常規針刺組、赤鳳迎源針刺組KRas、MEK、ERK的蛋白表達均升高（P＜0.05），且赤鳳迎源針刺組高于常規針刺組（P＜0.05）。由此可知，赤鳳迎源針刺法可以上調KRas、MEK、ERK蛋白表達，從而促進神經修復再生，其修復的機制可能與Ras/MEK/ERK信號通路有關。

4.6" 結語

赤鳳迎源針刺法具有行絡通經、通關過節、疏調經筋等作用，導引經氣、氣至病所等特點優勢，對面神經損傷的治療療效較常規針刺顯著，值得臨床推廣。但赤鳳迎源針刺法操作較為煩瑣，較難掌握其要領，故應加強此針刺方法的學習，以便于赤鳳迎源針刺法的推廣。對于赤鳳迎源針刺法治療面神經損傷的生物學機制，目前研究并不深入，今后需進一步對其作用機制研究，以便于赤鳳迎源針刺法在臨床運用范圍的擴大。本實驗通過研究Ras/MEK/ERK信號通路，證明赤鳳迎源針刺法與信號通路之間的相關性，但該通路涉及多個蛋白，因實驗條件、技術等各種因素限制，故而對其通路的蛋白研究不夠全面，需要進一步研究證明。

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